糖尿病共病抑郁患者尿液揮發(fā)性有機(jī)化合物分析

郭芷君，丁緒銀，李竺蔓，馬云鵬，王 燕，于雪梅，張 閩，徐 峰 （. 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院, 上海0400；. 華東師范大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院, 上海 004）

糖尿病是臨床常見的慢性疾病[1-5]。臨床中，約30%糖尿病患者共病抑郁，其中10%患者將進(jìn)展為中重度抑郁[6-8]，加重患者身心負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響其治療及預(yù)后。目前臨床主要通過漢密頓抑郁(HAMD)量表、ICD-10 診斷標(biāo)準(zhǔn)和臨床表現(xiàn)診斷抑郁。然而，僅通過量表和臨床觀察，不能及早發(fā)現(xiàn)抑郁并給予干預(yù)[9]。近年來，揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOCs)作為研究熱點(diǎn)，在多種疾病中均存在特征信號(hào)[10-13]。揮發(fā)性有機(jī)化合物是一組小分子代謝物,通過氣相的形式在呼吸、汗液、血液、尿液和糞便中釋放和被檢測(cè)到,并且攜帶著人體生理和代謝狀態(tài)的有用信息,其作為人體"氣味指紋"常用于評(píng)估健康狀況,以及疾病的篩查、診斷和治療。普通意義上的VOCs 主要是一類熔點(diǎn)低于室溫而沸點(diǎn)在50～260 ℃之間的揮發(fā)性有機(jī)化合物，如烴類、鹵代烴、氧烴和氮烴，它包括：苯系物、有機(jī)氯化物、氟里昂系列、有機(jī)酮、胺、醇、醚、酯和酸等。尿中VOCs 主要有2-氧丙醛、2,5,8-三甲基丙酮-1,2,3,4-四氫萘-1-醇、苯酚、癸醛、壬醛、1,6-二氧雜環(huán)十二烷-7,12-二酮、1- 溴-1-(3-甲基-1-戊烯基)-2,2,3,3-四甲基環(huán)丙烷、異長(zhǎng)葉烯-5-醇、3-乙基-3-甲基庚烷、正十四烷、苯胺、2,5-環(huán)己二烯-1,4-二酮、苯乙烯、4-庚酮、二甲基硅烷二醇、己酸、2-庚酮、辛醇、環(huán)己酮等多種有機(jī)物。但目前為止，VOCs在糖尿病共病抑郁方面的相關(guān)研究尚未開展。本文以2 型糖尿病患者為研究樣本，利用微型氣體測(cè)試裝置檢測(cè)分析患者尿液VOCs，旨在探討糖尿病共病抑郁患者尿液VOCs 是否存在特征信號(hào)，以期及早篩查發(fā)現(xiàn)能早期預(yù)測(cè)抑郁的有效分子標(biāo)志物，為對(duì)糖尿病患者進(jìn)行治療干預(yù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 患者納入

選擇2019 年11 月?2020 年11 月在上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院住院治療，并符合防治指南診斷標(biāo)準(zhǔn)的2 型糖尿病患者，年齡25～75 歲，無意識(shí)障礙，住院前及住院期間未接受任何抗抑郁藥物治療。

1.2 倫理審查與知情同意

納入本研究的患者均簽署知情同意書，并由醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.3 資料收集

利用醫(yī)院病歷系統(tǒng)收集患者的年齡、性別、體重指數(shù)(BMI)、空腹血糖、糖化血紅蛋白、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)等基線資料。

1.4 抑郁篩查

患者住院期間，利用病人健康量表-9(Patient Health Questionnaire-9, PHQ9)對(duì)納入研究的糖尿病患者進(jìn)行抑郁癥篩查。PHQ9 量表是一個(gè)國(guó)際上通用的簡(jiǎn)便、有效的抑郁癥障礙自評(píng)量表，內(nèi)容如表1 所示。

表1 PHQ9 抑郁癥篩查量表

對(duì)納入研究的患者，采用PHQ9 量表內(nèi)容對(duì)患者近兩周生活情況進(jìn)行提問，根據(jù)每項(xiàng)癥狀出現(xiàn)的頻率與程度換算為對(duì)應(yīng)的抑郁評(píng)分，其中0～4 分表示沒有抑郁，5～9 分提示可能患者存在輕微抑郁癥，10～14 分提示可能有中度抑郁癥，15～19 分提示可能有中重度抑郁癥，20～27 分提示可能有重度抑郁癥。根據(jù)抑郁評(píng)分將患者分為糖尿病組(抑郁評(píng)分≤4)及糖尿病共病抑郁組(抑郁評(píng)分≥5)。

1.5 樣本采集

用無菌尿液收集管采集尿液樣本10 ml，樣本顛倒混勻，分裝5 ml 尿液樣本于15 ml 離心管內(nèi)，?80 ℃保存?zhèn)溆?，用于尿液VOCs 檢測(cè)。

1.6 揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOCs)檢測(cè)

1.6.1 樣本前處理

將尿液樣本用針式過濾器(0.22 μm 聚醚砜)進(jìn)行過濾，取5 ml 過濾后液體加入20 ml 螺口頂空瓶中，擰緊瓶口后放入20 ℃水浴中孵育10 min，用于測(cè)試。

1.6.2 裝置連接

使用內(nèi)徑2 mm 四氟乙烯管分別連接兩種長(zhǎng)度的金屬不銹鋼針頭(18 g, 80 mm 和18 g, 35 mm)。將80 mm 的針頭完全插入待測(cè)尿液底部，35 mm針頭插入待測(cè)尿液上部(即微型鼓泡器)，將微型鼓泡器與微型氣體測(cè)試裝置連接，如圖1。

圖1 微型氣體測(cè)試裝置示意圖

1.6.3 揮發(fā)性有機(jī)化合物測(cè)試

保持兩個(gè)電磁閥斷電狀態(tài)，通過流量計(jì)控制300 sccm N2進(jìn)入微型集成式傳感陣列獲取穩(wěn)定的基線(即穩(wěn)定階段)，如圖2。然后將兩個(gè)兩位三通電磁閥同時(shí)開啟，通過微型鼓泡器獲取尿液中VOCs，鼓泡1 min，即測(cè)試階段。最后再同時(shí)斷電，N2沖洗2 min，即恢復(fù)階段。更換金屬不銹鋼針頭和尿液樣本繼續(xù)測(cè)試。

圖2 測(cè)試過程和特征數(shù)據(jù)提取

1.7 靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性計(jì)算公式

在完成尿液揮發(fā)性有機(jī)化合物測(cè)試后，對(duì)方法的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性進(jìn)行分析，靈敏度為被正確識(shí)別為糖尿病共病抑郁人數(shù)占被正確識(shí)別為糖尿病共病抑郁人數(shù)及被錯(cuò)誤認(rèn)定為糖尿病人數(shù)之和的百分比，特異性為被正確識(shí)別為糖尿病人數(shù)占被正確識(shí)別為糖尿病人數(shù)及被誤診為糖尿病共病抑郁人數(shù)之和的百分比，準(zhǔn)確性為被正確識(shí)別為糖尿病共病抑郁人數(shù)及被正確識(shí)別為糖尿病人數(shù)之和占樣本總數(shù)的百分比，具體計(jì)算公式如下：

式中：TP(真陽(yáng)性)測(cè)量被正確識(shí)別為糖尿病+抑郁癥患者數(shù)量；TN(真陰性)測(cè)量被正確識(shí)別為糖尿病患者的數(shù)量；FP(假陽(yáng)性)測(cè)量被誤診為糖尿病+抑郁癥患者的數(shù)量；FN(假陰性)測(cè)量被錯(cuò)誤認(rèn)定為糖尿病患者數(shù)量；Total 是樣本的總數(shù)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 和GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，患者基線特征采用兩獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)分析，尿液特征VOCs 采用主成分分析進(jìn)行降維處理。在本研究中，P<0.05 被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基線特征

本次研究納入糖尿病患者共161 例，其中單純糖尿病組患者141 例，占87.58%；糖尿病共病抑郁組患者20 例，占12.42%，患者具體情況如表2 和表3 所示。

表2 兩組患者基線特征

表3 兩組患者空腹血糖、糖化血紅蛋白、肝功能比較

結(jié)果顯示，糖尿病共病抑郁組患者抑郁評(píng)分顯著高于單純糖尿病組患者(P<0.01)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，糖尿病共病抑郁組患者年齡顯著高于單純糖尿病組患者(P<0.05)。此外，兩組患者的性別組成、BMI無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

結(jié)果顯示，單純糖尿病組、糖尿病共病抑郁組患者空腹血糖、糖化血紅蛋白、AST、ALT 無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOCs)檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 信號(hào)響應(yīng)分析

從141 例單純糖尿病患者中隨機(jī)選取50 份尿液，糖尿病共病抑郁組樣本20 份全部納入，樣本合計(jì)70 份進(jìn)行VOCs 檢測(cè)，獲取糖尿病組患者和糖尿病共病抑郁組患者的尿液VOCs 信號(hào)。部分尿液樣本動(dòng)態(tài)信號(hào)響應(yīng)數(shù)據(jù)如圖3 所示。由圖3 得知，氣路微型化裝置中的8 個(gè)傳感器對(duì)于尿液VOCs 具有響應(yīng)差異性，兩組患者對(duì)應(yīng)的所有傳感器電阻變化率具有差異，說明兩組患者的尿液VOCs組成存在差異，由于傳感器電阻變化率體現(xiàn)的是所有傳感器數(shù)據(jù)，未能明顯呈現(xiàn)兩組患者的尿液VOCs差異，因此需要進(jìn)一步通過主成分分析對(duì)患者尿液VOCs 進(jìn)行可視化。

圖3 尿液VOCs 的動(dòng)態(tài)信號(hào)響應(yīng)

2.2.2 主成分分析

將獲取的原始數(shù)據(jù)先基線歸零(圖2B)，按公式(4)計(jì)算電阻變化率特征值F：

通過上述方法得到8 個(gè)傳感器采集的8 個(gè)特征值，使用SPSS 軟件將獲取的8 個(gè)特征值和70 組樣本數(shù)據(jù)(8×70)進(jìn)行主成分分析(PCA)，并將分析數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism 8 軟件處理。通過傳感陣列的交叉響應(yīng)，兩組患者的尿液特征VOCs 主成分分析如圖4 所示。

圖4 尿液樣本VOCs 的主成分分析

主成分分析結(jié)果顯示，單純糖尿病組和糖尿病共病抑郁組對(duì)應(yīng)散點(diǎn)在組成上相互聚集，表明組內(nèi)樣本相似性高，同時(shí)兩組散點(diǎn)呈現(xiàn)分散狀態(tài)，提示兩組患者的尿液VOCs 基本分開，兩組患者尿液VOCs 存在組成差異。

通過公式(1)～(3)計(jì)算微腔集成式傳感陣列對(duì)70 份樣品中糖尿病和糖尿病加抑郁癥患者識(shí)別計(jì)算，測(cè)量被正確識(shí)別為糖尿病+抑郁癥患者數(shù)量為16，測(cè)量被正確識(shí)別為糖尿病的數(shù)量為49，測(cè)量被誤診為糖尿病+抑郁癥患者的人數(shù)為1，測(cè)量被錯(cuò)誤認(rèn)定為糖尿病數(shù)量為4，樣本總數(shù)為70，得出該方法靈敏度為80%，特異性為98%，準(zhǔn)確性為92.8%。

3 討論

糖尿病是臨床常見的慢性病，由于需要終身服藥、額外的醫(yī)療支出、嚴(yán)格的飲食限制和潛在的并發(fā)癥，給患者帶來沉重的身體和心理負(fù)擔(dān)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，約30%糖尿病患者共病抑郁，其中10%進(jìn)展為中重度抑郁[6-8]。共病抑郁后，患者生活質(zhì)量受到進(jìn)一步影響，血糖控制效果變差，大大影響其治療與預(yù)后[15]。此外，與糖尿病患者相比，糖尿病共病抑郁患者的死亡率顯著上升[16]。然而，在臨床工作中，糖尿病共病抑郁與糖尿病心理痛苦容易混淆，僅靠現(xiàn)有的臨床量表未能有效、及早地確診抑郁，同時(shí)臨床缺乏糖尿病共病抑郁的特征性代謝分子輔助診斷，使得糖尿病共病抑郁早期診斷尤為困難。尿液VOCs 是近年來的研究熱點(diǎn)，其成分和濃度反映機(jī)體的病理生理情況。由于尿液中的代謝物濃度較高，同時(shí)可通過無創(chuàng)手段獲得，在減輕患者身體負(fù)擔(dān)的同時(shí)，為多種疾病的診斷、治療創(chuàng)造條件。已有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病、腫瘤等疾病可以在VOCs 中找到對(duì)應(yīng)的特征信號(hào)[17-20]，為臨床診斷提供新思路。但目前為止，VOCs 在糖尿病共病抑郁方面的相關(guān)研究尚未開展。因此，探索尿液VOCs在糖尿病共病抑郁領(lǐng)域具有積極的臨床意義。

在本研究中，我們納入161 例符合糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)的2 型糖尿病患者進(jìn)行分析。PHQ9 量表作為識(shí)別、評(píng)估抑郁程度的簡(jiǎn)便、有效工具，條目簡(jiǎn)單，操作性強(qiáng)，其檢測(cè)抑郁的靈敏度與HAMD 量表評(píng)分顯著相關(guān)，故在本研究中采用PHQ9 量表對(duì)入組患者進(jìn)行抑郁評(píng)估。經(jīng)PHQ9 量表篩查后，糖尿病患者141 例，糖尿病共病抑郁患者20 例，糖尿病共病抑郁組患者占比12.42%。結(jié)果顯示，糖尿病共病抑郁組患者抑郁評(píng)分、年齡顯著高于糖尿病組患者(P<0.05)，但兩組的BMI、空腹血糖、糖化血紅蛋白、AST、ALT 無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示臨床，對(duì)于老年糖尿病患者，應(yīng)更關(guān)注其心理狀態(tài)，及時(shí)開展積極的心理治療。

接著，我們采集了兩組患者的晨尿，并建立了微型氣路測(cè)試裝置，通過測(cè)試裝置中的8 個(gè)傳感器對(duì)兩組患者尿液中VOCs 進(jìn)行特征檢測(cè)。結(jié)果顯示，兩組患者尿液VOCs 對(duì)應(yīng)的傳感器電阻變化率有差異，提示兩組患者尿液VOCs 組成存在差異。在主成分分析中，我們發(fā)現(xiàn)，單純糖尿病組患者和糖尿病共病抑郁組患者的尿液VOCs 基本分開，進(jìn)一步證明兩組患者的尿液VOCs 存在組成差異。經(jīng)計(jì)算，氣路微型化裝置檢測(cè)VOCs 方法的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性良好，表明該方法在檢測(cè)尿液VOCs 時(shí)具有可行性。以上結(jié)果說明，在糖尿病共病抑郁患者尿液中可能存在特征VOCs。糖尿病共病抑郁后，患者尿液VOCs 發(fā)生改變，表明抑郁可能擾動(dòng)糖尿病患者機(jī)體中的物質(zhì)代謝，使體內(nèi)代謝物發(fā)生復(fù)雜改變，可表現(xiàn)在尿液VOCs 中。

除氣路微型化測(cè)試裝置外，國(guó)外學(xué)者還利用電子鼻設(shè)備通過尿液VOCs 成功區(qū)分糖尿病組患者與健康對(duì)照組[20]，提示尿液VOCs 作為新型的非入侵性診斷標(biāo)志物，具有非常重要的研究潛力。尿液VOCs 作為一種新穎的臨床篩查指標(biāo)，對(duì)患者基本無創(chuàng)傷，依從性高，同時(shí)通過氣路微型化測(cè)試裝置建立的檢測(cè)方法靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性高，對(duì)臨床早期發(fā)現(xiàn)和干預(yù)糖尿病共病抑郁具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。但目前建立的測(cè)試裝置未能對(duì)VOCs 種類進(jìn)行區(qū)分，VOCs 中的具體成分和濃度仍然未知。因此，需要完善測(cè)試裝置及檢測(cè)方法，繼續(xù)探索糖尿病共病抑郁患者體內(nèi)特征VOCs 成分及濃度，以期發(fā)現(xiàn)糖尿病共病抑郁患者體內(nèi)特征VOCs，為臨床早期診斷提供實(shí)驗(yàn)參考。