緊密連接蛋白Claudin-3的研究進(jìn)展*

李明航，劉海林，刁俊玲，周春巧 綜述，王 松 審校

(重慶兩江新區(qū)第一人民醫(yī)院藥劑科，重慶 401147)

緊密連接是細(xì)胞膜相鄰之間一起構(gòu)成的一道物理屏障。該屏障和細(xì)胞增殖、分化調(diào)控，以及腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的遷移有關(guān)[1]。緊密連接蛋白由細(xì)胞質(zhì)附著蛋白、跨膜蛋白和細(xì)胞骨架蛋白共同組成?？缒さ鞍子职ㄒ韵?種完整膜蛋白：連接黏附分子(JAM)、咬合蛋白(Occludin)、閉合蛋白(Claudin)。目前認(rèn)為，其主要作用的是Occludin和Claudin，尤其以Claudin的作用最為重要，這是形成緊密連接功能的主要蛋白。Claudin中的Claudin-3在維持細(xì)胞間物理屏障功能和參與分子細(xì)胞間傳遞方面發(fā)揮著重要作用。本文對(duì)Claudin-3目前的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以便臨床進(jìn)一步的了解Claudin-3在相關(guān)疾病檢測(cè)、診斷、治療及預(yù)后判斷方面的重要性。

1 緊密連接蛋白Claudin-3概況

Claudin是一類相對(duì)分子質(zhì)量在17～27 kDa的跨膜緊密連接蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)有近30個(gè)家族成員，其主要作用是維持細(xì)胞間的物理屏障功能及細(xì)胞極性[2-3]。緊密連接蛋白如果出現(xiàn)異常表達(dá)，則會(huì)使細(xì)胞間的屏障結(jié)構(gòu)遭到破壞，使細(xì)胞間的黏附力下降，導(dǎo)致細(xì)胞極性喪失，從而致使腫瘤發(fā)生[4-6]。在緊密連接的結(jié)構(gòu)中，每種Claudin蛋白都具有獨(dú)一無(wú)二的自身細(xì)胞旁離子選擇性[7]，其在人體內(nèi)的各種組織、器官的離子交換選擇性完全不同。在Claudin家族蛋白成員中，不同的蛋白會(huì)以多種排列組合方式參與構(gòu)成緊密連接的物理屏障，提高緊密連接的生物功能多樣性，為人體內(nèi)不同組織類型的物理屏障功能多樣性提供了分子學(xué)的理論依據(jù)。只要Claudin蛋白發(fā)生細(xì)微的改變，就會(huì)影響到整個(gè)緊密連接物理屏障的結(jié)構(gòu)和功能。這種細(xì)微的改變可以是基因突變，也可以是數(shù)量改變。一旦緊密連接物理屏障的功能遭到不可逆的破壞，上皮細(xì)胞之前存在的極性即遭到不同程度的改變，導(dǎo)致不同液體空間的脂質(zhì)和蛋白發(fā)生自由擴(kuò)散，2個(gè)不同內(nèi)環(huán)境之間的滲透屏障也會(huì)遭到破壞，最終直接導(dǎo)致組織的生物學(xué)特性發(fā)生改變，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)辜?xì)胞外環(huán)境潛在的有害物質(zhì)或病原體進(jìn)入機(jī)體。Claudin-3是構(gòu)成緊密連接的一種特異性跨膜蛋白，在不同類型的組織中，其表達(dá)也具有較大差異，這歸結(jié)于細(xì)胞內(nèi)分子信號(hào)的精確傳遞和其組織特異性。

2 Claudin-3的生物學(xué)特性

Claudin-3具有3種相互關(guān)聯(lián)的生物學(xué)特性：屏障功能、柵欄功能和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。緊密連接由分支狀封閉索網(wǎng)絡(luò)組成，每條封閉索獨(dú)立于其他封閉索作用。緊密連接防止離子通過(guò)的能力隨封閉索的數(shù)目呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。每條封閉索由一列嵌入2個(gè)原生質(zhì)膜的跨膜蛋白構(gòu)成，蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域使其彼此間一個(gè)個(gè)直接相聯(lián)。盡管還有其他蛋白存在，2種主要類型的蛋白是密封蛋白和Claudin。它們與位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)不同的外周膜蛋白相聯(lián)，后者則把封閉索錨定到肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架。因此，緊密連接連起了相鄰細(xì)胞的細(xì)胞骨架。緊密連接蛋白Claudin-3主要通過(guò)體內(nèi)蛋白激酶的途徑，對(duì)細(xì)胞與細(xì)胞連接處的選擇性滲透進(jìn)行調(diào)節(jié)。其中,蛋白激酶A和蛋白激酶C作用于Claudin-3蛋白上特定的氨基酸靶點(diǎn)，一般以絲氨酸和蘇氨酸為主要氨基酸。Claudin-3蛋白發(fā)生磷酸化后，其維持緊密連接的屏障及柵欄功能開(kāi)始下降，主要表現(xiàn)為外周氯化物的滲透增加，血腦屏障被破壞。此外，Claudin-3蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能也開(kāi)始下降，這可能與信號(hào)物質(zhì)及其蛋白結(jié)合物在細(xì)胞間的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散有關(guān)。

3 Claudin-3與疾病

Claudin-3是構(gòu)成內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的主要蛋白，當(dāng)其表達(dá)發(fā)生異常時(shí)可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞間結(jié)構(gòu)遭到損壞。研究發(fā)現(xiàn)，Claudin-3與多種疾病(如腦缺血、膽固醇結(jié)石、腫瘤等)密切相關(guān)。然而，Claudin-3與疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸具有復(fù)雜關(guān)系，且在這些疾病狀態(tài)下Claudin-3表達(dá)的調(diào)控機(jī)制仍需更深入的研究。

3.1Claudin-3與腦缺血 腦缺血是目前中老年人群中常見(jiàn)的腦血管疾病之一。有研究表明，血腦屏障結(jié)構(gòu)的破壞是導(dǎo)致早期腦缺血的主要病理學(xué)基礎(chǔ)。血腦屏障結(jié)構(gòu)主要由周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，星形細(xì)胞的足突包裹著毛細(xì)血管外周。內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接結(jié)構(gòu)是構(gòu)成血腦屏障的最重要部分。在腦微血管內(nèi)皮系統(tǒng)中，Claudin-3的表達(dá)十分豐富。Claudin-3是構(gòu)成內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的主要蛋白，當(dāng)其表達(dá)發(fā)生異常時(shí)可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞間結(jié)構(gòu)遭到損壞，血腦屏障通透性也隨之變化?？赡茉蚴?，磷酸化的Claudins-3會(huì)干擾緊密連接的形成[8]。HARTWIG等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在人類自身的免疫性腦脊髓炎和成膠質(zhì)胞瘤中，小靜脈上因?yàn)榘@炎性物質(zhì)，從而使緊密連接因失去Claudin-3而導(dǎo)致免疫著色。然而，其他緊密連接蛋白的結(jié)構(gòu)和功能未發(fā)生改變，由此可以推斷Claudin-3在體內(nèi)血腦屏障緊密連接的穩(wěn)定性方面起重要作用。Claudin-3與血腦屏障的結(jié)構(gòu)、功能密切相關(guān)，提示可以通過(guò)人為改變緊密連接蛋白Claudin-3的表達(dá)來(lái)改變血腦屏障的通透性，從而改變治療藥物在腦組織的有效溶度，這為今后治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病開(kāi)辟了新路徑，提供了新的藥物作用靶點(diǎn)。

3.2Claudin-3與膽固醇結(jié)石 膽固醇結(jié)石是一種主要常見(jiàn)于成人的疾病，發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)而增高。膽固醇結(jié)石常見(jiàn)病因包括肥胖、妊娠、糖尿病等。通常認(rèn)造成膽固醇結(jié)石的主要病理學(xué)基礎(chǔ)是膽固醇飽和度升高，所以臨床上膽固醇結(jié)石的治療主要針對(duì)高脂、年齡增長(zhǎng)相關(guān)的脂質(zhì)代謝紊亂等。實(shí)際上，構(gòu)成膽固醇結(jié)石的主要核心是鈣和對(duì)鈣敏感的碳酸根、磷酸根、硬脂酸根等陰離子，但是尚不清楚其在膽固醇結(jié)石形成中的作用機(jī)制。由于細(xì)胞間的緊密連接蛋白在調(diào)控水和某些陰離子經(jīng)過(guò)旁細(xì)胞途徑轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮著重要的屏障作用，張嘉昕等[10]將研究重點(diǎn)放在了小鼠肝臟中高表達(dá)的緊密連接蛋白Claudin-3。其發(fā)現(xiàn)在敲除了Claudin-3基因的小鼠肝臟中，旁細(xì)胞的屏障功能受到損壞，細(xì)胞間水、金屬離子、磷酸根離子的轉(zhuǎn)運(yùn)增加，導(dǎo)致膽汁中離子代謝出現(xiàn)失衡現(xiàn)象。正常飲食條件下，在敲除了Claudin-3基因的小鼠中可以觀察到深褐色沉淀物，沉淀物的主要成分是磷酸鈣。但是并未在敲除了Claudin-2基因的小鼠中發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)。進(jìn)一步在高脂飲食條件下，如果將小鼠的Claudin-3基因敲除，可以加速形成以磷酸鈣核心的淺褐色膽固醇結(jié)石，這為“高脂飲食條件下促進(jìn)膽固醇結(jié)石形成”的理論提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外，在小鼠肝臟中，Claudin-3的表達(dá)會(huì)隨年齡的增加而降低，這有助于更好地解釋膽固醇結(jié)石的發(fā)病率與年齡的關(guān)系。研究揭示了人體內(nèi)膽固醇結(jié)石形成的新機(jī)制：緊密連接蛋白Claudin-3受損缺失，導(dǎo)致旁細(xì)胞屏障功能降低，增加了離子經(jīng)肝膽管上皮的旁細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)通路，最終形成以磷酸鈣為主的膽固醇結(jié)石。

3.3Claudin-3與前列腺癌 研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌、結(jié)直腸癌和鼻咽癌等均有Claudins蛋白的異常表達(dá)，且Claudin-3在不同癌細(xì)胞中的表達(dá)量也不同。緊密連接蛋白的異常表達(dá)導(dǎo)致上皮細(xì)胞滲透屏障遭到破壞，細(xì)胞極性喪失，細(xì)胞間的黏附力下降，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。在某些惡性腫瘤發(fā)生的時(shí)候[11]，Claudin蛋白總體表達(dá)水平明顯下降，這被認(rèn)為是細(xì)胞間黏附性丟失的機(jī)制和腫瘤細(xì)胞發(fā)生及轉(zhuǎn)移的重要步驟。然而，臨床在多數(shù)腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)，Claudin表達(dá)水平較正常細(xì)胞組織明顯升高[12]，這意味著Claudin表達(dá)上調(diào)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中也起到了促進(jìn)作用。Claudin-3跨膜蛋白在細(xì)胞間的傳輸和轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用，而細(xì)胞黏附功能的基礎(chǔ)又是緊密連接，這與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[13]。畢罡等[14]研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于前列腺增生組織，Claudin-3蛋白在前列腺癌組織中的表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AGARWAL等[15]利用Northen印跡發(fā)現(xiàn)，與周圍正常組織比較，人類前列腺癌組織上皮細(xì)胞中的Claudin-3基因轉(zhuǎn)錄信使RNA水平顯著增高；采用免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，骨轉(zhuǎn)移灶中的Claudin-3蛋白表達(dá)水平也出現(xiàn)增高現(xiàn)象。2種差異性的表達(dá)使得Claudin-3蛋白有可能成為診斷前列腺癌的候選癌標(biāo)。Claudin-3也是產(chǎn)氣莢膜桿菌腸毒素(CPE)的受體，可以通過(guò)CPE對(duì)高表達(dá)Claudin-3蛋白的腫瘤組織產(chǎn)生特異性細(xì)胞溶解作用，這可以為探索Claudin-3表達(dá)上調(diào)的腫瘤治療新技術(shù)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。李家兵等[16]通過(guò)檢測(cè)前列腺癌和良性前列腺增生組織中的Claudin-3信使RNA表達(dá)水平平，發(fā)現(xiàn)Claudin-3信使RNA在前列腺癌組織和良性前列腺增生組織中的表達(dá)水平有顯著性差異，其在前列腺癌組織中的表達(dá)水平高，而在良性前列腺增生組織中的表達(dá)水平低，推測(cè)Claudin-3可能成為診斷前列腺癌的候選癌標(biāo)，也可能成為前列腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。

3.4Claudin-3與結(jié)直腸癌 目前，我國(guó)的結(jié)直腸癌發(fā)病率位居惡性腫瘤疾病第4位，且仍有上升趨勢(shì)[17]。有研究證實(shí)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在癌癥的發(fā)生、進(jìn)展中起重要作用，其主要表現(xiàn)是緊密連接結(jié)構(gòu)在腫瘤邊緣細(xì)胞處遭到破壞。緊密連接是相鄰細(xì)胞膜與細(xì)胞膜共同構(gòu)成的物理屏障，與細(xì)胞增殖、分化調(diào)控及腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)[1]。陳宗池等[18]發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組中的Claudin-3表達(dá)水平明顯高于正常結(jié)直腸組及結(jié)直腸腺瘤組，結(jié)直腸腺瘤組的Claudin-3表達(dá)水平也顯著高于正常結(jié)直腸組。YASUNORI等[19]通過(guò)體外細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，Claudin-3在結(jié)直腸癌細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，提示Claudin-3表達(dá)上調(diào)可能參與惡性腫瘤的發(fā)生。當(dāng)Claudin蛋白發(fā)生異常表達(dá)時(shí)，上皮細(xì)胞對(duì)細(xì)胞旁通路的通透性發(fā)生異常，促進(jìn)癌癥的發(fā)生[20]。YAXI等[21]通過(guò)小鼠動(dòng)物模型對(duì)結(jié)直腸癌組織中Claudin-3的表達(dá)變化進(jìn)行了體內(nèi)和體外研究。結(jié)果表明，通過(guò)激活SCF/c-kit/JNK/AP-1細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可使Claudin-3在結(jié)直腸癌組織中的水平升高，結(jié)直腸癌的發(fā)生可能與Claudin-3的異常表達(dá)有關(guān)，提示Claudin-3有可能成為早期診斷結(jié)直腸癌的檢測(cè)指標(biāo)之一。癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要步驟是對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和間皮細(xì)胞的侵襲[22]，而腫瘤轉(zhuǎn)移涉及到一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)的過(guò)程，只有完成這些級(jí)聯(lián)反應(yīng)，癌細(xì)胞才能轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處。而要完成上述轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)反應(yīng)，就必須破壞緊密連接的物理屏障作用，導(dǎo)致細(xì)胞極性和細(xì)胞間的黏附性丟失。Claudin-3在細(xì)胞黏附功能的丟失、轉(zhuǎn)移過(guò)程起重要作用。因此，破壞Claudin-3維持緊密連接的完整性是完成轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵步驟。但是，由于樣本量有限及缺少相關(guān)機(jī)制研究，Claudin-3能否作為結(jié)直腸癌的治療靶點(diǎn)有待深入基礎(chǔ)和臨床研究。

3.5Claudin-3與鼻咽癌 鼻咽癌是一個(gè)多階段變異累積、多基因參與形成的病理過(guò)程。尋找鼻咽癌的分子標(biāo)志物將有利于個(gè)體化治療方案選擇及預(yù)后評(píng)估。研究表明，Claudin蛋白在惡性腫瘤發(fā)展的一系列病理生理過(guò)程中發(fā)揮作用[23]。Claudin-3也是如此，其在不同的腫瘤組織中呈現(xiàn)不同的表達(dá)水平，也發(fā)揮著不一樣的作用。陳茹等[24]發(fā)現(xiàn)，Claudin-3在鼻咽癌組織中的表達(dá)率要高于鼻咽癌旁組織，但是兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。然而，在病理分期更高的鼻咽癌組織，Claudin-3的表達(dá)率更高，多項(xiàng)研究顯示了鼻咽癌的臨床分期與血清EB病毒抗體的滴度有關(guān)[25-26]，推斷Claudin-3的表達(dá)升高與鼻咽癌臨床分期有關(guān)，Claudin-3可能在鼻咽癌的病程發(fā)展中起一定作用。近年來(lái)，腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的細(xì)胞間連接功能異常逐漸受到重視，干預(yù)該過(guò)程的關(guān)鍵蛋白從而抑制腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移已成為腫瘤研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。Claudin-3的異常表達(dá)與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，有望成為治療鼻咽癌的新靶點(diǎn)，可對(duì)其開(kāi)展深入研究。

4 小結(jié)與展望

緊密連接蛋白Claudin-3是構(gòu)成細(xì)胞間緊密連接的主要功能蛋白，通過(guò)細(xì)胞間的物理屏障、細(xì)胞間旁路轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的平衡。雖然Claudin-3在相關(guān)疾病及腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的確切作用機(jī)制還不清楚，但是Claudin-3蛋白在腫瘤和正常組織中表達(dá)水平存在差異，可利用Claudins家族蛋白表達(dá)存在的高度組織特異性，對(duì)Claudin-3的表達(dá)情況和其調(diào)節(jié)因子的作用機(jī)制進(jìn)行深入探索。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展和對(duì)Claudins-3結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步深入研究，Claudins-3在多種惡性腫瘤的檢測(cè)、診斷、治療中將會(huì)成為一個(gè)新的靶點(diǎn)。