輔酶Q10 乳劑的處方工藝改進(jìn)與質(zhì)量評(píng)價(jià)

王 宇，鄧意輝，宋艷志，劉廣宣 （. 中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院、遼寧省腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部, 遼寧 沈陽 004；. 沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院, 遼寧 沈陽 006）

輔酶Q10（CoQ10）是生物體內(nèi)廣泛存在的脂溶性醌類化合物，作為細(xì)胞中的輔酶，其具有重要且廣泛的藥理作用[1]，目前主要用于預(yù)防心血管疾病和增強(qiáng)免疫力等方面[2-4]。CoQ10分子量高、水溶性低，口服生物利用度低，注射劑穩(wěn)定性差，對光十分敏感[5]，越來越多的研究表明靜脈注射乳劑是其理想載體[6]。

高油量可溶解更大量藥物，對極難溶性藥物的優(yōu)勢更為明顯。但是目前對于含藥靜脈注射乳劑的研究中，油的質(zhì)量體積比通常為10%[7]，更高油量的研究相對較少?；跔I養(yǎng)型脂肪乳劑的長期臨床應(yīng)用實(shí)踐，高油量靜脈注射乳劑的安全性已得到證實(shí)，具有廣闊的發(fā)展空間和巨大的市場價(jià)值。同時(shí)乳劑不能經(jīng)受冷凍也長期困擾著研究者們，卵磷脂與含親水鏈段的乳化劑組合及恰當(dāng)?shù)挠宛ざ仁墙鉀Q此問題的關(guān)鍵。本研究在乳劑經(jīng)典處方中添加單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂（GM1），GM1 含有一個(gè)較大的親水頭基，具有兩親性，利用其特殊的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢來解決乳劑不耐受凍融的難題。本研究旨在制備高油量、高載藥量且耐凍融循環(huán)的CoQ10乳劑，建立其HPLC 含量分析方法，并進(jìn)行物理化學(xué)性質(zhì)表征和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，以彌補(bǔ)CoQ10現(xiàn)有制劑的不足，為高油量含藥靜脈注射乳劑的研究開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 儀器與試劑

BS124s 電子分析天平（德國Sartorius 公司）；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市英峪予華儀器廠）；高速分散機(jī)（德國IKA T18 ULTRA TURRAX）；M-110L 型微射流儀（美國Microfluidics公司）；垂直旋轉(zhuǎn)自動(dòng)高壓滅菌器（沈陽天美達(dá)科學(xué)儀器有限公司）；Nicomp-380 激光粒度測定儀（美國Particle Sizing Systems 公司）；PHS-2C 型數(shù)字顯示酸度計(jì)（上海偉業(yè)儀器廠）；CS120GXL 型超速離心機(jī)（日本Hitachi 公司）；UV228 紫外-可見光檢測器、P230 高壓恒流泵（大連依利特分析儀器有限公司）；高精度全自動(dòng)交流穩(wěn)壓器（浙江中川電氣科技有限公司）；AT-130 柱溫箱（天津市金洲科學(xué)儀器有限公司）；人工氣候箱（德國MMM 公司）。

CoQ10（廣東潤和生物科技有限公司，批號(hào)：2017052405，純度 ≥98%），中鏈油（MCT，遼寧鐵嶺北亞藥用油有限公司，注射級(jí)），大豆油（LCT，遼寧鐵嶺北亞藥用油有限公司，注射級(jí)），蛋黃卵磷脂（E80，德國Lipoid 公司，注射級(jí)），GM1（重慶寰瑞生物制藥有限公司，注射級(jí)），維生素E（VE，BASF 維生素有限公司），甘油（湖南爾康制藥有限公司，注射級(jí)），聚乙二醇12-羥基硬脂酸酯（HS15，德國BASF 公司，注射級(jí)），葡萄糖注射液（昆明南疆制藥有限公司），氯化鈉注射液（吉林省都邦藥業(yè)股份有限公司），滅菌注射用水（石家莊四藥有限公司），其他試劑均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 CoQ10 乳劑的制備

油種類對乳劑的穩(wěn)定性至關(guān)重要，LCT 和MCT 單獨(dú)應(yīng)用時(shí)均存在各自的缺陷，且乳劑不能經(jīng)受冷凍，因此將二者聯(lián)合應(yīng)用，質(zhì)量比為1∶1[8]。結(jié)合靜脈注射乳劑經(jīng)典處方組成，CoQ10乳劑按如下方法制備[9]。稱取質(zhì)量體積比為30% LCT/MCT(質(zhì)量比1∶1)、2% E80、0.05% VE和2% CoQ10于60 ℃水浴中加熱熔融、分散均勻。2.25%甘油和0.2%GM1 溶解于適量重蒸水中，60 ℃加熱攪拌至完全溶解。待兩相溫度平衡后，高剪切攪拌下（8 000 r/min）將水相加入油相中，完全加入后繼續(xù)分散5 min，即得初乳。待初乳冷卻至室溫后，加重蒸水定容至處方量。將初乳轉(zhuǎn)移至微射流儀中，經(jīng)6 000 psi 均質(zhì)3 個(gè)循環(huán)，14 000 psi 均質(zhì)6 個(gè)循環(huán)減小粒徑。依次過0.80 和0.45 μm 微孔濾膜。將所得乳劑分裝，充氮?dú)猓?21 ℃滅菌8 min。

2.2 CoQ10 乳劑HPLC 方法的建立

2.2.1 色譜條件[10]

色譜柱：Betasil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm，大連依利特）；流動(dòng)相：甲醇-無水乙醇（體積比20∶80）；柱溫：35 ℃；流速：1.0 ml/min；檢測波長：275 nm；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2.2 溶液的配制

精密稱定CoQ1025.0 mg，置于25 ml 量瓶中，用無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1 000.0 μg/ml 的CoQ10對照品儲(chǔ)備液。精密移取CoQ10乳劑0.1 ml，置于10 ml 量瓶中，加入無水乙醇破壞乳劑并稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm 微孔濾膜，即得CoQ10乳劑樣品溶液。

2.2.3 專屬性試驗(yàn)

取CoQ10乙醇溶液20 μl 進(jìn)樣，記錄色譜圖。將空白乳和CoQ10乳劑分別加適量無水乙醇破乳，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取各續(xù)濾液20 μl 進(jìn)樣，記錄色譜圖。在此色譜條件下輔料和溶劑對藥物測定無干擾，見圖1。

圖1 空白乳劑(A)、CoQ10 溶液(B)和CoQ10 乳劑(C)的HPLC 圖

2.2.4 線性關(guān)系考察

精密量取CoQ10對照品儲(chǔ)備液適量，用無水乙醇稀釋成濃度為10.0、25.0、50.0、100.0、150.0、200.0、250.0 μg/ml 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，過0.45 μm 微孔濾膜，各取20 μl 進(jìn)樣分析，記錄峰面積A。以A對濃度C（μg/ml）進(jìn)行線性回歸，得線性方程為A=15 738C- 12 584，r=0.999 8。結(jié)果表明CoQ10在10.0 ～ 250.0 μg/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn)

分別取低、中、高濃度（25.0、100.0、200.0 μg/ml）的CoQ10對照品溶液，于2、4、6、8、10 h 各測定一次，以峰面積求算日內(nèi)精密度；于1、2、3、4、5 天各測定一次，以峰面積求算日間精密度。結(jié)果表明RSD 均小于2%，方法精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下CoQ10乳劑樣品溶液室溫下避光放置，于0、2、4、6、8、10、24 h 分別取20 μl 進(jìn)樣分析，記錄峰面積。計(jì)算得各時(shí)間點(diǎn)峰面積為0 h 測定值的100.45%、101.23%、99.27%、100.26%、99.34%及100.06%，表明樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份CoQ10乳劑樣品溶液。另精密稱定CoQ10適量，加乙醇溶解并稀釋成濃度為200.0 μg/ml 的溶液，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得對照品溶液。精密量取樣品和對照品溶液20 μl 進(jìn)樣，記錄峰面積。外標(biāo)法計(jì)算得樣品中藥物濃度分別為201.3、199.6、198.2、200.7、199.2、198.4 μg/ml，RSD 為0.62%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 回收率試驗(yàn)

精密移取CoQ10對照品儲(chǔ)備液0.25、1.0 和2.0 ml 各3 份于10 ml 量瓶中，分別加入0.1 ml 空白乳，再加乙醇破壞乳劑并稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm 微孔濾膜。將上述各溶液進(jìn)樣分析，記錄峰面積，按“2.2.4”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得藥物濃度，計(jì)算回收率。結(jié)果表明25、100 和200 μg/ml CoQ10樣品溶液的平均回收率分別為100.04%、99.63%和100.49%，RSD 分別為0.29%、0.80%和0.52%。

2.3 CoQ10 乳劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.3.1 外觀

按照“2.1”項(xiàng)下的處方工藝制備CoQ10乳劑，觀察其外觀。CoQ10乳劑外觀為淡黃色均勻乳狀液體，無油滴、不溶性成分或塊狀團(tuán)聚物，見圖2。

圖2 CoQ10 乳劑的外觀

2.3.2 物理化學(xué)性質(zhì)

取CoQ10乳劑適量，用蒸餾水稀釋至適宜濃度，采用激光散射粒徑測定儀測定3 批CoQ10乳劑的粒徑、粒徑分布和Zeta 電位。測定波長為632.8 nm，測定角為90°，測定溫度為25 ℃。結(jié)果顯示3 批樣品的平均粒徑為（239.5±0.8）nm，未見大于5 μm 的粒子，符合靜脈注射液的要求；粒徑為（0.300±0.011）nm；Zeta 電位為（?32.28±2.04）mV。同時(shí)測定了CoQ10乳劑的pH 值為（5.86±0.02），符合注射劑質(zhì)量要求。

2.3.3 含量測定

精密量取CoQ10乳劑0.1 ml（含CoQ10約2 mg）于10 ml 量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm 微孔濾膜，取20 μl 進(jìn)樣，記錄色譜圖。另取相同濃度的藥物溶液，同法測定。外標(biāo)法計(jì)算乳劑中CoQ10的含量，最終測得3 批供試品的標(biāo)示量百分比分別為99.18 %、101.50 %和101.08%，RSD為1.24%。

2.3.4 包封率測定

采用超速離心法測定CoQ10乳劑的包封率。乳劑經(jīng)過超速離心后，油相、乳化層和水相徹底分開，將油相與乳化層中的藥物量合并考慮，通過測定水相中的藥物量來計(jì)算包封率。精密移取CoQ10乳劑0.1 ml 至10 ml 量瓶中，加入乙醇稀釋至刻度，混勻，過0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液進(jìn)行HPLC檢測，外標(biāo)法計(jì)算藥物總量。移取CoQ10乳劑4 ml至超速離心管中，溫度為4 ℃，以50 000 r/min 離心2 h。精密移取下層液體1.0 ml 至10 ml 量瓶中，乙醇稀釋至刻度，混勻，過0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液進(jìn)行HPLC 檢測，外標(biāo)法計(jì)算水相中藥物含量。按上述方法測得3 批CoQ10乳劑的平均包封率為（98.5%±1.1）%，表明藥物絕大部分存在于制劑的油相和油水界面層中。

2.4 滅菌和凍融穩(wěn)定性

將CoQ10乳劑分裝于西林瓶，充氮?dú)饷芊猓?21 ℃滅菌8 min。參考《化學(xué)藥物穩(wěn)定性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》中涉及乳劑凍融試驗(yàn)的方法，將滅菌后樣品在?20 ℃冷凍48 h，40 ℃放置48 h 為一個(gè)循環(huán)，共循環(huán)3 次，每完成一個(gè)循環(huán)測定粒徑。結(jié)果顯示3 批CoQ10乳劑均具有良好的滅菌穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性，見表1。

表1 CoQ10 乳劑的滅菌和凍融試驗(yàn)結(jié)果

2.5 稀釋穩(wěn)定性

以平均粒徑和粒徑分布為指標(biāo)，考察CoQ10乳劑在5%葡萄糖注射液和0.9%氯化鈉注射液中的稀釋穩(wěn)定性。將制劑用上述稀釋介質(zhì)進(jìn)行50 倍稀釋，于0、2、4、6、8、10、12、24 h 取樣，測定粒徑和粒徑分布。結(jié)果見圖3，制劑經(jīng)5%葡萄糖注射液和0.9%氯化鈉注射液稀釋后放置24 h，粒徑和粒徑分布均比較穩(wěn)定，稀釋穩(wěn)定性良好。

圖3 CoQ10 乳劑用5%葡萄糖和0.9%氯化鈉注射液稀釋50 倍后粒徑和粒徑分布的變化(n=3)

2.6 光降解試驗(yàn)

CoQ10結(jié)構(gòu)中含有大量不飽和雙鍵，是典型的光敏性藥物。以藥物含量為主要指標(biāo)，考察不同因素對CoQ10乳劑光解速率的影響。將樣品分裝于透明西林瓶，置于人工氣候箱中，于（25±2） ℃、（4 500±500）lux 條件下進(jìn)行強(qiáng)制光解試驗(yàn)，調(diào)整樣品與光源的距離約10 cm，使受光均勻，分別于0、24、48、72、96、120 h 取樣，HPLC 法測定藥物含量。繪制光降解曲線，并進(jìn)行反應(yīng)級(jí)數(shù)擬合，求出光解半衰期（t1/2）。

2.6.1 載體對光照穩(wěn)定性的影響

將適量CoQ10用無水乙醇溶解并稀釋，即得CoQ10溶液。稱取0.25% CoQ10和3% HS15于55 ℃水浴中加熱熔融，分散均勻。攪拌狀態(tài)下加入預(yù)熱至相同溫度的注射用水，攪拌10 min，即得CoQ10膠束。制備相同藥物濃度（1 mg/ml）的CoQ10溶液、膠束和乳劑進(jìn)行光解試驗(yàn)。光解曲線見圖4，反應(yīng)級(jí)數(shù)均為一級(jí)。對CoQ10的光保護(hù)作用由強(qiáng)到弱依次為乳劑、膠束和溶液，t1/2分別為239.0、50.6 和29.4 h。

圖4 CoQ10 乳劑、膠束和溶液的光降解曲線(n=3)

2.6.2 稀釋倍數(shù)對光照穩(wěn)定性的影響

將CoQ10乳劑（20 mg/ml）分別稀釋0、2、4、10、20 倍進(jìn)行光解試驗(yàn)。光解曲線見圖5，反應(yīng)級(jí)數(shù)均為一級(jí)，稀釋倍數(shù)由低到高，t1/2分別為533.1、495.0、288.8、115.5 和62.4 h。

圖5 不同稀釋倍數(shù)CoQ10 乳劑的光降解曲線(n=3)

2.6.3 載藥量對光照穩(wěn)定性的影響

分別制備0.1%（1 mg/ml）和2.0%（20 mg/ml）載藥量的CoQ10乳劑，進(jìn)行光解試驗(yàn)。光解曲線見圖6，反應(yīng)級(jí)數(shù)均為一級(jí)，0.1%和2.0%載藥量乳劑的t1/2分別為233.5 和533.1 h。結(jié)果表明，光解速率與載藥量呈反比，載藥量越大，光解速率越小。

圖6 不同載藥量CoQ10 乳劑的光降解曲線(n=3)

2.7 影響因素試驗(yàn)

CoQ10乳劑需在冰箱（2～8 ℃）內(nèi)儲(chǔ)存，因此以下穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)參照《中國藥典》2020 版中對溫度特別敏感藥物制劑的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行。

2.7.1 光照穩(wěn)定性

將CoQ10乳劑分裝于棕色西林瓶中，充氮?dú)?、密封，在?5±2） ℃、（4 500±500） lux 條件下，于第0、5、10 天取樣，以制劑外觀、含量、粒徑、pH 為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察CoQ10乳劑的光照穩(wěn)定性。結(jié)果(見表2)表明3 批制劑的含量和pH 略有下降，提示該乳劑需避光制備與儲(chǔ)存。

表2 CoQ10 乳劑的光照穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.7.2 40 ℃高溫穩(wěn)定性

將CoQ10乳劑分裝于西林瓶中，充氮?dú)?、密封，在?0±2） ℃條件下避光放置，于第0、5、10 天取樣，以制劑外觀、含量、粒徑、pH 為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察CoQ10乳劑在高溫條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果(見表3)顯示3 批制劑的含量和pH 隨時(shí)間延長呈下降趨勢。

表3 CoQ10 乳劑在40 ℃的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 25 ℃加速試驗(yàn)

取3 批CoQ10乳劑分裝于西林瓶中，充氮?dú)狻⒚芊?，在?5±2） ℃、相對濕度60%的條件下避光放置6 個(gè)月，分別于第0、1、2、3、6 個(gè)月取樣，觀察制劑外觀，測定含量、粒徑和pH 值。結(jié)果表明，CoQ10乳劑在（25±2） ℃條件下避光放置6 個(gè)月，各指標(biāo)均在合格范圍內(nèi)，穩(wěn)定性良好。

2.9 長期穩(wěn)定性試驗(yàn)

取3 批CoQ10乳劑分裝于西林瓶中，充氮?dú)?、密封，在?±3） ℃條件下避光放置12 個(gè)月，分別于第0、3、6、9、12 個(gè)月取樣，觀察制劑外觀，測定含量、粒徑和pH 值。結(jié)果表明，CoQ10乳劑在（5±3） ℃條件下避光放置12 個(gè)月，各指標(biāo)均在合格范圍內(nèi)，穩(wěn)定性良好。

3 討論

3.1 凍融穩(wěn)定性

乳劑冷凍期間冰晶的形成會(huì)破壞乳化膜，從而引發(fā)小油滴聚集成大油滴，甚至導(dǎo)致浮油、破乳。解決乳劑凍融問題的主要手段為油相和乳化劑的合理選擇。其一是油相要有恰當(dāng)?shù)酿ざ?，將LCT與MCT 聯(lián)合應(yīng)用既能克服單獨(dú)使用存在的問題，又可取長補(bǔ)短，有利于乳劑凍融穩(wěn)定性的提高。其二，牢固的乳化膜可增強(qiáng)乳劑的凍融穩(wěn)定性，有研究[11]發(fā)現(xiàn)卵磷脂與含親水鏈段的乳化劑組合對提高凍融穩(wěn)定性有至關(guān)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)CoQ10乳劑處方組成中的GM1 是一種內(nèi)源性糖脂，具有生物可降解、無免疫原性等特點(diǎn)[12]，近年來已有研究將GM1 應(yīng)用于乳劑、脂質(zhì)體和膠束的制備[12-14]。GM1 是兩親性物質(zhì)，可與卵磷脂形成復(fù)合乳化膜，增加膜的韌性。其結(jié)構(gòu)中的較大親水頭基形成的空間立體位阻，及結(jié)構(gòu)中唾液酸的荷負(fù)電對提高乳劑的凍融穩(wěn)定性也至關(guān)重要。此外，在水相中加入含羥基的醇類或糖類（凍融保護(hù)劑），可以增加水相黏度，減慢冰晶的生長速度和程度，增強(qiáng)乳劑的凍融穩(wěn)定性。

3.2 光照穩(wěn)定性

CoQ10的光解具有濃度依賴性，起始濃度高時(shí)光解速率相對較慢，但當(dāng)制劑稀釋倍數(shù)增加時(shí)，其透光性大大增加，光解反應(yīng)加劇。對于微粒給藥系統(tǒng)，粒徑是一個(gè)重要參數(shù)，同時(shí)其光解具有一定的粒徑依賴性。本研究所制備的乳劑屬于高油量低磷脂含量，與普通乳劑相比粒徑較大，因此光穩(wěn)定性要更好。推測原因?yàn)楣獠蝗菀状┩复罅街苿┑膬?nèi)部，降低了藥物的曝光率；此外，粒徑大時(shí)粒子的曲率較低，比表面積小，因此曝光機(jī)會(huì)少，越不易光解[10]。本實(shí)驗(yàn)證明了將CoQ10包封入乳劑中可減少其曝光機(jī)會(huì)，對藥物能起到一定的保護(hù)作用。但CoQ10乳劑仍需低溫氮?dú)猸h(huán)境下保存，使用過程中避光處理，以減少光解的概率。