外泌體作為藥物遞送系統(tǒng)的研究進展#

巫瑤 于洋 朱玲 王霞 萬莉紅

·綜述·

外泌體作為藥物遞送系統(tǒng)的研究進展#

巫瑤*1于洋2朱玲1王霞3△萬莉紅1△

（1. 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，四川 成都 610041；2. 四川大學(xué)華西醫(yī)院神經(jīng)外科，四川 成都 610041；3. 四川大學(xué)華西第二醫(yī)院檢驗科，四川 成都 610041）

外泌體是一種由細胞分泌的直徑約40-100 nm的盤狀囊泡，具有天然脂質(zhì)雙分子層，其內(nèi)包含了復(fù)雜的RNA和蛋白質(zhì)。大多數(shù)細胞在正常及病理狀態(tài)下均能產(chǎn)生外泌體，這些外泌體主要存在于體液中，在細胞間物質(zhì)運輸和信號交流中發(fā)揮著重要作用。作為天然內(nèi)源性納米級載體，外泌體具有毒性小、穩(wěn)定性好、、滲透性好、靶向歸巢性強、能透過血腦屏障、可包載的物質(zhì)種類多等特點，故可能成為具有良好應(yīng)用前景的藥物遞送載體。本文主要介紹外泌體的基本性質(zhì)、制備、載藥方式，并歸納了其作為藥物遞送載體的研究進展。

外泌體；藥物遞送系統(tǒng)；天然內(nèi)源性納米級載體；靶向

目前已經(jīng)有很多新型納米材料被開發(fā)應(yīng)用于治療多種重大疾病[1, 2]。相比于傳統(tǒng)藥物遞送載體，納米材料尺寸小、材料和形狀特殊，可在一定程度上提高療效[3]。

但是，大部分納米載體不能被降解，易于堆積、自由移動，從而阻塞微循環(huán)造成細胞持久性損傷，因此存在潛在的安全性問題[4]。而外泌體是生物體在正常或者病理狀態(tài)下產(chǎn)生的納米級細胞囊泡，具有與脂質(zhì)體相似的膜狀結(jié)構(gòu)，這促使研究者們開始思考能否將藥物裝載到脂質(zhì)體中的經(jīng)驗應(yīng)用于外泌體中。此外，外泌體還具有體積小、可荷電、能被修飾具有靶向性、逃避吞噬、能透過血腦屏障等優(yōu)點[5]。因此，外泌體作為天然內(nèi)源性納米載體，具有良好應(yīng)用前景，可被開發(fā)用于藥物的遞送。

1 外泌體概況

1.1 來源

外泌體可被免疫細胞、神經(jīng)元、成纖維細胞、間充質(zhì)干細胞、內(nèi)皮細胞和上皮細胞等多種細胞分泌產(chǎn)生[6]，可在血液、尿液、唾液、腦脊液、乳汁、羊水、腹水和膽汁等多種體液中出現(xiàn)[7-11]。

1.2 特性

作為細胞分泌產(chǎn)物的外泌體具有一定的內(nèi)在靶向性，如中樞神經(jīng)細胞分泌的外泌體能透過血腦屏障，靶向特定的神經(jīng)元[12]；缺氧腫瘤細胞來源的外泌體傾向于向缺氧腫瘤組織內(nèi)聚集[13]。另外，通過設(shè)計外泌體膜表面與靶細胞特異性結(jié)合的抗體、配體或受體可實現(xiàn)外泌體外源靶向性。

外泌體主要有兩種不同類型的靶向修飾[14-16]。一種是通過基因工程技術(shù)在外泌體膜上表達靶向多肽，從而使外泌體具有靶向功能[17]。另外一種是在外泌體膜表面直接進行修飾，如受體蛋白工程[18]。

1.3 外泌體作為藥物遞送系統(tǒng)的應(yīng)用

外泌體可用于包載小分子藥物，使藥物在靶細胞內(nèi)富集，增加小分子藥物的穩(wěn)定性并延長其血液循環(huán)時間，進而提高藥物的療效。

已有研究顯示，一些小分子化療藥物可以被包載于外泌體中從而達到治療疾病的作用，如紫杉醇[19]、姜黃素[20]、多柔比星[21]等。除小分子外，外泌體還可用于包載大分子，如蛋白質(zhì)藥物和基因藥物等。

2 外泌體的制備

目前大規(guī)模生產(chǎn)外泌體的方法主要是自發(fā)生產(chǎn)和非自發(fā)生產(chǎn)兩種方式。自發(fā)生產(chǎn)通過依賴中空纖維生物反應(yīng)器為細胞生長提供高表面積比，進而支持高密度的細胞自發(fā)釋放外泌體[22]。研究表明，自發(fā)生產(chǎn)方式耗時長，不適于工業(yè)化生產(chǎn)。

非自發(fā)生產(chǎn)方式主要通過增加外部刺激條件來觸發(fā)細胞釋放大量外泌體，非自發(fā)生產(chǎn)方式可分為三類：生物刺激、化學(xué)刺激、物理刺激，異同點見表1。

2.1 提取與分離

由于外泌體的形態(tài)與其他細胞外小體相似，大小范圍重疊，且體積過小，使得外泌體的分離變得非常困難[23-26]。不同的分離方法所得的外泌體產(chǎn)量不同、操作不同、耗時不同、價格也不同，異同點見表2。其中，超速離心法常常作為外泌體提取分離的金標準[27]。

2.2 鑒定

外泌體的表征包括了粒徑大小范圍、表面電荷、結(jié)構(gòu)和表面蛋白等，其對外泌體的性質(zhì)和生物學(xué)功能非常重要，并可以影響藥物的裝載和輸送。外泌體的鑒定主要就是對其表征的鑒定[23]。隨著微流控檢測技術(shù)的快速發(fā)展，我們可以實現(xiàn)高通量、高精度和低試劑消耗的新型外泌體檢測技術(shù)，包括熒光相關(guān)顯微鏡（Fluorescence correlation microscopy，F(xiàn)CM）、比色法檢測、表面等離子體共振（Surface plasmon resonance detection，SPR）檢測和核磁共振（Nuclear magnetic resonance detection，NMR）檢測等[23]。

此外，可以通過評估外泌體的聚散指數(shù)（Polymer dispersity index，PDI）和囊泡的zeta電位，以確定外泌體作為藥物輸送系統(tǒng)的適用性[28]。

而外泌體的濃度，則可以通過測定總蛋白質(zhì)含量來確定。外泌體的RNA含量則可以通過毛細管電泳、分光光度法和實時聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）來測定。

表1 外泌體非自發(fā)生產(chǎn)方式

刺激方式具體方法優(yōu)勢劣勢 生物刺激血清饑餓處理、缺氧處理、細胞因子處理（如腫瘤壞死因子TNF-α、白細胞介素8IL-8、白細三烯B4 LTB4）快速、成本低、操作簡單、可大規(guī)模生產(chǎn)殘留大量生物活性劑、需要純化、回收率低 化學(xué)刺激細胞松弛素B抑制肌動蛋白的聚合從而促進外泌體的釋放、耗時短、操作簡單需要純化、回收率低 物理刺激物理和機械力不需要加入刺激因子耗時、產(chǎn)率不高

表2 外泌體分離方法

方法分離原理優(yōu)勢劣勢 超速離心沉降系數(shù)可大規(guī)模生產(chǎn)、分離純度高時間長(>4小時)、回收率低(5-25%)、重復(fù)性差 超濾大小和分子量操作簡單、快速回收率低、易損壞、變形 分子尺寸排阻色譜凝膠的孔徑和外泌體的大小高純度和高產(chǎn)量昂貴、色譜柱易污染、分離后分析費時費力 沉降試劑盒疏水性樣品量小、操作簡單特異性低、成本高 免疫學(xué)分離抗原-抗體反應(yīng)省時、高純度、程序簡單昂貴、不能大規(guī)模生產(chǎn) 電泳（DEP）分離大小和電荷快速、高產(chǎn)量低分辨率、低純度 微流控芯片大小快速、成本低、便攜、回收率高、工藝要求高、不能大規(guī)模生產(chǎn)

3 外泌體載藥系統(tǒng)

3.1 載藥方式

外泌體由脂質(zhì)雙分子層構(gòu)成。藥物主要有兩種包載方式：主動包載和被動包載。不同方法所得外泌體質(zhì)量不同，其藥物裝載率及穩(wěn)定性都不相同。

3.1.1 被動包載

被動包載的方法總體上比較簡單，主要分為以下兩種。一種是直接將外泌體與藥物進行混合后共孵育，藥物會順著濃度梯度進入外泌體中，裝載率與藥物的極性大小相關(guān)，但這種方法載藥效率低[20]。另一種是將藥物與外泌體供體細胞混合后共孵育，通過這些細胞胞吞藥物后再分泌出裝載了藥物的外泌體[29]。這種方法的載藥效率也不高[30, 31]，主要應(yīng)用于包載細胞毒性較低且脂溶性較高的小分子化學(xué)藥物[32]。

3.1.2 主動包載

主動包載相較于被動包載，其藥物包載率更高。大分子的裝載常通過主動包載這種方式被包載。主動包載主要包括超聲法、擠出法、反復(fù)凍融法、電致孔法，其中超聲法和擠壓法會破壞膜的完整性[33, 34]，異同點見表3。

3.2 影響載藥率的因素

3.2.1 外泌體/藥物比例

大多數(shù)研究傾向于使用較多的外泌體，該比例的選擇與藥物的特性有關(guān)。疏水性藥物應(yīng)先溶解于有機溶劑如醇類溶劑中，稀釋后再與外泌體溶液混合。而親水性藥物可預(yù)先溶解于生物相容的親水性溶劑中，再直接與外泌體溶液混合[28]。

3.2.2 外泌體細胞來源

不同細胞來源的外泌體其表面具有不同的標記蛋白[35]。而牛奶來源的外泌體價格低廉，可用于大規(guī)模生產(chǎn)，常被用于天然化合物和化療化合物的藥物輸送[36]，具有良好的前景[37-39]。

表3 外泌體主動包載方法

方法具體操作優(yōu)勢劣勢 超聲法均質(zhì)探頭超聲包載率高外泌體聚集、表面蛋白結(jié)構(gòu)改變 擠出法通過具有多孔膜的脂質(zhì)擠出機擠出載藥效率高、粒徑均一改變外泌體膜的性質(zhì) 反復(fù)凍融法混合物依次在室溫、液氮條件下共孵育，再解凍操作簡單、條件溫和、可大規(guī)模生產(chǎn)外泌體的聚集、包載率低 電致孔法利用電場在外泌體膜上打孔操作簡單RNA 沉淀、外泌體聚集

3.2.3 藥物性質(zhì)

外泌體的結(jié)構(gòu)是基于天然的膦脂雙層膜，具有親脂性，而親脂性藥物可以很好地融入到雙層結(jié)構(gòu)中，不容易從膜上釋放，從而具有持續(xù)釋放藥物的特性。根據(jù)藥物的相對親水性/疏水性，應(yīng)慎重選擇和優(yōu)化合適的裝載方法[28]。

4 總結(jié)與展望

本文主要介紹了外泌體的基本性質(zhì)、制備、載藥方式，并歸納了其作為藥物遞送載體的研究進展。

盡管外泌體作為藥物載體具有生物兼容性、穩(wěn)定性、內(nèi)在靶向性等潛在優(yōu)勢，但其作為藥物遞送系統(tǒng)的研究仍然不夠深入，還有很多問題有待解決，外泌體作為藥物載體從實驗室到市場有很長一段路要走，需要研究者的共同努力。

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（2022-04-01）

四川省科技廳重點研發(fā)項目（編號：2020YFS0103）；

巫瑤，女，四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室研究生，Email：1274795088@qq.com；

王霞，女，副主任技師，主要從事臨床檢驗工作，Email：80832491@qq.com；

萬莉紅，女，教授，主要從事藥理學(xué)教學(xué)與科研工作，Email：wanlihong1976@sina.com。