甲硝唑氯化鈉注射液的凍融穩(wěn)定性研究及質(zhì)量控制圖分析

朱滇黔，李睿旻，李 玲 （海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系, 上海 200433）

高寒地區(qū)戰(zhàn)斗的特殊自然地理環(huán)境對戰(zhàn)斗行動帶來了很大的影響，人員極易凍傷，易患皮膚病、感冒和雪盲等病癥，傷病員救治和后送任務(wù)重，后勤保障任務(wù)艱巨復(fù)雜[1]。因此，高原高寒環(huán)境對駐訓(xùn)的野戰(zhàn)衛(wèi)生裝備的運(yùn)輸、機(jī)動、使用有特殊的要求[2]。藥材保障是影響救治的主要因素之一，如此極端的環(huán)境對官兵野外訓(xùn)練和作戰(zhàn)的藥品保障也是一種極大的考驗(yàn)。

甲硝唑是一種抗厭氧菌和抗滴蟲藥，主要用于治療或預(yù)防厭氧菌引起的系統(tǒng)或局部感染，治療破傷風(fēng)常與破傷風(fēng)抗毒素（TAT）聯(lián)用[3]。作為一種抗菌藥物，在戰(zhàn)爭條件下是不可或缺的。它主要的劑型為片劑和注射液，而注射液在嚴(yán)寒環(huán)境下容易凍結(jié)，應(yīng)模擬藥品在運(yùn)輸與使用過程中可能碰到的溫度條件進(jìn)行熱循環(huán)考察以評價(jià)藥品的穩(wěn)定性[4]。本研究從藥材保障實(shí)際需求出發(fā)，對模擬嚴(yán)寒環(huán)境下的甲硝唑氯化鈉注射液的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，可為同類藥品暴露在極端嚴(yán)寒環(huán)境下的儲存和使用提供數(shù)據(jù)支持。

質(zhì)控圖是指對過程質(zhì)量加以測定、記錄從而評估和監(jiān)察過程是否處于控制狀態(tài)的一種統(tǒng)計(jì)方法設(shè)計(jì)的圖，是實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行內(nèi)部質(zhì)量控制的重要工具之一[5]。質(zhì)控圖可以直觀地反映檢測過程的狀態(tài)，對于檢測實(shí)驗(yàn)室宏觀的、長期的質(zhì)量控制有著重要的意義。本研究利用質(zhì)控圖對甲硝唑氯化鈉注射液的含量測定結(jié)果進(jìn)行分析，能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)過程中的異常，以便采取相應(yīng)的糾正措施和預(yù)防措施，保證藥物質(zhì)量檢驗(yàn)的可控。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A 液相色譜儀（日本島津公司），分析軟件為LabSolutions；AUW/220D 型十萬分之一電子天平（日本島津公司）；BPS-50CH 恒溫恒濕箱、DZG-6020 型真空干燥箱（上海一恒公司）；HHS 型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅公司）；BCD-247e 型美的冰箱。

1.2 試藥

甲硝唑氯化鈉注射液（批號：719082601；規(guī)格：100 ml 含甲硝唑0.5 g、氯化鈉0.8 g；浙江天瑞藥業(yè)有限公司）；甲醇（色譜純，國藥試劑公司）；甲硝唑?qū)φ掌罚ㄅ枺?00191-201804；含量100%；中國食品藥品檢定研究院）；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品放置條件

將甲硝唑氯化鈉注射液放置于?20 ℃冰箱冷凍后，分別在室溫，40 ℃恒溫，60 ℃水浴條件下解凍，具體條件如表1 所示，其中基于運(yùn)輸條件考慮模擬環(huán)境的樣品在每次凍融循環(huán)后分別取樣，基于使用條件考慮模擬環(huán)境的樣品分別在第3、6、9、12、15、18 次凍融循環(huán)后取樣測定[6]。

表1 樣品凍融條件

2.2 色譜條件

色譜柱為Agilent Extend C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-水(20:80，V/V)；檢測波長320 nm；流速1.0 ml/min，進(jìn)樣體積10 μl。

2.3 對照品溶液的制備

將甲硝唑?qū)φ掌分糜?05 ℃下干燥2 h，取10 mg 精密稱定，置于10 ml 容量瓶中，用流動相稀釋并定容，即得濃度為1.0 mg/ml 的甲硝唑?qū)φ掌啡芤骸?/p>

2.4 供試品溶液的制備

精密移取甲硝唑氯化鈉注射液0.5 ml 置于10 ml量瓶，用流動相稀釋并定容，即為供試品溶液。

2.5 專屬性試驗(yàn)

分別取對照品溶液及供試品溶液各10 μl，按“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果如圖1 所示，供試品溶液在與對照品溶液對應(yīng)位置出現(xiàn)相對應(yīng)的色譜峰，空白溶劑無干擾，方法專屬性良好。

圖1 專屬性考察典型色譜圖

2.6 線性及范圍

將“2.3”項(xiàng)下制備的對照品溶液依次稀釋，配制成濃度分別為0.010、0.050、0.125、0.250、0.500、1.000 mg/ml 的系列溶液，作為線性工作溶液。按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，濃度由低到高依次進(jìn)樣，以甲硝唑?qū)φ掌返臐舛?X，mg/ml)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程Y=31 387 979X+0.190 3，r=1.000，結(jié)果表明，甲硝唑在0.010～1.000 mg/ml 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn)

取甲硝唑?qū)φ掌啡芤哼m量（0.25 mg/ml），按“2.2”項(xiàng)下色譜條件在1 d 以內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6 次，以及連續(xù)3 d 分別進(jìn)樣，根據(jù)所得峰面積分別考察日內(nèi)精密度和日間精密度。結(jié)果顯示，日內(nèi)精密度RSD為0.24%；日間精密度RSD 為1.06%，表明方法的精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取甲硝唑氯化鈉注射液樣品6 份，各0.5 ml，按“2.4”項(xiàng)下方法分別制成供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果顯示每100 ml 注射液中甲硝唑的平均含量為0.504 g，RSD 為1.26%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，在室溫下放置0、3、6、9、12、18、24 h 后，分別按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，考察溶液的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示RSD 為0.05%，表明供試品溶液在室溫條件下24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的甲硝唑樣品0.2 ml(含甲硝唑0.1 mg)共9 份，每3 份為1 組，按低、中、高3 個(gè)水平分別加入適當(dāng)濃度的對照品溶液(相當(dāng)于樣品中含量的80%、100%、120%)，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示甲硝唑的平均回收率為101.03%，RSD 為1.17%（n=9）。

2.11 含量測定

取不同凍融條件下的甲硝唑氯化鈉注射液，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，以外標(biāo)法分別計(jì)算各樣品中甲硝唑的含量，結(jié)果如表2所示。

表2 各階段樣品中甲硝唑的含量測定結(jié)果(按標(biāo)示量計(jì)/%)

3 質(zhì)控圖分析

3.1 數(shù)據(jù)的收集和整理

收集室溫保存下連續(xù)9 d 的供試品含量測定數(shù)據(jù)（按標(biāo)示量計(jì)），結(jié)果依次為 103.02、103.13、101.84、 101.27、 99.29、 100.69、 101.65、 101.84、99.39、99.79、100.82、100.06、99.39、99.77、101.82、101.29、98.84、99.03。根據(jù)測定結(jié)果計(jì)算均值(X)=100.72，標(biāo)準(zhǔn)偏差(σ)=1.35，X+2σ=103.42 ，X?2σ=98.02，X+3σ=104.77，X?3σ=96.67。

3.2 繪制均值控制圖(X圖)

以測定次序?yàn)闄M坐標(biāo)，測定結(jié)果為縱坐標(biāo)，X(均值)為中心線，（X±2σ）為上下警告限，（X±3σ）為上下行動限，繪制控制圖，并將每次測定質(zhì)控樣品的結(jié)果按測定次序標(biāo)注在控制圖上，如圖2 所示。各數(shù)據(jù)點(diǎn)均在上下行動限內(nèi)，也未出現(xiàn)常規(guī)控制圖判異準(zhǔn)則里規(guī)定的8 種情形，不存在異常的趨勢[7]。因此，該圖可用于甲硝唑氯化鈉注射液日常檢測過程質(zhì)量控制。

圖2 甲硝唑氯化鈉注射液質(zhì)量控制圖

3.3 質(zhì)控圖的應(yīng)用

質(zhì)控圖繪制完成后，對不同凍融條件下的甲硝唑氯化鈉注射液樣品進(jìn)行含量測定，每測定一個(gè)條件的樣品時(shí)，同時(shí)測定質(zhì)控樣品（正常條件儲存），用于判斷檢測是否處于控制狀態(tài)。每3 個(gè)凍融循環(huán)后的分別測定樣品含量，18 次循環(huán)后共測定6 次，將各條件下的數(shù)據(jù)標(biāo)于控制圖中，如圖3 所示。質(zhì)控樣品均在上下警告線內(nèi)，且波動較小，說明檢測過程的質(zhì)量處于較好的水平控制中，樣品的檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。室溫下解凍的樣品在第4 次測定（12 次凍融循環(huán)）開始位于下警告線外，第5 次測定（15 次凍融循環(huán)）后位于下行動線外，說明室溫解凍條件下12 次凍融循環(huán)后的檢測已屬于失控狀態(tài)，應(yīng)查明原因；60 ℃水浴解凍的樣品所有測試數(shù)據(jù)均在上下警告線內(nèi)，表明甲硝唑的含量處于可控狀態(tài)。

圖3 不同凍融條件下的甲硝唑氯化鈉注射液質(zhì)控圖分析

4 討論

新藥研究過程中在設(shè)計(jì)藥品的穩(wěn)定性考察實(shí)驗(yàn)方案時(shí)，往往會通過一系列的影響因素試驗(yàn)來選定藥品的包裝與儲存條件，但經(jīng)常會忽略一些特殊的藥品在運(yùn)輸或使用過程中因?yàn)闇囟鹊淖兓赡芙o產(chǎn)品的質(zhì)量所造成的不利影響。美國FDA 的穩(wěn)定性指導(dǎo)原則中提出對于易發(fā)生物相分離、黏度減小、沉淀或聚集的藥品需通過熱循環(huán)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證其運(yùn)輸或使用過程中的穩(wěn)定性[8]。對于可能暴露于冰點(diǎn)以下的藥品，熱循環(huán)實(shí)驗(yàn)應(yīng)包括3 次循環(huán)，每次循環(huán)應(yīng)在?20～?10 ℃冷凍2 d，然后在40 ℃加速條件下考察2 d。因此，本項(xiàng)目采取?20 ℃冷凍2 d，40 ℃加熱2 d，循環(huán)3 次來考察甲硝唑在運(yùn)輸過程中的穩(wěn)定性。

甲硝唑氯化鈉注射液作為常規(guī)的戰(zhàn)備液體藥品，在高原寒區(qū)保障使用過程中，凍結(jié)無法避免，在不影響藥品質(zhì)量的前提下如何快速解凍是影響藥品安全性和有效性的重要因素之一。本研究從實(shí)際應(yīng)用的角度出發(fā)，考察了室溫、60 ℃水浴解凍以及凍融次數(shù)對質(zhì)量穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明，60 ℃水浴解凍的樣品含量雖然出現(xiàn)了波動，但始終在上、下警告線之內(nèi)，并且其pH 值和有關(guān)物質(zhì)也沒有發(fā)現(xiàn)明顯的變化，表明該條件下的反復(fù)凍融對甲硝唑氯化鈉注射液的穩(wěn)定性影響較小。相比之下，室溫解凍的樣品在12 次凍融后出現(xiàn)了針狀結(jié)晶，其原因可能是室溫解凍使得樣品緩慢到達(dá)并通過最大冰晶生成帶，而導(dǎo)致結(jié)晶的形成。在15 次凍融后出現(xiàn)含量低于質(zhì)控圖下行動線的現(xiàn)象，并且我們將出現(xiàn)針狀結(jié)晶的樣品通過反復(fù)振蕩，待結(jié)晶消失后再進(jìn)行測定，其含量沒有顯著變化（依舊低于下警告線），說明室溫解凍對甲硝唑氯化鈉注射液的穩(wěn)定性有更大的影響。

本研究以甲硝唑氯化鈉注射液為例對液體藥品的凍融穩(wěn)定性進(jìn)行研究，結(jié)果表明不同的凍融條件會影響甲硝唑氯化鈉注射液的穩(wěn)定性，在嚴(yán)寒地區(qū)使用時(shí)應(yīng)當(dāng)盡量減少其凍融次數(shù)，避免室溫解凍。本研究可為液體藥物的凍融研究提供方法借鑒，并為優(yōu)化嚴(yán)寒地區(qū)的藥材保障提供數(shù)據(jù)支持。