間充質干細胞在特發(fā)性肺纖維化治療中的應用

段春艷 ，高凌云，2△

(1.電子科技大學醫(yī)學院，四川 成都 610054；2.四川省人民醫(yī)院·四川省醫(yī)學科學院東院，四川 成都 610101)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是間質性肺病(interstitial lung disease, ILD)中最常見的一種疾病，占所有ILD病例的17%～86%[1]。目前臨床治療IPF的方案包括抗纖維化藥物、糖皮質激素、肺移植等[2]，這些方案治療效果并不明顯，還可能帶來嚴重的副作用。當前IPF患者的生活質量低下，亟待安全、有效、方便的治療藥物來改善IPF患者的預后。間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的多功能性及其調節(jié)免疫、抑制炎癥和促進上皮組織修復的能力促使MSCs快速在IPF治療中的應用。本文綜述了IPF的流行病學及發(fā)病機制、MSCs體外移植治療IPF的臨床前研究和已知結果的臨床研究，并分析提高MSCs治療效率策略，以指導設計未來的臨床研究，來治療這一病因復雜的疾病。

1 IPF的流行病學及發(fā)病機制

IPF是一種與肺組織結構重塑和成纖維細胞過度沉積有關的慢性肺部疾病，具體發(fā)病機制至今不明。據(jù)統(tǒng)計，1998～2010年，在英國因肺纖維化住院的患者以大約每年5%的速度在增長，平均發(fā)病年齡為66～71歲，老年男性最為多見[3]。IPF全球發(fā)病率為(0.09～1.30)/10萬，流行率為(0.33～4.51)/10萬[4]。IPF的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢，全球IPF患者約500萬人，患者診斷IPF后，如果不經治療，平均預期壽命不超過5年，死亡率超過了許多惡性腫瘤[1]。

雖然IPF機制尚未闡明，但已有的研究對其病因的理解是在損傷等病理環(huán)境中肺泡上皮細胞反復損傷后致肺間質細胞成分的改變。肺泡上皮細胞功能障礙被認為是IPF 發(fā)病的關鍵步驟，IPF上皮細胞損傷后的異常修復反應是疾病發(fā)生的一個重要機制。肺纖維化發(fā)病的關鍵步驟是肺泡上皮細胞損傷后無法執(zhí)行自身的修復功能障礙，進而分泌大量的促炎因子及致纖維化細胞因子造成間質中成纖維細胞增殖活化、巨噬細胞極化狀態(tài)改變，促進成纖維細胞向肌成纖維細胞分化，形成支持纖維形成的正反饋環(huán)，不斷促進纖維細胞灶的形成和細胞外間質(extracellular matrix, ECM)過多沉積以及異常上皮-間充質轉變(epithelail-mesenchymal transition, EMT)和內皮-間充質轉化，最終導致正常肺泡結構破壞、持續(xù)的組織重塑與永久性纖維瘢痕的形成[5]。

2 MSCs治療肺纖維化現(xiàn)狀

2.1 MSCs體外移植治療肺纖維化臨床前研究現(xiàn)狀近年來，以干細胞治療為核心的再生醫(yī)學技術，尤其是MSCs，為人類難治性疾病的治療帶來了希望，同時也為MSCs移植治療IPF提供了新的思路。MSCs可以從許多組織來源進行分離和鑒定出來，包括骨髓、臍帶、脂肪組織及胎盤等。1995年，Haynesworth等[6]首次將MSCs作為細胞藥物制劑進行臨床應用。2003年，Ortiz等[7]首次發(fā)現(xiàn)MSCs可顯著減輕小鼠肺纖維化。

大多數(shù)肺纖維化的動物模型中[8～10]，外源性MSCs移植治療已經達到了預期的效果。 MSCs可減少肺組織炎癥反應、膠原蛋白沉積和細胞外基質產生、降低了支氣管肺泡灌洗液中炎癥標志物、改善Ashcroft評分，提高了存活率，對急性肺纖維化有很大的治療效果。當肺組織受損時，MSCs可被激活并被召集到受傷的肺組織，通過分泌生物活性分子和調節(jié)局部免疫反應，減輕局部炎癥反應，抑制纖維增殖，增強內源性肺損傷抵抗力，從而建立了一個促進肺泡上皮再生的微環(huán)境。

以往關于MSCs可能治療肺纖維化的機制為：當肺組織存在損傷時，MSCs可歸巢至博來霉素誘導的小鼠肺損傷區(qū)域[7],在可溶性介質中的趨化因子基質細胞衍生因子-1與細胞膜表面的同源受體CXCR4的相互作用下，MSCs遷移到損傷和炎癥部位[11]，并通過典型Wnt通路(糖原合成酶激酶3β和β-連環(huán)蛋白)和非典型 Wnt 通路(c-Jun氨基末端激酶和蛋白激酶C)分化為II型肺泡上皮細胞，發(fā)揮修復受損的細胞以減輕肺纖維化[12]。但新近學者通過命運追蹤技術發(fā)現(xiàn)，MSCs的歸巢很少見，并未通過向肺泡上皮細胞分化達到抗纖維化作用[13]。那MSCs究竟是如何發(fā)揮抗纖維化的作用呢？近年來，在體內外實驗的研究種發(fā)現(xiàn)MSCs衍生的分泌組才是MSCs真正發(fā)揮抗纖維化的重要組成部分。MSCs來源的分泌物主要由可溶性蛋白、細胞外囊泡和細胞器構成，而研究最多的是細胞外囊泡其中的一個亞型-外泌體。外泌體是MSCs在靜息或缺氧應激、凋亡、剪切力等因素刺激下分泌產生的小圓形膜片，直徑在50～100 nm，包含mRNA、 miRNA 以及線粒體等，是促進細胞間信息交流的重要機制，具有明確的組織再生修復作用以及潛在的免疫調節(jié)、調控細胞生長分化等功能，是干細胞領域具有重要研究價值的新興熱點。外泌體可通過激活轉化生長因子信號通路、Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路來調節(jié)上皮間質轉化，調控單核細胞表型[14]，修復受損的上皮細胞與抑制肌成纖維細胞達到逆轉肺纖維化的作用[15]。

其它關于MSCs治療肺纖維化的可能的機制如下：①抗氧化應激：MSCs能有效降低博萊霉素致肺損傷后炎性氧自由基水平，改善超氧化物歧化酶、谷胱甘肽等氧化損傷指標，對肺組織具有保護作用[16]；②抗炎：MSCs主要是通過激活細胞分泌腫瘤壞死因子刺激基因6抑制核轉錄因子復合物向細胞核的激活和轉運，減少促炎細胞因子腫瘤壞死因子-α、白介素-1、干擾素γ和白細胞介素-6的分泌[17]；前列腺素E2與巨噬細胞上的前列腺素E2受體和前列腺素E4受體結合，促進巨噬細胞分泌抗炎性細胞因子白介素-10的表達。③免疫調節(jié)：MSCs降低巨噬細胞和樹突狀細胞CD80共刺激分子的表達和密度，降低其誘導抗原特異性T細胞免疫反應的能力； 通過Fas/FasL信號通路直接誘導活化T細胞凋亡，緩解異常過度免疫反應[18]；MSCs通過促進巨噬細胞向M2表型轉化和減少來自巨噬細胞和樹突狀細胞的趨化因子的表達來調節(jié)免疫反應，進一步減少炎癥細胞浸潤和炎癥相關細胞因子的含量[19]，減少B細胞的募集，維持肺部免疫平衡；④抑制EMT：MSCs可通過改變內質網應激與自噬作用，從而抑制EMT[20]；⑤減少促纖維介質的產生：降低促纖維化因子 Co11a1和 Co13a1的表達，達到減少肺纖維化進程的目的；抑制轉化生長因子-β/SMAD-3信號通路的激活，從而抑制肌成纖維細胞的激活，進一步減少膠原等ECM的合成[21]；調節(jié)基質金屬蛋白酶/組織金屬蛋白酶抑制劑的比例來直接抵消纖維化過程[22]，從而減少膠原纖維的含量并抑制肺重塑；可通過增加巨噬細胞基質金屬肽酶-9的表達以降解膠原蛋白。⑥旁分泌作用：MSCs通過分泌多種生長因子、趨化因子和受體實現(xiàn)免疫調節(jié)功能，這些生物活性分子調節(jié)局部免疫反應，重構了肺微環(huán)境，并抑制炎癥和修復受損組織[23]。

大部分臨床前研究探討的是早期炎癥階段而不是纖維化晚期。研究發(fā)現(xiàn)，初始炎癥期或纖維化早期注射MSCs后，可減少纖維化形成；而在慢性纖維化期注射MSCs后，可能加重纖維化，這可能與MSCs也能分泌轉化生長因子β有關[24]。然而，Liu 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，分泌較高水平轉化生長因子-β的MSCs對博來霉素誘導的小鼠肺纖維化卻具有抗纖維化作用。

2.2 MSCs治療臨床研究現(xiàn)狀臨床前動物實驗的數(shù)據(jù)結果令人興奮，但將MSCs用于開展肺纖維化患者臨床試驗，比較擔心MSCs安全性及有效性問題；擔心MSCs會進一步加重肺纖維化的形成，而無逆轉肺纖維化的作用；擔心移植MSCs后腫瘤形成的可能性。

基于上述擔心，這些問題已經在幾個已經完成的臨床試驗中得到評估。全球范圍開展的干細胞治療肺纖維化臨床試驗多集中在I/II期，目前暫無上市獲批產品。一項在澳大利亞進行的Ib期單中心非隨機研究(NCT01385644)[26]，探討靜脈輸注異體胎盤MSCs對IPF患者的治療潛力，用1×106/kg、2×106/kg的MSCs分別治療了4例中重度IPF患者，結果發(fā)現(xiàn)患者對這兩種劑量的干細胞都耐受，只有輕微和一過性急性不良反應，但是隨訪6個月后，各項監(jiān)測指標(包括用力肺活量、一氧化碳彌散量、6分鐘步行試驗和CT纖維化評分)均較基線無改變，并沒有減輕肺纖維化。在另一個的Ⅰ期臨床試驗(NCT02013700)中[27]，將9例輕中度IPF患者分成3組，每組分別靜脈輸注20×106、100×106、200 ×106個骨髓MSCs，評估了單次靜脈輸注骨髓MSCs治療IPF的安全性問題。隨訪期間，沒有發(fā)生與治療相關及急性嚴重不良事件，僅2例因IPF的進展而非與治療相關的死亡發(fā)生，共有21例不良反應報告(最常見的不良記錄是3例支氣管炎和2例普通感冒)，在輸注60周后，F(xiàn)VC預測值的平均下降率為3.0%，一氧化碳彌散量預測值下降率為5.4%。2020年發(fā)表在《干細胞轉化醫(yī)學》上的一項研究[28]首次揭示了對于肺功能迅速下降的IPF患者來說，高累積劑量的同種異體 MSCs(共計1.6×109個/例)治療是安全和可耐受的，經治療52周后接受MSCs組臨床癥狀顯著改善，無嚴重不良反應，但該臨床試驗發(fā)現(xiàn)試驗組與對照組之間死亡率及高分辨率 X射線計算機斷層成像纖維化評分無差異。一項隨訪時間長達60月關于IPF患者細胞治療的縱向結果的研究[29]，該報告指出IPF患者接受支氣管內輸注脂肪間充質干細胞過程中，未發(fā)現(xiàn)與治療相關的嚴重不良反應，但患者距離第一次給藥2年后出現(xiàn)肺功能下降，患者總體生存率及疾病進展時間與已經發(fā)表的未經治療IPF人群的流行病學以及與吡非尼酮和尼達尼布的大型III期隨機對照試驗的安慰劑組相似。一項I期多中心IPF支氣管內自體骨髓MSCs臨床試驗(NCT01919827)發(fā)現(xiàn)3例患者的MSCs在培養(yǎng)后,檢測到染色體畸變，MSCs的基因組不穩(wěn)定可能會給IPF患者使用自體骨髓MSCs帶來麻煩[30]。

目前尚未報道MSCs治療肺纖維化相關的嚴重不良反應和與治療相關腫瘤形成，但由于動物和人類的差異以及臨床試驗樣本量小，該藥物在人體中的安全性和有效性仍然值得懷疑和高度重視，需開展多中心的隨機對照臨床試驗來證明 MSCs 治療IPF患者的安全性及療效。

3 提高MSCs治療效率策略

第一代基于原代干細胞(如MSCs及其衍生物)的療法，在過去數(shù)十年里，已被廣泛應用于各種復雜性的疾病。然而MSCs治療效果并未滿足臨床試驗的要求，并且將MSCs成功運用于臨床需要克服許多挑戰(zhàn)，因此如何增強MSCs的功效以適應宿主微環(huán)境成為當務之急。直到最近幾年，第二代基于干細胞的療法-細胞工程技術的出現(xiàn)，才極大的擴展了MSCs治療領域的應用范圍并提高了MSCs的特異性及有效性。干細胞工程是通過體外培養(yǎng)MSCs、誘導MSCs定向分化、利用基因編輯技術(如成簇而規(guī)律地間隔短回文重復序列-Cas系統(tǒng))對MSCs進行遺傳修飾，使改造后的MSCs具有增強的歸巢、效價或擴增能力。一項研究發(fā)現(xiàn)成簇而規(guī)律地間隔短回文重復序列-Cas9系統(tǒng)介導的可逆永生化小鼠骨髓基質干細胞具有MSCs的多功能特性[31]，這種工程化的MSCs可以作為原代MSCs的一個具有重要前景的替代來源，用于再生醫(yī)學領域的基礎研究和轉化研究。此外還包括以下幾種策略：①通過小分子、缺氧或生物材料對結構的刺激來啟動MSCs，以細胞因子、生長因子、缺氧、藥物、不同的生物材料、不同的培養(yǎng)條件以及其他不同的分子進行預處理，提高MSCs的存活增殖、遷移能力、免疫調節(jié)以及治療效果[32]；②利用MSCs分泌組作為藥物輸送平臺進行靶向治療[33]，未來將MSCs分泌組作為無細胞藥物靶向定位目標器官以進行治療，將發(fā)揮極大的臨床應用價值；③通過提供一種支持MSCs粘附的支架來改善MSCs生存能力和功能的生物材料。未來將有更多提高MSCs治療效果的方式，MSCs療效將進一步得到證實。

4 MSCs治療肺纖維化當前挑戰(zhàn)與展望

在過去幾十年中，MSCs被廣泛運用于臨床。雖然各種動物疾病模型的臨床前研究令人欣喜，但是否針對人體的慢性肺纖維化期，仍需要進一步探索和研究。將MSCs療法用于多種人類疾病的注冊臨床試驗尚未達到預期效果。成功應用MSCs治療IPF患者仍需要克服許多挑戰(zhàn)，主要挑戰(zhàn)包括不同來源的MSCs的免疫相容性、穩(wěn)定性、異質性、分化和遷移能力以及與宿主微環(huán)境的不一致性。應對MSCs治療IPF患者的長期隨訪上,以確定MSCs治療可能的致癌作用和能否逆轉肺纖維化以提高IPF患者的生存率。在進行大規(guī)模臨床試驗之前，必須考慮影響MSCs在體內活性的重要因素，包括干細胞組織來源及細胞類型、供體和受體、給藥途徑、輸注方式、劑量和給藥頻率，以及對MSCs的預處理，確定在哪個階段的IPF患者是最應該接受哪種類型MSCs治療以及藥物之間的相互作用，以最大限度提高其治療效果，同時減少潛在的副作用。MSCs有望是逆轉肺纖維化的有效治療手段之一。