活性維生素D3對(duì)糖尿病腎病大鼠血脂代謝、腎臟形態(tài)、TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)的影響

蘇亞 李小鳳 李輝 張哲

(陜西省人民醫(yī)院，陜西 西安 710068)

糖尿病腎病(DN)是一種慢性微血管并發(fā)癥，其在2型糖尿病(DM)中最為常見(jiàn)，DN是導(dǎo)致終末期腎病的主要因素〔1〕。DN發(fā)生時(shí)會(huì)發(fā)生一些列病理改變，如腎小管間質(zhì)發(fā)生纖維化、腎小球系膜區(qū)無(wú)細(xì)胞性增寬、腎小球基底彌漫性增厚等〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)，隨著人們飲食攝入的糖量過(guò)高而導(dǎo)致DN的發(fā)病率逐年上漲，并且對(duì)患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重威脅。目前有研究提示，維生素D的缺乏是DN發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素，補(bǔ)充維生素D及其類似物能通過(guò)多種途徑發(fā)揮腎臟保護(hù)作用〔3〕?；钚跃S生素D3有相對(duì)廣泛的生物學(xué)作用，如對(duì)鈣磷代謝及細(xì)胞的生物學(xué)活性均能進(jìn)行可有效地進(jìn)行調(diào)節(jié)，因此在臨床上活性維生素D3對(duì)腎臟的保護(hù)作用也受到了廣泛的關(guān)注〔4〕。有研究發(fā)現(xiàn)，血清中1,25-二羥維生素D3的水平介導(dǎo)著炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展，還可對(duì)腎臟進(jìn)行有效的保護(hù)，可見(jiàn)增加1,25-二羥維生素D3水平可有效抑制炎癥疾病中炎癥因子表達(dá)，進(jìn)而改善DN的發(fā)生發(fā)展〔5〕，但活性維生素D3具體的作用機(jī)制尚不明確。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1在機(jī)體中以3種異構(gòu)體構(gòu)成，即TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，在機(jī)體的腎小球和腎小管上皮細(xì)胞中分布較為廣泛。有學(xué)者在DN動(dòng)物體和患者的血漿、腎組織和尿液中均檢測(cè)到了TGF-β1的存在，且發(fā)生了異常的高表達(dá)〔6,7〕。研究顯示，TGF-β1可通過(guò)對(duì)細(xì)胞的生物活性進(jìn)行調(diào)節(jié)，同時(shí)刺激細(xì)胞的合成整合素，讓細(xì)胞之間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用得到促進(jìn)，進(jìn)而影響DN的發(fā)生發(fā)展〔8〕。但目前活性維生素D3對(duì)TGF-β1的調(diào)控還沒(méi)有明確的報(bào)道，本文探討活性維生素D3對(duì)DN大鼠血脂代謝、腎臟組織及TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用健康雄性SD大鼠，均由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，共65只。大鼠體重為225～275 g，大鼠禁食，自由飲水，適應(yīng)1 w新的環(huán)境。

1.2試劑和儀器 試劑和儀器分別為上海羅氏制藥公司生產(chǎn)的活性維生素D3，美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)的鏈脲佐菌素(STZ)；Santa Cruz公司生產(chǎn)的兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體；北京博奧森公司生產(chǎn)的全自動(dòng)生化儀；北京全式金生物有限公司生產(chǎn)的Trizol和實(shí)時(shí)定量(RT)-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒；北京中杉金橋生物工程有限公司生產(chǎn)的免疫熒光試劑盒；淮北正華生物儀器有限公司生產(chǎn)的大鼠代謝籠；大連競(jìng)邁生物公司生產(chǎn)的凝膠成像分析儀。

1.3實(shí)驗(yàn)分組與模型建立 實(shí)驗(yàn)前所有大鼠禁食12 h，隨機(jī)取出45只大鼠一次性腹部注射STZ溶液，每千克大鼠注射60 mg，其中STZ溶液是由pH值為4.5的檸檬酸鹽緩沖液配制而成，其中檸檬酸鹽含量為0.1 mol/L。72 h后采取大鼠的尾靜脈血液，測(cè)量空腹血糖。DN模型制備成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠血糖值≥16.7 mmol/L，本實(shí)驗(yàn)共41只大鼠制備DN模型成功。將41只大鼠隨機(jī)分為DN組(20只)，活性維生素D3(VDR)組(21只)。將剩下的20只大鼠設(shè)為正常對(duì)照(NC)組。造模成功后，將活性維生素D3溶于0.5 ml的花生油，VDR組每天每只大鼠0.03 μg灌胃干預(yù)；用等量的花生油灌胃NC組和DN組大鼠。所有大鼠自由飲食攝水，實(shí)施光照12 h一循環(huán)，共干預(yù)8 w。

1.4收集標(biāo)本 收集各組大鼠處死前1 d的24 h尿液，用代謝籠收集并記錄24 h總尿量。實(shí)驗(yàn)干預(yù)8 w后處死各組大鼠，處死大鼠前稱重并記錄體重。麻醉所有大鼠后，剖胸將心臟暴露在外，收集2 ml左心室血液用于生化測(cè)定。取出腎組織，部分用于免疫組化和蘇木素-伊紅(HE)染色；部分用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)。

1.5體重、血糖、腎指數(shù)檢測(cè) 分別測(cè)量3組給藥干預(yù)后4、8 w的體重和血糖值。取大鼠雙側(cè)腎臟，稱量腎重量，計(jì)算大鼠腎臟指數(shù)。

1.6生化指標(biāo)檢測(cè) 采用全自動(dòng)的生化分析儀檢測(cè)24 h尿蛋白定量、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)和肌酐清除率(CCr)。

1.7血脂指標(biāo)檢測(cè) 分別抽取3組大鼠空腹12 h靜脈血，檢測(cè)三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。

1.8腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察 分別將實(shí)驗(yàn)大鼠處死，具體操作如下：取出大鼠的腎皮質(zhì)，用甲醛將腎皮質(zhì)固定1 d，切片，厚度為3 μm，將組織進(jìn)行HE染色后進(jìn)行觀察。

1.9Western印跡檢測(cè)腎組織中TGF-β1 蛋白的表達(dá) 分別取3組大鼠50 mg腎組織，用Western印跡裂解液裂解，用玻璃均漿器在冰上對(duì)組織進(jìn)行研磨，30 min后以每分鐘12 000 r的速度離心5 min，取上清液，蛋白濃度用二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行檢測(cè)，在每孔中加入50 μg的蛋白樣品，根據(jù)蛋白濃度計(jì)算樣本體積。把濃縮的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)緩沖液加入到上清液中，加熱上清液，5 min后在預(yù)制的膠孔中吧蛋白樣本加入，在封閉的環(huán)境中孵育。1 h后加入一抗，TBST溶液將蛋白樣品清洗3次，凝膠成像系統(tǒng)曝光成像，進(jìn)一步分析。

1.10實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)腎組織中TGF-β1 mRNA表達(dá) 分別取3組大鼠50 mg腎組織，用Trizol裂解液將組織裂解，而后提取組織中總的RNA。引物序列為：TGF-β1 mRNA正向引物：5′-AGAAGTCACCCGCGTGCTAT-3′，反向：5′-CACTGCTTCCCGAATGTCTGA-3′；β-actin mRNA正向引物：5′-AGTACCCCATTGAACACGGC-3′，反向：5′-CACTGCTTCCCGAATGTCTGA-3′。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性2 min；95℃預(yù)變性15 s；60℃退火1 min，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。AT1R、Smad3 mRNA相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.13組體重、血糖、腎指數(shù)比較 與NC組體重相比，DN組在給藥后4 w和8 w均顯著降低(P<0.05)；干預(yù)后VDR組體重較DN組明顯回升(P<0.05)。與NC組腎指數(shù)和血糖相比，DN組給藥4 w和8 w均明顯升高(P<0.05)；與DN組相比，VDR組腎指數(shù)和血糖均顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 3組體重、腎指數(shù)和血糖水平比較

2.23組生化指標(biāo)檢測(cè) 與NC組比較，DN組BUN、SCr、CCr和24 h尿蛋白水平均顯著升高(P<0.05)；經(jīng)過(guò)治療的VDR組生化指標(biāo)均顯著低于DN組(均P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.33組血脂指標(biāo)比較 與NC組相比，DN組血脂指標(biāo)TC、TG和LDL-C均顯著升高，HDL-C指標(biāo)顯著降低(P<0.05)；干預(yù)后VDR組血脂指標(biāo)相比DN組明顯改善(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 3組給藥8 w后BUN、SCr、CCr、24 h尿蛋白及血脂指標(biāo)TC、TG、LDL-C和HDL-C比較

2.43組腎臟組織形態(tài)比較 和NC組相比較，DN組腎小球體積明顯增大，腎系膜區(qū)細(xì)胞的數(shù)量較NC組也顯著增多，間質(zhì)間大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，且腎小管嚴(yán)重腫脹，腎小管的排列也沒(méi)有規(guī)則；干預(yù)治療后VDR組腎組織形態(tài)較DN組明顯改善，見(jiàn)圖1。

圖1 3組腎組織形態(tài)(HE染色，×400)

2.53組腎組織中TGF-β1蛋白表達(dá)比較 和NC組(1.05±0.07)相比，DN組腎組織中TGF-β1蛋白表達(dá)(1.58±0.13)明顯升高(P<0.05)；干預(yù)后VDR組腎組織中TGF-β1蛋白表達(dá)(1.24±0.11)明顯低于DN組(均P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 3組TGF-β1蛋白表達(dá)

2.63組腎組織中TGF-β1 mRNA表達(dá)比較 與NC組(0.21±0.01)相比，DN組腎組織中TGF-β1 mRNA表達(dá)(0.63±0.07)顯著升高(P<0.05)；與DN組相比，VDR組腎組織中TGF-β1 mRNA表達(dá)(0.37±0.04)明顯降低(P<0.05)。

3 討 論

目前，我國(guó)糖尿病患者已成為世界上最多的國(guó)家。醫(yī)療技術(shù)水平隨著社會(huì)的發(fā)展而不斷地提升，人均壽命也明顯得到了延長(zhǎng)，2型DM患者的患病率也隨之增長(zhǎng)。當(dāng)機(jī)體內(nèi)糖代謝發(fā)生異常而導(dǎo)致DM的發(fā)生，累及到腎臟時(shí)會(huì)導(dǎo)致DN的發(fā)生；DN患者腎功能一旦發(fā)生異常，其病情較腎功能正?；颊呙黠@嚴(yán)重，且患者的預(yù)后情況也明顯變差〔1,2〕。目前臨床上治療DN的手段非常有限，因此有效的治療方法就顯得尤為重要。臨床研究表明，活性維生素D3對(duì)鈣磷代謝有一定的調(diào)節(jié)作用，還可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)活性，介導(dǎo)免疫疾病，有效的保護(hù)腎臟〔9〕，但具體的作用機(jī)制尚不明確。目前有研究證實(shí)了TGF-β1可通過(guò)抑制細(xì)胞的惡性生物學(xué)活性，誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)等途徑，進(jìn)而改變DN的發(fā)生發(fā)展〔10〕。但活性維生素D3對(duì)TGF-β1的調(diào)控作用還有待探究。

有研究表明，血脂異常是導(dǎo)致DN患者病情加重的重要原因之一，還有一些學(xué)者提出，脂代謝異常是DN代謝紊亂的根源〔11〕。因此對(duì)于DN患者除了注意控制血壓和血糖外，也應(yīng)該嚴(yán)格控制血脂的含量。本研究結(jié)果提示，活性維生素D3能對(duì)肝細(xì)胞表面的LDL的受體數(shù)目進(jìn)行調(diào)節(jié)，增加受體使得LDL的運(yùn)轉(zhuǎn)增加，降低血中LDL水平。維生素D是一種脂溶性的類固醇衍生物，來(lái)源于動(dòng)物性食物中所含的膽骨化醇(維生素D3)、植物性食物中所含有的麥角骨化醇(維生素D2)及皮膚中的7-脫氫膽固醇經(jīng)太陽(yáng)紫外線β射線照射迅速轉(zhuǎn)化而得到的維生素D3〔12〕。維生素D3本身沒(méi)有生物活性，必須經(jīng)肝臟25-羥化酶系的催化下生成25(OH)D3，再在腎臟1α-羥化酶系的催化下進(jìn)一步羥化成1,25(OH)D3，這是維生素D3起生理作用的基本形式〔13〕。有研究發(fā)現(xiàn)維生素D的缺乏可增加DN的患病風(fēng)險(xiǎn)，而補(bǔ)充維生素D制劑可降低DN患病風(fēng)險(xiǎn)〔14〕。本研究結(jié)果說(shuō)明，活性維生素D3能改善DN大鼠腎組織的病理改變，高晶〔15〕研究發(fā)現(xiàn)，VDR基因敲除的DN大鼠比超重的DN大鼠有更為嚴(yán)重的蛋白尿，同時(shí)在電子顯微鏡下觀察到腎小球基底膜增厚和足細(xì)胞丟失，多伴有腎小球硬化。

維生素D3對(duì)系膜增生性腎炎模型大鼠腎組織中TGF-β1的表達(dá)及Ⅰ型、Ⅳ型膠原和α平滑激動(dòng)蛋白的表達(dá)進(jìn)行有效的抑制，進(jìn)而機(jī)制系膜細(xì)胞的增殖和腎小球的硬化〔16,17〕。本研究結(jié)果表明，活性維生素D3可通過(guò)下調(diào)TGF-β1表達(dá)在DN發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮保護(hù)作用。楊瑞鳳等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)，維生素D3可抑制維生素D受體敲除DM模型大鼠RAS系統(tǒng)及系膜細(xì)胞、近球細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)，進(jìn)而減少尿蛋白，抑制腎小球肥大及腎小球硬化。

綜上，活性維生素D3可改善DN大鼠血脂代謝和腎組織形態(tài)，對(duì)腎組織中TGF-β1 mRNA的表達(dá)進(jìn)行抑制，從而發(fā)揮對(duì)DN腎組織的保護(hù)作用。