超高效液相色譜-熒光法測定蜂蜜中百里香酚的殘留量

錢振杰，曾 羲,*，陳 敬，趙 悅，游淑珠，何詠欣，馮家望

（1.廣州市食品檢驗所，廣東 廣州 511400；2.拱北海關(guān)技術(shù)中心，廣東 珠海 519000）

百里香酚（Thymol）又名麝香草酚，是香芹酚（Carvacrol）的同分異構(gòu)體，普遍存在于百里香屬植物及其提取精油中[1]，具有抗菌、消炎、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等功效[2-4]，是一種低毒的天然單萜酚[5]。百里酚的抑螨率高、對蜂群傷害率低，可有效防控蜂巢瓦螨[6]，在養(yǎng)蜂業(yè)廣泛使用。歐盟認為百里香酚屬于無毒性獸藥[7]，美國、加拿大和澳洲還未規(guī)定其最大殘留限量（Maximum residue limit，MRL）。日本將百里香酚納入寄生蟲驅(qū)蟲劑管理，規(guī)定蜂蜜中百里香酚的限量值為30 mg/kg[8]。此外，由于百里香酚具有強烈的辛辣氣味，人類對其味覺閾值介于1.1～1.3 mg/kg 之間[9]，為避免過量百里香酚殘留改變蜂蜜自身風味，瑞士規(guī)定蜂蜜中百里香酚的最大殘留量為0.8 mg/kg[10]。國內(nèi)尚無針對蜂蜜中百里香酚的檢測標準，對蜂蜜等產(chǎn)品中百里香酚殘留檢測方法的報道較少。我國是蜂產(chǎn)品生產(chǎn)第一大國[11]，為了保障市場銷售產(chǎn)品的質(zhì)量安全，促進蜂產(chǎn)品出口貿(mào)易的順利進行，建立一種能夠簡單、快捷、準確測定蜂蜜中百里香酚的分析方法十分必要。

目前，針對百里香酚的分析方法主要有電化學法[12-14]、氣相色譜法[15-18]、液相色譜法[19-21]等。其中，電化學法尚處于理論研究階段，應用范圍有限；氣相色譜法使用的火焰離子化檢測器靈敏度較低[22]，需要配合預濃縮[23]，或配套價格昂貴的質(zhì)譜檢測器[24]、普及率低的頂空進樣器[25]等特殊設(shè)備才能獲得滿意的測定效果；而且由于蜂蜜中葡萄糖、果糖[26]占60%～80%，使用氣相色譜常用的有機溶劑提取時，基質(zhì)中的糖類易析出造成沉淀、結(jié)塊，降低提取效率，影響了氣相法的普及。液相法使用的含水提取劑和流動相與蜂蜜高糖基質(zhì)的兼容性更高，但也受限于二極管陣列檢測器（Diode array detector，DAD）的低靈敏度[27]，仍需要借助質(zhì)譜[28]或特殊前處理方式[29]才能到達足夠的靈敏度。熒光檢測器（Fluorescence detector，F(xiàn)LD）因具有選擇性好、靈敏度高的優(yōu)點，已被報道用于百里香酚殘留的測定[30]。但是，現(xiàn)有文獻中對前處理和分離條件的優(yōu)化討論有限，未充分考慮到復雜基質(zhì)中強保留物質(zhì)（如：微量蛋白、蜂蠟等）的洗脫，關(guān)鍵是不能區(qū)分常見酚類異構(gòu)體（如：香芹酚等）的干擾，難以實現(xiàn)實際樣品中百里香酚的高通量準確定性、定量分析。本研究擬采用超高效液相色譜-熒光檢測技術(shù)對蜂蜜中百里香酚殘留進行檢測。通過優(yōu)化前處理方法、色譜分離與檢測條件，建立一種簡單、可靠，技術(shù)指標能夠滿足出口蜂蜜中百里香酚殘留量測定的標準方法，為蜂蜜中百里香酚殘留量的監(jiān)控提供有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蜂蜜（雪脂蓮蜜、椴樹蜜、玄參蜜、洋槐蜜和百花蜜） 市場購買獲得；百里香酚 標準品，純度99.69%，德國Dr. Ehrenstorfer 公司；丹皮酚、丁香酚、異丁香酚和香芹酚 純度大于99.0%，上海阿拉丁公司；乙腈、甲醇 色譜純，美國Thermo 公司；甲酸 分析純，廣州化學試劑廠；實驗室用水為超純水。

Acquity UPLC 超高超效液相色譜儀（配備DAD及FLD）、Oasis PRiME HLB 凈化柱（3 mL，60 mg）美國Waters 公司；QuEChERS dSPE 凈化管（含600 mg MgSO4，100 mg PSA，40 mg C18） 上海CNW公司；ME203E 分析天平 感量0.001 g，瑞士梅特勒-托利多公司；CP225 D 分析天平 感量為0.01 mg，德國Sartorius 公司；2600TH 超聲清洗器 上海安譜公司；Allegra X-30R 高速離心機 德國貝克曼公司；MS 3 渦旋振蕩器 德國IKA 公司；Milli-Q Academic 超純水制備儀 美國密理博公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制 準確稱取20.0 mg（精確至0.1 mg）百里香酚標準品，用甲醇溶解、混勻并定容至10 mL 容量瓶，得到濃度為2.00 g/L 的標準儲備液，再準確量取0.250 mL 百里香酚標準儲備溶液，用甲醇稀釋并定容至50 mL，得到濃度為10.0 μg/mL的標準中間液，于4 ℃冰箱中避光保存，臨用時準確量取百里香酚標準中間溶液，用40%乙腈水溶液稀釋，依次配制成質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、3.00 μg/mL 的標準系列溶液。

1.2.2 樣品前處理 準確稱取蜂蜜樣品2.5 g（精確到0.001 g）于25 mL 具塞比色管中，加入乙腈-水（v/v=40:60）溶液定容，振蕩5 min 后，用8000 r/min離心5 min，取上清液過0.45 μm 有機相濾膜，供上機測定。

1.2.3 凈化方法

1.2.3.1 凈化柱凈化 依次用3 mL 乙腈和3 mL水對PRiME HLB 柱進行活化，取1.2.2 步驟中所得上清液3 mL 上柱，用3 mL 水進行淋洗，棄去全部淋出液，抽干。然后用3 mL 乙腈進行洗脫。將洗脫液在40 ℃下氮吹至近干，加入40%乙腈-水溶液溶解殘渣并定容至3 mL，取上清液過0.45 μm 有機相濾膜，供上機測定[31]。

1.2.3.2 凈化管凈化 取1.2.2 步驟中所得上清液5 mL，置于QuEChERS dSPE 凈化管中渦旋混合3 min，在4 ℃條件下，8000 r/min 離心5 min。上清液過0.45 μm 有機相濾膜，供上機測定[32]。

1.2.4 儀器條件 Thermo Accucore aQ 液相色譜柱（150 mm×2.1 mm×2.6 μm）；流動相A 為0.1%甲酸水，流動相B 為乙腈，洗脫梯度為0～6.5 min，60%A；6.5～7.0 min，60%～10% A；7.0～9.0 min，10% A；9.0～9.1 min，10%～60% A；9.1～12.0 min，60% A；流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣量為5 μL；DAD測定波長為274 nm；FLD 激發(fā)波長為274 nm，發(fā)射波長為297 nm。

1.2.5 測定 分別吸取百里香酚標準系列溶液及樣品提取液注入液相色譜，在1.2.4 條件下測定。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標制作標準曲線，由標準曲線得到試樣中百里香酚的濃度，根據(jù)保留時間定性，峰面積定量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)通過沃特世Empower 3.0 軟件采集，導出原始數(shù)據(jù)后采用SPSS 25 統(tǒng)計軟件與Excel 2016 軟件進行單因素試驗圖形繪制與分析（單變量，一般線性模型；置信值95%，P＜0.05 為顯著性差異）。前處理和分析條件優(yōu)化中的回收率的計算均采用3 個平行樣品取平均值計算，精密度選擇低、中、高3 個濃度，每個濃度梯度取連續(xù)采集6 次數(shù)據(jù)的峰面積進行相對標準偏差RSD 值的計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇 在空白蜂蜜樣品中加入10.0 mg/kg 百里香酚標準品，采用水、甲醇、乙腈及乙腈-水（v/v=40:60）等4 種提取溶劑進行回收率實驗，結(jié)果見圖1。實驗表明，乙腈-水的回收率最高，達97.2%；甲醇的回收率為92.7%，乙腈和水的回收率分別為63.1%和58.0%。使用SPSS 25 軟件對提取溶劑種類及回收率情況進行顯著性分析，4 種提取溶劑之間具有顯著性差異（P＜0.05）。此外，甲醇提取液會帶入較多的干擾雜質(zhì)影響后續(xù)色譜分離效果。經(jīng)綜合考慮，最終選擇乙腈-水作為提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑的回收率（n=3）Fig.1 Recoveries of different solvents for thymol (n=3)

2.1.2 凈化方式的選擇 在空白蜂蜜樣品中加入10.0 mg/kg 百里香酚標準品，并測定回收率，液液萃取法（LLE）、PRiME HLB 固相萃?。⊿PE）和QuEChERS 法等3 種凈化方式的回收結(jié)果見圖2。使用SPSS 25 軟件進行顯著性分析，結(jié)果表明Qu EChERS 法與其他兩組方式存在顯著性差異（P＜0.05），LLE 法與SPE 法之間不存在顯著性差異（P＞0.05）且平均回收率明顯優(yōu)于QuEChERS 法。但是SPE 法需要經(jīng)過復雜的操作，效率較低且需消耗大量有機溶劑。綜合考慮實驗操作簡便性和提取凈化效率，最終采用乙腈-水（v/v=40:60）液液萃取的直接凈化方式。

圖2 不同凈化方式的回收率（n=3）Fig.2 Recoveries of different purification methods for thymol (n=3)

2.2 分離條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇 蜂蜜中除百里酚香外還可能含有丹皮酚、丁香酚、異丁香酚和香芹酚等其他天然驅(qū)蟲效果的精油成份[33]，其中香芹酚和百里香酚為同分異構(gòu)體。因此，需要充分考慮其他天然酚類對百里香酚測定的影響，以避免實際樣品檢測中出現(xiàn)定性不準確。實驗考察了五氟苯基（PFP）柱、普通C18柱、親水作用（hilic）柱和極性封端（aQ）柱對百里香酚及其干擾物的分離效果，以提高百里香酚分析檢測的準確性和可靠性，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，aQ 柱對5 種酚類物質(zhì)的分離效果最佳，且對香芹酚和百里香酚的選擇性不同，峰型尖銳，有利于對百里香酚的定性定量測定，故選用aQ 柱作為百里香酚測定的色譜柱。

圖3 4 種色譜柱對酚類混合物（1.0 μg/mL）的分離色譜圖Fig.3 Chromatograms of 4 kinds of chromatographic column for mixed phenolic compounds at 1.0 μg/mL

2.2.2 流動相的選擇 本研究選取甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水等4 種流動相考察其對天然酚類化合物的識別和分離能力（見圖4）。結(jié)果表明，不同有機相對5 種酚類物質(zhì)的分離效果影響較大，選用乙腈作為流動相對香芹酚和百里香酚的分離效果明顯優(yōu)于使用甲醇的流動相。

圖4 4 種流動相對酚類混合物（1.0 μg/mL）的分離色譜圖Fig.4 Chromatograms of 4 kinds of mobile phase for mixed phenolic compounds at 1.0 μg/mL

此外，實際樣品測試中還發(fā)現(xiàn)不同類型蜂蜜中百里香酚的保留時間會因基質(zhì)pH 不同出現(xiàn)漂移，在流動相內(nèi)加酸可有效降低此現(xiàn)象的發(fā)生。但百里香酚的熒光響應強度隨酸濃度的增加出現(xiàn)降低。本研究使用不同甲酸比例的水溶液做流動相A，評估百里香酚保留時間及不同酸濃度下峰面積相對于不加酸時峰面積的變化率，結(jié)果如圖5 所示。當甲酸含量在0%～0.2%時峰面積變化緩慢，當甲酸含量大于0.2%時百里香酚峰面積降低明顯加快，因此在流動相中選擇加入0.2%以下的甲酸，試驗過程中發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸濃度亦能保證百里香酚保留時間的穩(wěn)定性。綜合考慮分離效果、提取溶劑和實驗操作穩(wěn)定性，最終選擇0.1%甲酸水-乙腈作為本研究的流動相。

圖5 不同甲酸濃度下百里香酚（1.0 μg/mL）峰面積和保留時間的變化Fig.5 Changes in peak area and retention time of thymol(1.0 μg/mL) at different concentrations of formic acid

2.2.3 有機相比例的確定 在實際蜂蜜樣品分析測定中，最大的干擾來自于百里香酚的同分異構(gòu)體香芹酚，流動相比例對香芹酚和百里香酚的分離度起著重要作用。實驗通過優(yōu)化流動相中乙腈和水的比例進一步考察了香芹酚和百里香酚的分離度，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，隨著流動相中乙腈比例的增加，香芹酚和百里香酚分離度逐漸降低，當乙腈濃度達45%時，兩者恰好達到基線分離（R=1.5）。為確保同分異構(gòu)體的分離效果和結(jié)果的準確度，實驗最終選擇40%的乙腈濃度作為流動相起始比例。

圖6 不同比例乙腈下香芹酚和百里香酚的分離度Fig.6 Resolution of carvacrol and thymol in the presence of different concentrations of acetonitrile

2.2.4 檢測波長的選擇 將百里香酚制成1.00 μg/mL標準溶液，使用DAD 確定百里香酚的最大吸收波長為220 nm，第二吸收波長為274 nm，結(jié)果如圖7 所示；使用FLD 對其最佳激發(fā)和發(fā)射波長進行優(yōu)化，得到百里香酚熒光檢測的最佳激發(fā)和發(fā)射波長分別為274 nm 和297 nm，結(jié)果如圖8 所示。

圖7 百里香酚的紫外吸收光譜Fig.7 UV absorption spectrum of thymol

圖8 百里香酚的熒光激發(fā)-發(fā)射光譜Fig.8 Fluorescence excitation-emission spectrum of thymol

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性關(guān)系、范圍和定量限 實驗以百里香酚響應值的峰面積為縱坐標（Y），以百里香酚溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標（X），繪制標準工作曲線，得到百里香酚的線性范圍、線性回歸方程和決定系數(shù)；以儀器3 倍信噪比對應的百里香酚濃度作為儀器檢出限，以10 倍信噪比對應的百里香酚濃度作為儀器定量限，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，百里香酚在0.01～3.00 μg/mL 線性范圍內(nèi)決定系數(shù)（R2）達0.9999，線性關(guān)系良好，方法的LOD 和LOQ 分別為0.03 mg/kg和0.10 mg/kg。

表1 百里香酚的線性范圍、線性回歸方程、決定系數(shù)、檢出限和定量限Table 1 Linear range, linear equation, correlation coefficients,limit of detection (LOD) and limit of quantitation(LOQ) of thymol

2.3.2 回收率與精密度 實驗選取雪脂蓮蜜、椴樹蜜、玄參蜜、洋槐蜜和百花蜜等5 種代表性蜂蜜空白樣品作為基質(zhì)，在本方法定量限、日本最大殘留限量及瑞士標準要求等3 個水平進行加標回收實驗，加標量分別為0.1、0.8、30 mg/kg，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，在5 種蜂蜜樣品基質(zhì)中的平均加標回收率為87.4%～106.9%，方法精密度為0.7%～7.3%。

表2 百里香酚的加標回收率和精密度（n=6）Table 2 Spiked recoveries and relative standard deviations(RSDs) of thymol (n=6)

2.3.3 實際樣品分析 利用所建立的方法對市場上銷售的48 批次蜂蜜樣品進行檢測，其中包含養(yǎng)殖場原料蜂蜜15 個、混合花種蜂蜜13 個、單一花種蜂蜜20 個。結(jié)果顯示，僅有1 個百花蜜樣品檢出百里香酚殘留，濃度為0.20 mg/kg，其典型色譜圖如圖9 所示。

圖9 陽性樣品的色譜圖Fig.9 Chromatogram of positive sample

3 結(jié)論

本研究建立了一種蜂蜜中百里香酚殘留量的高效液相色譜-熒光檢測器檢測方法，對提取溶劑、凈化方式和分析條件進行優(yōu)化并對整個實驗過程的穩(wěn)健性進行了方法學驗證。該方法的定量限為0.10 mg/kg，百里香酚在0.10～30.0 mg/kg 添加水平下，回收率為87.4%～106.9%，方法精密度為0.7%～7.3%，目標峰可與其同分異構(gòu)干擾物達到基線分離。通過對市售蜂蜜產(chǎn)品的測試，僅一個批次樣品檢出微量百里香酚殘留，說明國內(nèi)市場蜂蜜樣品中百里香酚殘留水平很低。本方法操作簡單、選擇性好，抗干擾性強，可滿足日常工作中對蜂蜜中百里香酚殘留量測定的需要，能為我國蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評價提供技術(shù)補充，有利于促進出口和保障國民身體健康。