駿棗多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)表征及抗氧化活性研究

趙建成，劉慧燕，方海田

（寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021）

紅棗（Ziziphus jujubaMill）作為我國(guó)特有的“藥食兩用”植物[1]，具有4000 多年的栽培歷史，棗樹在中國(guó)的種植面積超過(guò)世界棗樹種植面積總量的95%[2]，據(jù)研究報(bào)道，棗果含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、環(huán)核苷酸和有機(jī)酸等多種營(yíng)養(yǎng)成分[3]，具有抗氧化[4]、抗腫瘤[5]、補(bǔ)氣血[6]、調(diào)節(jié)腸道菌群[7]、降血糖[8]等多種生物活性。駿棗（Zizyphus jujubacv. Junzao），為鼠李科棗屬的果實(shí)，是我國(guó)特有的果品之一，果實(shí)色澤鮮艷、酸甜適口，平均果重22.9 g，含可溶性固形物33%，可食率96.3%，深受人們的青睞[9]。

植物多糖是一類具有多種生理功能的天然物質(zhì)，由于其高效、低毒等特性，在食品中的抗氧化作用日益受到人們的重視[10]。多糖是紅棗中含量最豐富的一種生物活性物質(zhì)，紅棗多糖的生物活性主要體現(xiàn)在抗氧化活性、抗腫瘤活性和免疫學(xué)活性等方面[11]。紅棗多糖常用的提取方法有：水提醇沉法、超聲波輔助提取法、酶解法和亞臨界輔助提取法等[12-13]。采用水提醇沉法提取紅棗多糖，具有操作簡(jiǎn)單，安全，綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，是目前最常用的一種提取工藝[14]。Wang 等[15]通過(guò)水提醇沉的方法，從臨澤小棗中分離純化出LZJP3 和LZJP4 兩種多糖，其中，LZJP3 是由半乳糖的聚合物組成，LZJP4 是由木糖和葡萄糖的聚合物組成，且LZJP3 和LZJP4 對(duì)DPPH 自由基和羥自由基均具有良好的抗氧化活性。

目前，關(guān)于駿棗多糖的結(jié)構(gòu)及抗氧化活性的研究很少。因此，本研究以駿棗為原料，通過(guò)水提醇沉法提取駿棗粗多糖，再對(duì)駿棗粗多糖進(jìn)行分離純化，分析純化后駿棗多糖組分的結(jié)構(gòu)特征及抗氧化活性。旨在為駿棗多糖產(chǎn)品的開發(fā)及作為潛在抗氧化劑的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

駿棗（Ziziphus jujubacv. Junzao） 寧夏杞源堂生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、三氯乙酸、苯酚、氫氧化鈉、氯化鈉 天津市大茂化學(xué)試劑廠；30%過(guò)氧化氫 分析純，煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；濃硫酸分析純，寧夏恒元?jiǎng)?chuàng)科貿(mào)有限公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品甘露糖（Man）、果糖（Fuc）、鼠李糖（Rha）、葡萄糖醛酸（GlcA）、半乳糖醛酸（GalA）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）和木糖（Xyl） 色譜純，均來(lái)自上海源葉生物科技有限公司。

L550 臺(tái)式低速大容量離心機(jī) 長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HHS-21-8 電子恒溫不銹鋼水浴鍋 上海宜昌儀器紗篩廠；SCIENTZ-10N 冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；752N 型紫外-可見分光光度計(jì) 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；T27 傅里葉變換紅外光譜儀 德國(guó)布魯克公司；NW10VF 型超純水系統(tǒng) 上海力康生物科技有限公司；Verios G4 掃描電子顯微鏡 美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 駿棗粗多糖提取 新鮮駿棗清洗干凈后切成薄片，置于烘箱內(nèi)80 ℃，9 h，用研缽搗碎，過(guò)50 目篩，駿棗粉裝瓶備用。稱取10 g 駿棗粉，采用水提醇沉法[16]，提取條件為：采用去離子沸水以20:1（m/v）液料比提取2 次，每次3 h。然后合并上清液（以6000 r/min 離心15 min），去除沉淀。上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在65 ℃真空條件減壓濃縮至原體積的四分之一，合并兩次旋蒸濾液備用。再加入4 倍體積乙醇（85%）過(guò)夜，將過(guò)夜后的粗多糖溶液離心（8000 r/min，10 min），取沉淀備用；最終所得沉淀即為駿棗粗多糖，命名為HZPC。

1.2.2 駿棗粗多糖脫色、脫蛋白 駿棗粗多糖用30%H2O2脫色后[17]，采用三氯乙酸除蛋白[18]，以m（HZPC）:m（TCA）=1:1.5 的比例，加入體積分?jǐn)?shù)為5%的三氯乙酸（trichloroacetic acid,TCA）溶液，在4 ℃冰箱中靜置5 h，在4500 r/min 離心15 min，棄去沉淀，保留上清液。樣液濃縮至原來(lái)體積的四分之一，用蒸餾水透析（1 d）、旋蒸、凍干后備用，將脫色除蛋白后得到的駿棗粗多糖命名為HZPC-Y。

1.2.3 駿棗粗多糖的分離純化 DEAE-52 纖維素陰離子交換層析柱分離：采用楊燕敏[19]的方法對(duì)DEAE-52 纖維素進(jìn)行預(yù)處理、裝柱等，將HZPC-Y（2.5 g）溶解在蒸餾水（500 mL）中，配制成5 mg/mL的多糖溶液，8000 r/min 離心5 min，取10 mL 上清液，用0.45 μm 的水系濾膜過(guò)濾后，將多糖溶液緩慢加入DEAE-52 陰離子纖維素離子交換柱（25 mm×500 mm）中，分別以0.1、0.2、0.3、0.4 和0.5 mol/L的NaCl 洗脫液為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，流速控制為2 mL/min，自動(dòng)收集器每5 min 收集1 管，每管10 mL，收集120 管。采用苯酚-硫酸法[20]，在490 nm 處測(cè)定每管洗脫液中的多糖含量，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，合并不同吸收峰的洗脫液進(jìn)行減壓濃縮、透析（48 h）、冷凍干燥得初步純化的多糖組分。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算葡萄糖的濃度。按下式計(jì)算樣品中多糖得率：

式中：C 為樣品溶液中葡萄糖濃度（mg/mL）；D 為樣品溶液稀釋倍數(shù)；f 為換算因子，0.9；m 為駿棗多糖干粉質(zhì)量，g。

準(zhǔn)確稱取初步純化多糖組分2.5 g 溶解于500 mL去離子水中，配制成5 mg/mL 的駿棗多糖溶液，用微孔濾膜（0.45 μm）過(guò)濾。將樣品溶液緩慢加于葡聚糖凝膠柱中（25 mm×500 mm），用去離子水洗脫，洗脫液的流速為2 mL/min，收集洗脫液，每管4 mL，收集30 管。純化后HZPC-2 組分再經(jīng)減壓濃縮、透析、凍干后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 HZPC-2 的紫外吸收光譜和傅里葉紅外光譜分析 精密稱取HZPC-2 樣品，用超純水配制成1 mg/mL 溶液，置于比色皿中。將比色皿置于分光光度儀，進(jìn)行200～400 nm 全波長(zhǎng)掃描記錄，觀察在280 nm 附近是否存在吸收峰[21]。

取純化組分HZPC-2（2 mg）與干燥平衡（36 h）的KBr 粉末按質(zhì)量比1:100 在瑪瑙研缽中充分研磨，直至制成的KBr 切片表面晶瑩通透無(wú)雜質(zhì)。首先進(jìn)行背景掃描干擾，在4000～500 cm-1的條件下，測(cè)定多糖中的有機(jī)官能團(tuán)[22]。

1.2.5 多糖的均一性和分子量測(cè)定 用高效凝膠滲透色譜（HPGPC）測(cè)定樣品的均一性和分子量。根據(jù)文獻(xiàn)的方法[23]進(jìn)行檢測(cè)，略有修改。將純化的多糖應(yīng)用于BRT105-104-102 串聯(lián)凝膠柱（8 mm×300 mm）的凝膠過(guò)濾層析柱。該柱保持在40 ℃的溫度下，以0.6 mL/min 的流速用0.05 mol/L 的氯化鈉溶液洗脫。使用不同分子量（5000、11600、23800、48600、148000，273000、409800 和667800 Da）的葡聚糖進(jìn)行柱（BRT105-104-102 串聯(lián)凝膠柱）的初步校準(zhǔn)。

1.2.6 單糖構(gòu)成分析 采用離子色譜法[24]對(duì)HZPC-2 進(jìn)行單糖組成測(cè)定。取HZPC-2（5.0 mg）在120 ℃的安瓿瓶中，用2 mL 三氟乙酸（TFA，3 mol/L）水解2 h，吸取酸水解溶液轉(zhuǎn)移至管中用氮吹儀吹干，加入10 mL 去離子水混勻，取40 μL 酸水解溶液定容至1000 μL 容量瓶中，12000 r/min 離心5 min。取上清進(jìn)IC 分析。以H2O 和15 mmol/L 氫氧化鈉、100 mmol/L 過(guò)氧化鈉為流動(dòng)相，流速控制在0.3 mL/min，進(jìn)樣體積是5 μL；柱溫保持在30 ℃。最后使用電化學(xué)檢測(cè)器對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行分析。

1.2.7 掃描電子顯微鏡觀察 取適量的HZPC-2 平鋪于導(dǎo)電膠，并用粉塵球吹走殘余的樣品，選擇5 mA 電流分兩次噴金，每次30 s，再將樣品置于電子顯微鏡下（1×10-5Pa、20 kV）觀察其微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.8 駿棗多糖HZPC-2 的DPPH 自由基、ABTS 由基和羥自由基清除率測(cè)定

1.2.8.1 DPPH·清除率的測(cè)定 參考何坤明等[25]的方法略有修改，分別配制濃度為1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mg/mL 的駿棗多糖HZPC-2 的溶液。依次加入2.0 mL 不同質(zhì)量濃度的HZPC-2 溶液與2.0 mL 0.1 mmol DPPH（乙醇溶解）搖勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，于517 nm 處測(cè)量吸光值，VC作為陽(yáng)性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，計(jì)算DPPH 自由基清除能力。

式中，A0：無(wú)樣液反應(yīng)混合物溶液吸光度；Ai：1 mL 樣品溶液+2 mL DPPH 溶液的吸光值；Aj：1 mL樣品溶液+2 mL 乙醇的吸光值。

1.2.8.2 ABTS 陽(yáng)離子自由基清除率的測(cè)定 參照伍燕等[26]的方法略有修改。將ABTS 自由基儲(chǔ)備溶液稀釋至吸光度為0.70±0.02。再將1 mL 不同濃度（1.0～5 mg/mL）的5 個(gè)多糖樣品分別與2 mL 新鮮ABTS 溶液混勻，室溫下避光靜置6 min，于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，VC作為陽(yáng)性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，計(jì)算ABTS 自由基清除率。

式中：A0：無(wú)樣液反應(yīng)混合物溶液吸光度；Ai：1 mL 樣 品 溶 液+2 mL ABTS 溶 液 的 吸 光 值；Aj：1 mL 樣品溶液+2 mL 乙醇的吸光值。

1.2.8.3 羥自由基清除率的測(cè)定 參照Wang[27]等的方法略有修改，分別配制濃度為1.0、2.0、3.0、4.0 和5.0 mg/mL 的駿棗多糖HZPC-2 的溶液，首先向試管中加入1 mL 不同質(zhì)量濃度的HZPC-2 溶液，其次加入2 mL 6 mmol/L 的FeSO4溶液和2 mL 6 mmol/L 的水楊酸-乙醇溶液，最后加入2 mL 6 mmol/L 的H2O2，充分混勻在10 mL 試管中，混合溶液于37 ℃培養(yǎng)30 min 后，測(cè)定在510 nm 處吸光度數(shù)值，VC作為陽(yáng)性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，計(jì)算羥自由基清除率。

式中： A0：無(wú)樣液反應(yīng)混合物溶液吸光度；Ai：1 mL 樣品溶液+2 mL FeSO4+2 mL 水楊酸-乙醇溶液+2 mL H2O2混合溶液的吸光值；Aj：1 mL 樣品溶液+2 mL FeSO4+2 mL 水楊酸-乙醇溶液的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2010匯總，繪圖采用Origin 2021 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 DEAE-52 陰離子交換柱分離純化紅棗多糖的結(jié)果

采用DEAE-52 纖維素柱對(duì)駿棗粗多糖HZPC進(jìn)行多糖餾分洗脫。由圖1 可直觀看出駿棗粗多糖HZPC 在490 nm 處的吸光值，出現(xiàn)兩個(gè)洗脫峰HZPC-1 和HZPC-2，對(duì)應(yīng)的多糖得率分別為3.48%和4.13%，由于HZPC-1 的多糖得率低于HZPC-2，故收集多糖含量較高的組分HZPC-2，即被認(rèn)定是駿棗多糖HZPC 的主要構(gòu)成組分。并對(duì)HZPC-2 進(jìn)行減壓濃縮、透析、冷凍干燥后得到初步純化組分。

圖1 HZPC 的DEAE-52 洗脫曲線Fig.1 DEAE-52 elution curve of HZPC

2.2 Sephadex G-100 葡聚糖凝膠柱層析結(jié)果

如圖2 所示，將經(jīng)層析柱初步純化得到的HZPC-2 過(guò)Sephadex G-100 凝膠層析柱，得到單一對(duì)稱的洗脫峰，說(shuō)明純化效果良好。收集10～20 管，并進(jìn)行減壓濃縮、透析、冷凍干燥得到精制駿棗多糖組分HZPC-2 呈白色絮狀。

圖2 HZPC-2 的Sephadex G-100 洗脫曲線Fig.2 Sephadex G-100 elution curve of HZPC-2

2.3 HZPC-2 的紫外吸收光譜和傅里葉紅外光譜吸收光譜結(jié)果

如圖3-a 所示，樣品的紫外光譜在280 nm 處未出現(xiàn)吸收峰，表明駿棗多糖HZPC-2 中沒有蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)含量極微[28]，這進(jìn)一步證實(shí)前期選用三氯乙酸脫除蛋白效果極佳。如圖3-b 所示，傅里葉紅外光譜是鑒定多糖中特征有機(jī)基團(tuán)的有力技術(shù)。HZPC-2 通過(guò)FTIR 光譜進(jìn)行表征，在3416 cm-1附近有一強(qiáng)吸收峰，在2926 cm-1附近有一弱吸收峰，分別歸因于O-H 和 C-H 伸縮振動(dòng)，這兩個(gè)峰都是多糖的特征吸收峰[20]。在1748 cm-1的吸收帶，是一個(gè)糖醛酸的特征[29]，這表明HZPC-2 中有糖醛酸的存在。在1285 cm-1范圍內(nèi)的峰值為糖類化合物的C-H 變角振動(dòng)[30]。1616 cm-1處相對(duì)弱的吸收峰則可能與束縛水的存在有關(guān)，在1154 cm-1附近的弱吸收峰是吡喃環(huán)骨架的變角振動(dòng)吸收峰，表明分子中存在C-OH 和C-O-C 結(jié)構(gòu)[31]。在1080 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰是半乳糖的特征吸收，這與單糖構(gòu)成測(cè)定結(jié)果一致（圖4）。868 cm-1附近的峰值表明該樣品中包含α構(gòu)型[32]，即具有α-糖苷鍵，是一種α-吡喃葡萄糖。在746 cm-1處存在弱吸收峰，推測(cè)可能含有吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)[33]。綜上所述，HZPC-2 可能具有α-型糖苷鍵。

圖3 HZPC-2 的紫外吸收光譜（a）和傅里葉紅外吸收光譜圖（b）Fig.3 UV (a) and FTIR (b) absorption spectra of HZPC-2

圖4 HZPC-2 單糖構(gòu)成分析Fig.4 Analysis of monosaccharide composition of HZPC-2

2.4 多糖的均一性和分子量測(cè)定

通過(guò)HPGPC 測(cè)定HZPC-2 的分子質(zhì)量。得到校正曲線方程為：y=-0.1937x+12.27，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.9929?？芍逦环肿淤|(zhì)量（Mp）為2.99×104Da，均分子質(zhì)量（Mw）為3.25×104Da，數(shù)均分子質(zhì)量（Mn）為2.79×104Da。多分散性指數(shù)（Mw/Mn）為1.161，與1 接近，說(shuō)明HZPC-2 的分子質(zhì)量分布較為密集。

2.5 單糖構(gòu)成分析

使用離子色譜儀測(cè)得HZPC-2 是由七種單糖組成（表1、圖4），根據(jù)絕對(duì)定量的方法，通過(guò)與16 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，測(cè)定不同單糖質(zhì)量，根據(jù)單糖摩爾質(zhì)量計(jì)算出摩爾比。確定HZPC-2 是由Rha、Ara、Gal、Glc、Xyl、Man、GalA 構(gòu)成，摩爾比為0.05:0.34:0.29:0.15:0.08:0.02:0.06，同時(shí)，Ara 和Gal 比例最高，說(shuō)明駿棗多糖HZPC-2 主要是由阿拉伯糖、半乳糖所組成。而在Ji 等[34]的研究中，木棗多糖是由Ara、Gal、Glc、Man 和Xyl 構(gòu)成，摩爾比為 17.36:3.29:2.68:1.05:1.00?？梢钥闯?，在駿棗和木棗中Ara 和Gal在各自的單糖組成中所占比例均最高。同時(shí)，駿棗多糖與木棗多糖的單糖比例不盡相同，可能是由于不同品種的棗屬及提取純化的工藝不同所致。

表1 HZPC-2 單糖構(gòu)成分析Table 1 Analysis of monosaccharide composition of HZPC-2

2.6 HZPC-2 的微觀結(jié)構(gòu)

如圖5 所示，為HZPC-2 的掃描電鏡（SEM）照片，在100 μm 分辨率時(shí)，是多糖微觀整體輪廓圖[35]，可以觀察到組分HZPC-2 表面呈凹凸不平的溝壑且朝四面八方延伸，四周鑲嵌著形狀不規(guī)則的孔狀結(jié)構(gòu)。

圖5 HZPC-2 的SEM 圖像Fig.5 SEM image of HZPC-2

2.7 HZPC-2 的抗氧化活性

如圖6A 所示，HZPC-2 對(duì)DPPH 自由基的清除率隨其濃度的升高而升高。當(dāng)HZPC-2 濃度從1 增加到2 mg/mL 時(shí)，DPPH 自由基清除能力由29.37%增至41.68%，而當(dāng)HZPC-2 的濃度上升至5 mg/mL 時(shí)，DPPH 自由基的清除率達(dá)到63.02%。在5 mg/mL 時(shí)，VC對(duì)DPPH 自由基的清除率可達(dá)到98.05%。楊燕敏等[36]在對(duì)紅棗多糖體外抗氧化活性評(píng)價(jià)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)紅棗多糖濃度在0～1 mg/mL 范圍時(shí)，其DPPH 自由基清除率都是隨著多糖濃度的增大而增大，最大清除率達(dá)到89%，HZPC-2 的最大清除率雖然低于紅棗多糖，但二者對(duì)DPPH 自由基清除能力都呈現(xiàn)出相同的遞增趨勢(shì)，均表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗氧化活性。

圖6 HZPC-2 的抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activity of HZPC-2

如圖6B 所示，當(dāng)HZPC-2 濃度為從1 增至5 mg/mL 時(shí)，ABTS 自由基的清除率呈上升之勢(shì)。這可能是由于在高濃度下的HZPC-2 能夠?qū)⒎磻?yīng)性自由基轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定狀態(tài)，并通過(guò)向自由基提供電子來(lái)終止自由鏈反應(yīng)[37]；當(dāng)濃度為5 mg/mL 時(shí)，HZPC-2 和VC對(duì)ABTS 自由基的清除率分別為56.85%和98.52%。結(jié)果表明，HZPC-2 對(duì)ABTS 自由基有一定的清除能力，并呈劑量依賴性。

羥自由基可以自由進(jìn)入細(xì)胞膜，并與大多數(shù)生物分子反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷。因此，清除羥自由基可有助于防止組織損傷[38]。如圖6C 所示，羥自由基的清除率隨HZPC-2 濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)HZPC-2 濃度從1 增加到5 mg/mL 時(shí)，羥自由基清除率由23.05%增至60.32%，增幅之大可能是因?yàn)镠ZPC-2 中具有許多可以修飾的羥基，這樣的修飾可能會(huì)賦予多糖更強(qiáng)的羥自由基清除活性[39]。而當(dāng)濃度為5 mg/mL 時(shí)，VC對(duì)羥自由基的清除率可達(dá)98.48%。在濃度為8 mg/mL 的玉竹多糖[40]中羥自由基清除率為41.98%±2.10%，在濃度為4 mg/mL茯苓多糖[41]中，羥自由基清除率最高為45.15%，相比之下，HZPC-2 擁有更好的羥自由基清除活性。

3 結(jié)論

本研究采用水提醇沉法從駿棗中分離出主要多糖組分HZPC，再經(jīng)DEAE-52 纖維素層析法和Sephadex G-100 凝膠色譜法對(duì)HZPC 純化得到主要組分HZPC-2，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征及抗氧化活性的研究。結(jié)果表明，HZPC-2 為α-吡喃葡萄苷骨架的中性多糖，單糖組成和分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果表明HZPC-2 中含有鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gal）、葡萄糖（Glc）、木糖（Xyl）、甘露糖（Man）和半乳糖醛酸（GalA），對(duì)應(yīng)的摩爾比為0.05:0.34:0.29:0.15:0.08:0.02:0.06；HZPC-2 的分子質(zhì)量約為3.25×104Da。體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)表明，HZPC-2 對(duì)DPPH 自由基、ABTS 陽(yáng)離子自由基、羥自由基都表現(xiàn)出良好的自由基清除活性。鑒于HZPC-2 抗氧化活性良好的優(yōu)勢(shì)，可為進(jìn)一步開發(fā)功能性駿棗多糖食品提供理論參考。