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    天麻鉤藤飲對腦缺血再灌注損傷模型大鼠NMDAR/ERK信號通路及海馬鈣化的影響

    2022-12-06 11:04:00張菁華許可劉勝賢李鑫
    中國老年學(xué)雜志 2022年23期
    關(guān)鍵詞:鉤藤尼莫地平貨號

    張菁華 許可 劉勝賢 李鑫

    (天津市北辰區(qū)中醫(yī)醫(yī)院腦病三科,天津 300400)

    缺血性腦卒中屬于臨床常見腦損傷疾病,其發(fā)病率和死亡率逐年上升,且其致殘率較高,嚴(yán)重危害人們的生命健康,影響患者的生活質(zhì)量〔1〕。缺血性腦組織實現(xiàn)再灌注是治療缺血性腦卒中重要措施,但易產(chǎn)生繼發(fā)性腦缺血再灌注損傷〔2,3〕。腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致機(jī)體神經(jīng)功能出現(xiàn)障礙,海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整性與腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的神經(jīng)功能障礙密切相關(guān)〔4〕。研究顯示,抑制N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號通路可以對腦缺血再灌注損傷神經(jīng)起保護(hù)作用〔5〕。中藥治療缺血性腦卒中具有毒副作用小、靶點多、成本低等多種優(yōu)點,其中天麻鉤藤飲具有補(bǔ)腎益智、清熱活血等功效,其常用中藥治療腦缺血,可保護(hù)細(xì)胞免受缺血性損傷〔6〕。天麻鉤藤飲可以通過下調(diào)NMDAR的表達(dá)減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷和凋亡,對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞起到一定保護(hù)作用〔7〕。然而在腦缺血再灌注損傷中麻鉤藤飲對NMDAR/ERK通路的作用機(jī)制尚不完全清楚,本研究通過構(gòu)建腦缺血再灌注損傷大鼠模型,觀察麻鉤藤飲對模型大鼠海馬鈣化及NMDAR/ERK通路的影響,以探究麻鉤藤飲的藥理機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1實驗動物 SPF清潔級SD大鼠,8周齡,體重250 g左右,由北京生命科學(xué)研究所動物實驗中心提供,合格證號為SYXK(京)2015-0002,適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后,進(jìn)行后續(xù)實驗。本研究經(jīng)天津市北辰區(qū)中醫(yī)醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)同意。

    1.2試劑及儀器 天麻鉤藤顆粒(國藥準(zhǔn)字Z51021084)購自成都九芝堂金鼎藥業(yè)有限公司;尼莫地平片(國藥準(zhǔn)字H14022821)購自亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司;蘇木素染液(貨號:G1080)、伊紅染液(貨號:G1100)購自北京索萊寶科技有限公司;Trizol提取試劑盒(貨號:RN0401)購自北京艾德萊生物科技公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號:K1622)購自美國Fermentas公司;AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(貨號:Q111-02)購自南京諾唯贊生物科技有限公司;兔源多克隆NMDAR抗體(貨號:A-6473)、兔源單克隆ERK抗體(貨號:13-6200)、兔源單克隆磷酸化(p)-ERK抗體(貨號:MA5-15033)購自中國賽默飛世爾科技有限公司;兔源單克隆抗β-actin抗體(貨號: 3700S)購自美國CST公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(貨號:YB-19442)購自美國R&D/Prosci/NovusBiologicals公司;顯微鏡(型號:XDS-10)購自上海炳宇光學(xué)儀器有限公司;化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(型號:ChemiDocXRS)購自美國Bio-Rad公司;qRT-PCR所需引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    1.3實驗方法

    1.3.1天麻鉤藤飲藥液的制備 根據(jù)人類每天口服15 g天麻鉤藤顆粒,人到大鼠轉(zhuǎn)換因子為6.25,大鼠每天用量為1.56 g/kg,將天麻鉤藤顆粒分別以0.156 g/ml、0.468 g/ml原液濃度溶于鹽水中,并保存于4℃。

    1.3.2動物分組與給藥 將75只SD大鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、天麻鉤藤飲低劑量組、天麻鉤藤飲高劑量組,每組各15只。尼莫地平組:灌胃給予尼莫地平8.0 mg/(kg·d);天麻鉤藤飲低劑量組:灌胃給予天麻鉤藤飲1.56 g/(kg·d);天麻鉤藤飲高劑量組:灌胃給予天麻鉤藤飲4.68 g/(kg·d);假手術(shù)組、模型組:灌胃給予等量生理鹽水,連續(xù)灌胃14 d。末次給藥2 h后,制備腦缺血再灌注損傷大鼠模型。

    1.3.3腦缺血再灌注損傷大鼠模型制備 參照文獻(xiàn)〔8〕采用大腦中動脈線栓法制備腦缺血再灌注損傷大鼠模型,術(shù)前禁食不禁水12 h,大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mg/kg)麻醉,切開頸部皮膚,使左側(cè)頸動脈三角暴露,在頸動脈處進(jìn)行結(jié)扎,在頸總動脈處剪開一小口,插入直徑為0.25 mm的魚線,穿過頸總動脈進(jìn)入內(nèi)動脈,進(jìn)而阻斷大腦中動脈血流,缺血2 h后拔除魚線,再灌注24 h,假手術(shù)組大鼠僅暴露大鼠左側(cè)頸動脈三角區(qū),手術(shù)完成后,縫合切口,用碘酒進(jìn)行消毒。

    1.3.4各組神經(jīng)功能缺損評分檢測 造模24 h后,根據(jù)Longa分級法〔9〕對各組神經(jīng)功能進(jìn)行檢測,大鼠行為無異常0分,出現(xiàn)不能完全伸展右前爪1分;行走出現(xiàn)右旋轉(zhuǎn)2分;行走出現(xiàn)右側(cè)傾倒3分;意識喪失,無行走能力4分。重復(fù)評定3次,取平均值作為最終評分,評分在1~3分說明模型制備成功。

    1.3.5水迷宮法檢測各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力 制作高水迷宮水池(直徑120 cm,高35 cm),水池分為四個象限,在第一象限內(nèi)設(shè)置一個高15 cm的平臺并連接攝像機(jī)系統(tǒng),將大鼠從第三象限放入水池中,記錄大鼠進(jìn)入水中穿過平臺的次數(shù),每天訓(xùn)練1次,訓(xùn)練3 d,第4天測定大鼠在一定時間內(nèi)穿過平臺的次數(shù)。

    1.3.6蘇木素-伊紅(HE)染色觀察各組海馬組織病理學(xué)變化 水迷宮實驗后,每組取5只大鼠,用水合氯醛(1 g/kg)麻醉處死大鼠,分離腦組織,用4%多聚甲醛固定,做常規(guī)石蠟切片,海馬吻合位置連續(xù)冠狀切片(4 μm)。用蘇木素-伊紅染液染色,每張切片選取5個視野,光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織海馬區(qū)病理學(xué)改變。

    1.3.7透射電鏡觀察各組大鼠海馬鈣化情況 每組選取5只大鼠,同1.3.6方法分離腦組織,按照電鏡常規(guī)操作制備超薄切片,每張切片選取5個視野,用透射電子顯微鏡觀察并采集圖片。

    1.3.8Western印跡法檢測各組海馬組織中NMDAR、ERK、p-ERK蛋白表達(dá) 提取海馬組織總蛋白,BCA法測其濃度,按蛋白30 μg/孔上樣進(jìn)行電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后分別加入一抗(抗NMDAR、ERK、p-ERK抗體,1∶1 000),4℃下過夜培養(yǎng),次日加二抗(1∶5 000),溫室中培養(yǎng)1 h,洗膜,電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色,用β-actin作內(nèi)參,掃描膠片,Tanon 600圖像分析系統(tǒng)分析條帶灰度值。

    1.4統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

    2 結(jié) 果

    2.1各組神經(jīng)功能缺損評分結(jié)果 與假手術(shù)組相比,模型組神經(jīng)功能缺損評分顯著升高(P<0.05);與模型組相比,尼莫地平組、天麻鉤藤飲低、高劑量組神經(jīng)功能缺損評分顯著降低(P<0.05);與尼莫地平組相比,天麻鉤藤飲低劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著升高(P<0.05);與天麻鉤藤飲低劑量組相比,天麻鉤藤飲高劑量組神經(jīng)功能缺損評分顯著降低(P<0.05)。見表1。

    2.2各組學(xué)習(xí)記憶能力檢測結(jié)果 與假手術(shù)組相比,模型組穿越平臺次數(shù)顯著降低(P<0.05);與模型組相比,尼莫地平組、天麻鉤藤飲低、高劑量組大鼠穿越平臺次數(shù)顯著升高(P<0.05);與尼莫地平組相比,天麻鉤藤飲低劑量組穿越平臺次數(shù)顯著降低(P<0.05);與天麻鉤藤飲低劑量組相比,天麻鉤藤飲高劑量組穿越平臺次數(shù)顯著升高(P<0.05)。見表1。

    表1 各組神經(jīng)功能缺損評分、學(xué)習(xí)記憶能力及海馬組織中NMDAR、ERK、p-ERK蛋白表達(dá)比較

    2.3各組海馬組織病理學(xué)變化 假手術(shù)組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊無明顯病理變化;模型組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞破裂、有空泡樣變,伴有炎性細(xì)胞浸潤;與模型組相比,尼莫地平組、天麻鉤藤飲低、高劑量組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理癥狀明顯減輕。見圖1。

    圖1 各組海馬組織HE染色圖(×400)

    2.4各組海馬鈣化情況 與假手術(shù)組相比,模型組海馬區(qū)神經(jīng)纖維出現(xiàn)不規(guī)則形狀結(jié)構(gòu),有密集堆積的針狀鈣化沉淀物形成;與模型組相比,尼莫地平組、天麻鉤藤飲低、高劑量組海馬區(qū)針狀鈣化沉淀物明顯減小。見圖2。

    圖2 各組海馬CA1區(qū)透射電子顯微鏡圖(×12 000)

    2.5各組海馬組織中NMDAR、ERK、p-ERK蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組相比,模型組海馬組織中NMDAR、p-ERK/ERK蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);與模型組相比,尼莫地平組、天麻鉤藤飲低、高劑量組海馬組織中NMDAR、p-ERK/ERK蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);與尼莫地平組相比,天麻鉤藤飲低劑量組海馬組織中NMDAR、p-ERK/ERK蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);與天麻鉤藤飲低劑量組相比,天麻鉤藤飲高劑量組海馬組織中NMDAR、p-ERK/ERK蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見表1、圖3。

    1~5:假手術(shù)組,模型組,尼莫地平組,天麻鉤藤飲低劑量組,天麻鉤藤飲高劑量組

    3 討 論

    缺血性腦血管病是腦血管疾病中常見疾病之一,腦組織長時間缺血恢復(fù)血流再灌注后會引起腦組織進(jìn)一步損傷,但腦缺血再灌注損傷的致病機(jī)制較為復(fù)雜,與細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、炎癥因子、自由基活性等多種環(huán)節(jié)密切相關(guān)〔10〕。腦缺血再灌注損傷會引起嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙,本研究大鼠神經(jīng)功能缺損評分與張吉芳等〔11〕研究結(jié)果一致,提示缺血再灌注損傷大鼠模型構(gòu)建成功。天麻鉤藤飲由天麻、鉤藤、石決明、山梔、黃芩等多種中藥組成,有平肝息風(fēng)、清降肝熱、補(bǔ)益肝腎、安神定志之功效〔12〕。天麻鉤藤飲在腦出血、腦梗死等腦血管疾病治療中發(fā)揮重要作用〔13〕。本研究結(jié)果提示天麻鉤藤飲可以緩解缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損,提高大鼠學(xué)習(xí)記憶力,且高劑量天麻鉤藤飲治療效果與尼莫地平相似〔14〕。

    海馬是位于大腦皮層內(nèi)褶區(qū),是腦組織中重要的結(jié)構(gòu)之一,主要負(fù)責(zé)機(jī)體的記憶和學(xué)習(xí),腦缺血再灌注損傷造成海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷,鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)〔15,16〕。本研究大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)比較結(jié)果與袁宇紅等〔17〕研究結(jié)果一致,提示缺血再灌注損傷會引起海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞鈣化等病變,推測缺血再灌注損傷大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷引起神經(jīng)功能缺損。天麻鉤藤飲可以減緩缺血再灌注損傷大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理癥狀及鈣化情況。

    NMDAR是一種谷氨酸離子型受體,NR2A和NR2B是NMDAR重要的亞基。研究顯示,缺血再灌注損傷引起機(jī)體谷氨酸異常增多,谷氨酸與其受體NMDAR結(jié)合啟動細(xì)胞鈣離子通道,使細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多造成鈣離子超載〔18,19〕。ERK屬于絲裂原活化蛋白激酶家族,參與調(diào)控細(xì)胞生長、分化、死亡等多種生理過程,Bruna等〔20〕研究顯示,ERK參與NMDAR介導(dǎo)的鈣離子釋放過程。本研究結(jié)果提示NMDAR蛋白表達(dá)及ERK磷酸化蛋白表達(dá)與缺血再灌注損傷發(fā)生密切相關(guān)。Zhao等〔21〕研究顯示,可以通過調(diào)節(jié)NR2B-ERK/CREB信號通路,改善腦缺血再灌注損傷組織病理學(xué)病變,對其神經(jīng)起保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn),天麻鉤藤飲可以調(diào)控NMDAR、ERK磷酸化蛋白表達(dá),抑制NMDAR/ERK信號通路激活,推測天麻鉤藤飲可能通過抑制NMDAR/ERK信號通路激活,改善腦缺血再灌注損傷組織病理學(xué)病變,減輕神經(jīng)損傷。

    綜上,天麻鉤藤飲可能通過抑制NMDAR/ERK信號通路激活,減輕海馬區(qū)鈣化,緩解腦損傷病理癥狀,提高腦缺血再灌注損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,但缺血再灌注損傷的致病機(jī)制較為復(fù)雜,天麻鉤藤飲對其治療作用及具體作用機(jī)制需進(jìn)一步驗證。

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