熱處理方式對蝦青素強化雞蛋消化特性的影響

顧璐萍，范 巧，李俊華，常翠華，楊嚴俊，蘇宇杰,*

（1.食品科學與技術國家重點實驗室（江南大學），江蘇 無錫 214122；2.國家功能食品工程技術研究中心（江南大學），江蘇 無錫 214122；3.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

蝦青素是一種含氧類胡蘿卜素，具有著色、抗氧化、提高免疫力、預防皮膚癌、預防糖尿病和黃斑退化、改善動脈硬化、預防心血管疾病、抗炎癥等功能[1-3]。但人體自身不能合成蝦青素，需從外界食物中攝取。天然食物中（以雨生紅球藻為主）蝦青素以酯化型為主，具有較高的穩(wěn)定性，但生物利用率不高，且價格昂貴[4-7]，而合成型蝦青素在安全性、功效性方面不如天然蝦青素[8]。

以蛋雞作為載體，通過生物富集形式生產蝦青素營養(yǎng)強化雞蛋，成為獲得天然安全且高生物利用率蝦青素的新途徑。據文獻報道，在飼料中添加富含酯化型蝦青素的雨生紅球藻，蛋雞可將蝦青素轉化為游離態(tài)且沉積到蛋黃中，提升雞蛋的營養(yǎng)價值，加深蛋黃顏色，且這種形式的蝦青素生物利用度較高[9-11]。同時，蝦青素還具有增強動物免疫力，緩解老年蛋雞卵巢衰退等功能[12]。此外，雞蛋含有豐富的優(yōu)質蛋白，蛋黃中含有豐富的卵磷脂、固醇類、礦物質及維生素[13-15]，是一種營養(yǎng)價值很高的食物。因此，雞蛋可作為蝦青素的一種理想來源。雞蛋通常是經過加熱后食用，比如煮蛋和煎蛋，煮蛋又可以根據受熱程度不同可分為溫泉蛋、溏心蛋和全熟蛋，但是經不同熱處理方式獲得的蝦青素強化蛋制品的研究鮮見報道。

鑒于此，本文通過對比溫泉蛋、溏心蛋、全熟蛋、煎蛋四種不同熱處理方式對蝦青素強化雞蛋的穩(wěn)定性的影響，并構建體外消化模型對其脂肪消化率、蛋白質消化率、蝦青素的生物可給率等因素進行分析，旨在為消費者提供一個安全有效補充蝦青素的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

考馬斯亮藍G-250、十二烷基硫酸鈉、過氧化氫異苯丙、三氯甲烷（氯仿）、牛血清白蛋白、聚丙烯酰胺、色譜級甲基叔丁基醚、色譜級乙酸乙酯 國藥集團化學試劑有限公司；色譜級甲醇、色譜級四氫呋喃、AST 標準品（98%）、細胞色素C、牛胰島素、桿菌肽、谷胱甘肽、甘氨酸 上海泰坦科技股份有限公司；胃蛋白酶（2.5×105U/g）、脂肪酶（1×104U/g）、胰酶（8×103U/g）、豬膽鹽 Sigma-Aldrich 公司；即用型蛋白質分子量標準（Premixed protein marker，high）、蛋白質SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液（2×） 寶生物科技有限公司；基礎飼糧 山東福星飼料有限公司。

ME104TE/00 電子天平 梅特勒托利多科技（中國）有限公司；EJ28M4 不粘煎鍋 浙江蘇泊爾股份有限公司；ORKAEA-01 蛋品質分析儀 以色列ORKA 食品科技有限公司；5430R 高速離心機 德國Eppendorf 公司；THS-15 數控超級恒溫槽 寧波天恒儀器有限公司；UV-2600 紫外分光光度計 日本島津公司；Waters e2695 高效液相色譜儀 美國Waters 公司；Power Pac 凝膠電泳裝置、ChemiDoc XRS+化學凝膠成像儀 美國Bio-Rad 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蝦青素強化雞蛋的生產 蝦青素強化雞蛋的生產在山東松山島食品科技有限公司進行。選取120 只300 日齡海蘭雞，隨機分為2 組（實驗組，對照組）。飼喂周期為6 周，預飼期一周內兩組均飼喂基礎飼糧，接下來對照組繼續(xù)飼喂基礎飼糧，實驗組在基礎飼糧中添加1.5%雨生紅球藻（蝦青素含量為220 mg/kg），飼喂5 周。蛋雞采用單籠飼養(yǎng)，自由飲水與飲食，每日光照時間16 h，養(yǎng)雞場溫度控制在22～25 ℃?；A飼糧的配方組成及營養(yǎng)水平為（風干基礎）：玉米（61.8%）、豆粕（24.2%）、小麥麩（5.5%）、石灰石（5.5%）、鹽（1.2%）、L-賴氨酸（0.6%）、DL-蛋氨酸（0.3%）、預混物（1.0%）、粗蛋白（17.8%）、總磷（0.4%）、鈣（3.0%）、代謝能（2702 kcal/kg）。注：a.預混物為每千克飼料提供：VA（10000 IU）、VB1（5.0 mg）、VB2（18.0 mg）、VB3（32.5 mg）、VB6（5.0 mg）、VB12（0.2 mg）、VD3（5000.0 IU）、VE（200.0 IU）、生物素（4.0 mg）、葉酸（1.0 mg）、鐵（0.2 g）、錳（0.2 g）、鋅（0.1 g）、硒（4.0 mg）；b.代謝能為計算值，其它成分含量為測量值。

1.2.2 蝦青素強化雞蛋品質的測定 利用電子天平稱量并記錄雞蛋重量（g），采用蛋品質分析儀測定蛋黃顏色和雞蛋的哈夫單位，參照食品安全國家標準GB/T 5009.5-2016《食品中蛋白質的測定》測定雞蛋中蛋白質含量，參照食品安全國家標準GB/T 5009.6-2016《食品中脂肪的測定》測定雞蛋中脂肪含量，參照Dansou 等[16]的方法測定蛋黃中的蝦青素含量。首先，稱取1.00 g 蛋黃樣品，向其中加入5 mL 四氫呋喃/甲醇（1:1，v/v），渦旋2 min，然后將離心管置于60 ℃水浴鍋中保溫20 min，向其中加入5 mL 乙酸乙酯，然后再次渦旋2 min，隨后將提取液在4 ℃下以4000×g 轉速離心5 min。離心結束后，將上清液通過0.22 μm 微孔過濾膜過濾到高效液相色譜棕色小瓶中待測。液相條件如下，色譜柱：YMC C30（250 mm×4.6 mm，5 μm，日本YMC 公司）；柱溫：25 ℃；流動相：甲醇/叔丁基甲基醚/水，比例為78:14:8（v/v/v），等度洗脫；流速：1.0 mL/min；檢測波長：471 nm；進樣量：10 μL。取蝦青素標準品，使用流動相配制0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 μg/mL 系列標準溶液，得到標準曲線：y=45910x+72376，R2=0.9909。

1.2.3 不同熱處理方式蝦青素強化蛋制品的制備參照王瑤瑤等[17]的方法對雞蛋進行熱處理，并作適當修改。具體條件如下：

a.溫泉蛋：將蝦青素強化雞蛋置于恒溫水浴鍋中，65 ℃溫度下保溫30 min，然后冷水浴5 min。

b.溏心蛋：將蝦青素雞蛋在沸水浴中加熱5 min，然后冷水浴5 min。

c.全熟蛋：將蝦青素雞蛋在沸水浴中加熱8 min，然后冷水浴5 min。

d.煎蛋：將蝦青素雞蛋去殼后倒進不粘煎鍋里，小火煎至雞蛋凝固即離火。

1.2.4 蝦青素穩(wěn)定性的測定 蝦青素屬于多元不飽和分子，當暴露在光照、高溫、氧氣和過渡金屬存在的條件下，極易被氧化降解。因此不同熱處理方式可能會造成蝦青素發(fā)生不同程度的氧化降解，導致保留率下降。參照1.2.2 測定新鮮蛋液中蝦青素的含量，記為m0；經過不同熱處理方式得到的蝦青素強化蛋制品中蝦青素的含量，記為m，再根據以下公式計算蝦青素的保留率。保留率越高代表穩(wěn)定性越高。

1.2.5 蝦青素強化雞蛋的體外消化實驗 雞蛋成分復雜，可分為蛋清和蛋黃兩個組分。蛋清蛋白與蛋黃蛋白的組成差異巨大，蛋清的主要成分為蛋白質，如卵白蛋白、卵轉鐵蛋白、溶菌酶等；而蛋黃中的蛋白質以脂蛋白為主，且含有高磷蛋白、卵黃蛋白等。此外，脂肪和蝦青素主要集中在蛋黃中。因此，本文將溫泉蛋、溏心蛋、全熟蛋和煎蛋的蛋清和蛋黃小心分開，分別進行體外消化實驗，用于后續(xù)的脂肪消化率、蛋白質消化率及蝦青素生物可給率的測定。溫泉蛋的蛋清較稀，需要小心分離，個別邊緣處不好分離的則丟棄，避免影響研究結果的準確性。

參照Brodkorb 等[18]的方法對蝦青素強化雞蛋進行體外腸胃模擬消化，并作適當修改。a.模擬胃部消化階段：精確稱取0.2 g 蛋清或者蛋黃樣品分散于7.023 mL 去離子水中，加入12 mL 鹽溶液（配方見表1）、0.03 mL CaCl2（H2O）2（0.3 mol/L）和0.4 mL HCl（5 mol/L） ，攪拌均勻，調節(jié)pH 至2.0，再加入0.667 mL 胃蛋白酶液（32 mg/mL）和0.48 mL 胃脂肪酶液（83.3 mg/mL），立即置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中反應2 h（37 ℃，180 r/min）；b.模擬小腸消化階段：在胃部消化階段完成后，在胃消化液中加入8 mL 鹽溶液、0.04 mL CaCl2（H2O）2（0.3 mol/L）、3.16 mL 去離子水和0.8 mL NaOH（5 mol/L），攪拌均勻，再加入3 mL 膽汁（200 mg/mL），調節(jié)pH 至7.0，立即加入5 mL 胰酶液（133 mg/mL），然后迅速置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中反應2 h（37 ℃，180 r/min）。為了確保實驗結果的準確性，所有樣品已提前預熱至37 ℃。未經過熱處理的蛋清和蛋黃液作為對照組。

表1 鹽溶液成分表Table 1 Composition of salt solution

1.2.6 脂肪消化率的測定 參考Hur 等[19]的方法測定脂肪消化率。稱取1 g 蛋黃樣品的小腸消化液，加入適量無水硫酸鈉，然后向其中加入50 mL 石油醚（30～60 ℃），混勻后放置過夜。將混合液過濾后收集25 mL 濾液，向濾液中加入50 mL 無水乙醇，滴加2～3 滴酚酞，用KOH 溶液進行滴定。以游離脂肪酸表征脂肪消化率，游離脂肪酸按以下公式計算：

其中，A 代表滴定液體積，mL；F 代表滴定液濃度，0.01 mol/L；m 代表蛋黃樣品的質量，g。

1.2.7 蛋白質消化率的測定 取10 mL 蛋清和蛋黃的小腸消化液，以5000 r/min 離心10 min，收集上清液備用。參考Branford[20]的方法測定蛋白質含量。取50 μL 上清液與4 mL 考馬斯亮藍溶液于離心管，混合均勻后靜置5 min，在595 nm 處測定吸光值。以牛血清蛋白為標準品繪制標準曲線（y=0.9423x+0.00952，R2=0.9977），計算蛋白質含量，再按照以下公式計算蛋白質消化率：

式中，m 代表上清液中蛋白質含量，g；m0代表消化前蛋清或蛋黃樣品中蛋白質含量，g。

1.2.8 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析 參照Wang 等[21]的方法分析消化液中蛋白質的分子量情況。濃縮膠和分離膠的濃度分別為5%、12%，將上述的蛋清或蛋黃樣品的小腸消化上清液與2×上樣緩沖液混合均勻，沸水浴5 min，然后取10 μL 樣品上樣。初始電壓設置為80 mV 恒定電壓，待樣品全部進入分離膠后，將電壓設置為120 mV 恒定電壓。電泳結束后，將電泳膠剝離并轉移到在染色液（考馬斯亮藍G250/甲醇/乙酸/去離子水，0.1:45:10:45，v/v/v/v）中浸泡1 h，然后轉移到脫色液（甲醇/乙酸/去離子水，1:1:8，v/v/v）中浸泡1 h。最后用化學凝膠成像儀進行成像。

1.2.9 蛋白質分子量分布情況的分析 將蛋清或蛋黃樣品的小腸消化上清液通過0.45 μm 水系微孔過濾膜過濾后，采用液相色譜儀測定蛋白質分子量的分布情況。液相條件如下，色譜柱：TSKgel G2000-SWXL 液相色譜分析柱（300 mm×7.8 mm，日本東曹株式會社）；流動相：水/乙腈/三氟乙酸（4:6:0.05，v/v/v）；流速為1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：25 ℃；檢測波長：241 nm。以五種標準品細胞色素C、牛胰島素、桿菌肽、谷胱甘肽和甘氨酸繪制標準曲線（y=-0.4592x+6.8447，R2=0.9598）。

1.2.10 蝦青素生物可給率的測定 體外消化實驗結束后，立即將蛋黃樣品的小腸消化液在冰水浴30 min，然后取20 mL 消化液在10000 r/min，4 ℃下離心30 min，上層清液即為膠束層，參照1.2.2 分別測定消化前樣品、小腸消化液樣品、膠束層樣品中蝦青素的含量，并根據以下公式計算蝦青素的生物可給率和生物保留率：

式中，mMicelle：膠束團中蝦青素含量，g；mDigesta：小腸消化液中蝦青素含量，g；mSample：消化前樣品中蝦青素含量，g。

1.3 數據處理

每組數據至少采用3 個平行，數據表示為平均值±標準差。采用Origin 2018 和SPSS 22.0 軟件進行數據分析及作圖，多重比較之間的差異采用單因素方差分析和Duncan 檢驗進行顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 蝦青素富集對雞蛋品質的影響

如表2 所示，蝦青素強化雞蛋與對照組雞蛋的蛋重、哈夫單位、蛋白質含量、脂肪含量均無顯著差異。Heng 等[22]研究了日糧中添加雨生紅球藻對雞蛋品質的影響，結果發(fā)現，蝦青素強化雞蛋與對照組雞蛋的哈夫單位、蛋重等指標均無顯著差異。Walker等[10]也發(fā)現蝦青素強化雞蛋的脂質、磷脂組成與對照組雞蛋相比并無顯著差異，與本文結論基本一致。強化雞蛋中蝦青素含量達到102.09 μg/g，而普通蛋黃中未檢測到蝦青素，說明蝦青素從飼料中經由母雞體內轉化成功沉積在蛋黃中，這也是蛋黃顏色較深的原因。Dansou 等[16]報道雞蛋中蝦青素含量與飼糧中蝦青素添加劑量成正比，213.4 mg/kg 添加劑量組雞蛋蝦青素含量達到79.45 μg/g；Gao 等[11]研究發(fā)現100 mg/kg 添加組在飼喂6 周后收集的雞蛋中蝦青素達到最高富集量44.20 mg/kg。與前人的文獻相比，本實驗制備的強化雞蛋中蝦青素含量更高可能是受到雞的品種、飼喂周期、飼糧中蝦青素劑量的影響。

表2 蝦青素富集對雞蛋品質的影響Table 2 Effect of astaxanthin enrichment on the egg quality

2.2 不同熱處理方式對蝦青素穩(wěn)定性的影響

如表3 所示，經過加熱后，溫泉蛋、溏心蛋、全熟蛋、煎蛋中蝦青素的保留率分別為97.21%、96.58%、91.04%和87.88%，結果表明熱加熱會造成蝦青素一定的損失，隨著加熱程度的增加，損失越多。這主要是因為蝦青素分子結構中含有大量的雙鍵，對溫度比較敏感，隨著溫度的加劇，導致雙鍵變得更活潑，容易斷裂而發(fā)生氧化降解[23-24]。

表3 不同熱處理方式對蝦青素穩(wěn)定性的影響Table 3 Effect of thermal treatment on astaxanthin retention of astaxanthin-enriched eggs

2.3 不同熱處理方式對蝦青素強化雞蛋脂肪消化率的影響

如圖1 所示，相比較鮮蛋，煮蛋可以提高蝦青素強化雞蛋脂肪消化率，且溫泉蛋和溏心蛋之間脂肪消化率并無顯著差異（P＞0.05），而煎蛋反而造成脂肪消化率下降，這可能是由于煎蛋時高溫導致蛋白質變性嚴重，分子粒徑增大，比表面積下降，不利于油脂被脂肪酶作用[25]。

圖1 不同熱處理方式對蝦青素強化雞蛋脂肪消化率的影響Fig.1 Effect of thermal treatment on the lipid digestion rate of astaxanthin-enriched eggs

2.4 不同熱處理方式對蝦青素強化雞蛋蛋白質消化率的影響

由圖2 可知，不同熱處理方式下蛋清中蛋白質消化率由高至低依次為：溏心蛋≈溫泉蛋＞全熟蛋＞鮮蛋液＞煎蛋，不同熱方式下蛋黃中蛋白質消化率由高至低依次為：溏心蛋≈溫泉蛋≈全熟蛋＞煎蛋＞鮮蛋液。Wang 等[21]研究了不同溫度（4、56、65、100 ℃）熱處理對雞蛋蛋清的蛋白質體外消化率產生的影響，結果發(fā)現在65 ℃下熱處理的蛋清具有最高的蛋白消化率，說明熱處理可以提高蛋白質的消化，但過度熱處理反而產生不利影響，這與本文實驗結果基本一致。原因可能是雞蛋經過熱處理會使得蛋白質發(fā)生變性、肽鏈出現松動或者發(fā)生破裂，還會導致抗營養(yǎng)因子變性或是失活，從而增加蛋白質對消化酶的敏感性，有利于蛋白質消化[26-27]。然而，煎蛋的蛋白質消化率要低于煮蛋，可能是因為加熱過度會導致氨基酸脫硫和異構化，或導致蛋白質與糖、脂質和食品添加劑發(fā)生反應，使得蛋白質消化率下降[28]。

圖2 不同熱處理方式對蝦青素強化雞蛋蛋白質消化率的影響Fig.2 Effect of thermal treatment on the protein digestion rate of astaxanthin-enriched eggs

2.5 不同熱處理方式對蝦青素強化雞蛋消化液中蛋白質分子分布情況的影響

飲食中的蛋白質和多肽被人體攝入后，在胃腸道消化中被消化酶水解為不同長度的多肽和氨基酸，最終被人體消化吸收[29]。如圖3 所示，在經過體外模擬消化后，蛋黃蛋白與蛋清蛋白的分子量均低于44.3 kDa。不同熱方式之間的差別在于熱處理的溫度和時間不同帶來的雞蛋質地的差別，隨著熱處理程度的增加，條帶強度逐漸增強，結果表明煎蛋、全熟蛋未消化蛋白多于溏心蛋、溫泉蛋，蛋白消化率較低，結果與蛋白消化率一致（圖2）。

圖3 不同熱處理方式的蝦青素強化雞蛋消化液中蛋白質的SDS-PAGE 電泳圖Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis of astaxanthin-enriched eggs treated with different thermal treatment

蝦青素強化雞蛋經體外模擬消化后蛋白質分子量分布如表4 所示，結果表明溫泉蛋和溏心蛋蛋清消化完后的肽段分子量更低，＜500 Da 肽段部分分別占66.34%和65.91%，歸因于卵白蛋白發(fā)生適度變性，有利于提高蛋白質消化率，因此消化完蛋白大分子段分布減少；而煎蛋在加熱過程中卵白蛋白變性過度反而不利于蛋白質消化。理論上，蛋黃蛋白質比蛋清蛋白質更難消化，這是因為蛋黃中的高磷蛋白和高密度脂蛋白不易被酶作用[30]。然而，研究發(fā)現蛋黃蛋白質消化后小分子肽段（＜500 Da）占比遠高于蛋清蛋白質，這可能歸因于在液相色譜測定前樣品要進行過濾膜處理，導致蛋黃中不溶性蛋白質（如高磷蛋白和高密度脂蛋白）已被去除，導致結果出現偏差。后續(xù)需結合其他技術手段對蛋白質分子量分布進行分析。

表4 不同熱處理方式的蝦青素強化雞蛋在體外模擬消化后蛋白分子量分布Table 4 Protein molecular weight distribution of astaxanthin-enriched eggs treated with different thermal treatment after in vitro digestion

2.6 不同熱處理方式對蝦青素生物保留率與生物可給率的影響

生物保留率是指脂溶性營養(yǎng)素經過胃腸道消化后的保留率，是小腸消化液中營養(yǎng)素的含量與消化前營養(yǎng)素的含量的比值。如圖4 所示，鮮蛋液與經過不同熱處理方式雞蛋之間的蝦青素生物保留率并無顯著差異（P＞0.05），為48.76%～49.47%。蝦青素在消化過程中不可避免會產生損失，這是由于蝦青素本身對胃部的強酸性環(huán)境較為敏感以及在37 ℃環(huán)境下的自然降解。

圖4 不同熱處理方式的蝦青素強化雞蛋中蝦青素的生物利用度Fig.4 Biostability and bioaccessability of astaxanthin-enriched eggs treated with different thermal treatment

脂溶性營養(yǎng)素的生物可給率是指營養(yǎng)素在攝入后被載入混合膠束或囊泡中成為可被小腸吸收的比例。蝦青素生物可給率由高至低依次為：溏心蛋≈溫泉蛋＞全熟蛋＞鮮蛋液≈煎蛋。其中，煮蛋的蝦青素生物可給率顯著高于煎蛋（P＜0.05），可能是由于在不同的熱條件下，蛋黃中的蛋白質和油脂會發(fā)生不同程度的結構變化影響了膠束化效率，另一方面可能是由于煮蛋相對煎蛋會更好的與消化液混合，因此煮蛋蛋黃與消化酶的接觸面積更大。而煮蛋之間的生物可給率差異可能是因為在不同煮制溫度和煮制時長下，蛋黃質地之間的差別影響了膠質化效率[31]。Nimalaratne等[32]研究發(fā)現不同熱處理方式雞蛋中葉黃素的生物保留率無明顯差異，而生物可給率具有顯著差異，這與本文研究結果基本一致。

3 結論

本文重點考察了溫泉蛋、溏心蛋、全熟蛋、煎蛋四種熱處理方式對蝦青素強化雞蛋穩(wěn)定性和消化情況的影響，研究結果表明，溫泉蛋中蝦青素的保留率最高（97.21%），煎蛋的保留率最低（87.88%）。相比較鮮蛋，水煮蛋可以提高蝦青素強化雞蛋中的脂肪和蛋白質消化率，尤其是溏心蛋和溫泉蛋表現出最高的消化率，消化完后的蛋白大分子段分布減少，肽段分子量更低；而煎蛋反而不利于雞蛋蛋白質的消化。熱處理方式對蝦青素的生物保留率并無顯著影響，為48.76%～49.47%，但水煮蛋可以提高蝦青素的生物可給率，其中溏心蛋和溫泉蛋中的蝦青素具有較高的生物可給率，分別為48.76%和47.71%。以上研究結果為開發(fā)天然安全且高生物利用率蝦青素產品提供一種新思路，這對于推進健康營養(yǎng)食品的加工水平，具有一定的科學研究意義和實際應用價值。但本文僅采用體外消化模型探究了蝦青素強化雞蛋的消化特性，后續(xù)可構建細胞動物模型進一步探究并揭示其內在的分子機制。