骨關(guān)節(jié)炎的可溶性生物標(biāo)志物研究進(jìn)展

李建平，張鳳綜述 彭飛審校

骨關(guān)節(jié)炎(osteroarthritis,OA)是老年人最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)疾病，全世界有2.5億人患病，并給整個(gè)社會(huì)和經(jīng)濟(jì)帶來(lái)了巨大的負(fù)擔(dān)[1]。骨關(guān)節(jié)炎生物標(biāo)志物是關(guān)節(jié)組織轉(zhuǎn)換產(chǎn)生的分子碎片，并釋放到滑膜液、血液和尿液中，它們具有獨(dú)特的動(dòng)態(tài)變化、高敏感度和易于測(cè)量的特點(diǎn)，這些特性可能會(huì)克服目前評(píng)估OA方法的一些局限性，其中包括常規(guī)可溶性生物標(biāo)志物、蛋白源性可溶性生物標(biāo)志物、X型膠原可溶性生物標(biāo)志物、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白新表位、活性酶、骨膜蛋白、小分子核糖核酸，它們的出現(xiàn)為OA的診斷和預(yù)后提供幫助。本文對(duì)傳統(tǒng)和最新的生物標(biāo)志物的生化特征進(jìn)行綜述，并評(píng)估它們是否能解決目前OA治療中的不足。

1 關(guān)節(jié)組織中常規(guī)的可溶性生物標(biāo)志物

常規(guī)的生物標(biāo)志物是用常規(guī)生物化學(xué)技術(shù)發(fā)展出來(lái)的生化指標(biāo)，它們從組織中釋放的確切結(jié)構(gòu)和過(guò)程并不明確。主要的常規(guī)標(biāo)志物詳細(xì)描述并分為5類(lèi):疾病嚴(yán)重性、研究?jī)r(jià)值、預(yù)后、療效和診斷，而所謂的BIPED分類(lèi)是指合成代謝或分解代謝的標(biāo)志物，即使這種區(qū)分并不總是完全準(zhǔn)確的[2]。因?yàn)棰蛐湍z原是軟骨基質(zhì)的主要有機(jī)成分，所以對(duì)軟骨Ⅱ型膠原的形成和降解得到了廣泛的研究。Ⅱ型膠原形成之前是通過(guò)測(cè)量血液中C端和N端肽(分為PⅡCP和PⅡNP)的水平來(lái)評(píng)估的。當(dāng)前膠原轉(zhuǎn)化為成熟的Ⅱ型膠原時(shí)，這些前肽被特定的蛋白酶剪切。PⅡNP以2種剪接替代形式存在，不同的是由PⅡNP高表達(dá)(PⅡANP)或PⅡNP低表達(dá)(PⅡBNP)。一種測(cè)定血清PⅡANP的方法已經(jīng)開(kāi)發(fā)出來(lái)，通常在胚胎中表達(dá)陰性但在OA軟骨中表達(dá)相反。PⅡBNP主要在健康成人Ⅱ型膠原形成過(guò)程中表達(dá)。雖然PⅡANP和PⅡBNP應(yīng)該反映相同的代謝過(guò)程，但是PⅡANP和PⅡBNP在來(lái)自O(shè)A患者的相同樣本中評(píng)估時(shí)沒(méi)有顯著相關(guān)性。然而，與正常人相比，OA患者血液中這2種物質(zhì)的水平均下降[3]。

2 關(guān)節(jié)組織中新的可溶性生物標(biāo)志物

2.1 蛋白源性可溶性生物標(biāo)志物 最近，研究人員已經(jīng)開(kāi)始研究參與影響膠原形成的酶，這些酶用作第二代生物標(biāo)志物，其中包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原酶，但是這些標(biāo)志物具有不穩(wěn)定性的缺點(diǎn)。研究者發(fā)現(xiàn)，許多方法可以直接或間接檢測(cè)Ⅱ型膠原的存在[4]。研究指出Ⅱ型膠原生物標(biāo)志物特異性抗體的識(shí)別受到脯氨酸羥基化的影響。OA中新合成的軟骨中羥脯氨酸的含量高于正常軟骨，這表明羥基化水平間接反映Ⅱ型膠原降解水平。因此，科學(xué)家們隨后開(kāi)發(fā)了三明治CIINE分析，識(shí)別膠原酶切割的Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型膠原的C端新表位，并對(duì)羥基化和非羥基化形式具有相似的親和力。研究通過(guò)人尿夾心試驗(yàn)IB-C2C-HUSA的結(jié)果指出C端新表位序列與用于捕獲抗體的CIINE的序列非常相似[5]。研究用CIIM檢驗(yàn)Ⅱ型膠原的降解，這種方法可以產(chǎn)生更多的降解產(chǎn)物，因此可以在血清中測(cè)量[6]。CIIM和CTX-Ⅱ在OA患者軟骨較正常者軟骨高表達(dá)。EILCA法也可以檢測(cè)血清CTX-Ⅱ。然而，在一項(xiàng)膝關(guān)節(jié)OA患者的研究中，血清CTX-Ⅱ水平與尿液CTX-Ⅱ水平不相關(guān)[7]。Ⅲ型膠原酶代謝也會(huì)影響骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生，檢測(cè)方法分別為COL3-ADAMTS測(cè)定方法、競(jìng)爭(zhēng)性Pro-C3檢測(cè)、競(jìng)爭(zhēng)性C3M檢測(cè)和IIINys檢測(cè)，這些標(biāo)志物的差異性表達(dá)與OA的發(fā)生相關(guān)。

2.2 Helix-Ⅱ可溶性生物標(biāo)志物 Helix-Ⅱ是最初用于測(cè)量人類(lèi)Ⅱ型膠原降解的生物標(biāo)志物。雖然用于檢測(cè)Helix-Ⅱ片段的抗體早已發(fā)現(xiàn)，但是通過(guò)對(duì)人類(lèi)軟骨Ⅱ型膠原的直接測(cè)序證實(shí)之前公布的序列是不正確的，因此，Helix-Ⅱ?qū)Β蛐湍z原的特異性受到質(zhì)疑。研究證實(shí)，4-羥脯氨酸的存在是Helix-Ⅱ抗體識(shí)別的關(guān)鍵[8]。因此，Helix-Ⅱ抗體的一個(gè)潛在靶點(diǎn)是Ⅲ型膠原，因?yàn)?-羥脯氨酸都存在于人類(lèi)Ⅲ型膠原序列中。而Ⅲ型膠原在人軟骨基質(zhì)中大量存在，故檢測(cè)起來(lái)相對(duì)簡(jiǎn)單。大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，Helix-Ⅱ是評(píng)估關(guān)節(jié)炎中關(guān)節(jié)組織改變的一個(gè)有價(jià)值的標(biāo)記。與性別和年齡匹配的健康對(duì)照組相比，膝關(guān)節(jié)OA患者和早期RA患者的尿液Helix-Ⅱ水平顯著升高，經(jīng)歷抗腫瘤壞死因子治療1個(gè)月后，血清Helix-Ⅱ水平下降明顯。而在髖關(guān)節(jié)早期OA患者中，尿Helix-Ⅱ和尿CTX-Ⅱ聯(lián)合測(cè)量比單獨(dú)測(cè)量任何一種標(biāo)志物更有效地發(fā)現(xiàn)疾病[9]。這種關(guān)系可能是由于Helix-Ⅱ和CTX-Ⅱ在OA軟骨基質(zhì)中的不同定位，以及它們從人類(lèi)軟骨膠原中產(chǎn)生的分解代謝酶的不同方式[10]。此外，由于Ⅲ型膠原既存在于滑膜組織，也存在于軟骨組織，這使得Helix-Ⅱ成為OA獨(dú)特綜合生物標(biāo)志物[11]。

2.3 Ⅹ型膠原可溶性生物標(biāo)志物 X型膠原是一種非纖維性膠原，也是人OA軟骨中高表達(dá)的肥厚軟骨細(xì)胞分化的標(biāo)志物，其中包含NC1結(jié)構(gòu)域和膠原區(qū)域的可變部分，其核心為C-Col 10[12]。研究發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，OA患者血清C-Col 10水平也與血清C2M水平顯著相關(guān)，表明軟骨細(xì)胞肥大與關(guān)節(jié)軟骨降解密切相關(guān)[13]。最近研究利用氣相色譜和質(zhì)譜技術(shù)在OA患者的尿液中鑒定出組織蛋白酶K生成的Ⅹ型膠原螺旋部分的新表位，稱(chēng)為Col-10 neo[14]。在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，OA患者的血漿Col-10 neo水平高于正常人[15]。在過(guò)去的幾年里，針對(duì)由特定酶產(chǎn)生的Ⅱ型膠原新表位的第二代降解標(biāo)記已經(jīng)開(kāi)發(fā)出來(lái)，并專(zhuān)門(mén)用于檢測(cè)軟骨基質(zhì)中Ⅲ型和Ⅹ型膠原的降解。然而尚不清楚它們是否可以作為替代或比目前更成熟的膠原生物標(biāo)志物聯(lián)合用于評(píng)估OA患者。

2.4 全軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(total cartilage oligomeric matrix protein,COMP)、D-COMP、COMP新表位 COMP是關(guān)節(jié)軟骨的一種非膠原蛋白。根據(jù)BIPED分類(lèi)，血清COMP水平與OA疾病的診斷、疾病預(yù)后相關(guān)[16]。以往研究指出，血清COMP水平可以預(yù)測(cè)疼痛患者OA的發(fā)生率[17]。D-COMP是COMP蛋白的脫氨基形式。血清D-COMP水平與髖關(guān)節(jié)OA的嚴(yán)重程度相關(guān)，但與膝關(guān)節(jié)OA無(wú)關(guān)。相反，血清中總COMP水平與膝關(guān)節(jié)相關(guān)，而與髖關(guān)節(jié)無(wú)關(guān)，這表明D-COMP可能是關(guān)節(jié)特異性的[18]。最后，研究出2種針對(duì)總COMP和COMP新表位的自動(dòng)檢測(cè)方法。這2項(xiàng)檢測(cè)的比值可以區(qū)分膝關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié)OA患者的診斷[19]。

2.5 活性酶 目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種方法能夠測(cè)量可能與OA疾病有關(guān)的活性酶的濃度，特別是組織蛋白酶K和MMP-3的活性形式[20]。這2種酶都是作為原酶合成的，在激活過(guò)程中，信號(hào)肽被剪切，產(chǎn)生被特異性抗體識(shí)別的蛋白水解新表位，包括adamts-4、adamts-5、MMP-3和MMP-9?，F(xiàn)研究出針對(duì)adamts-4、adamts-5、MMP-3和MMP-9的特異性檢測(cè)方法。由于酶在體內(nèi)廣泛分布，預(yù)計(jì)當(dāng)在血清中測(cè)量時(shí)，這些標(biāo)志物對(duì)關(guān)節(jié)組織缺乏特異性[21]。此外，由于循環(huán)中活性酶的濃度很低，這類(lèi)生物標(biāo)志物的敏感度可能會(huì)受限。顯然，活性酶濃度和OA之間的關(guān)系需要進(jìn)一步的研究。

2.6 骨膜蛋白(POSTN) POSTN是由成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞合成的分泌蛋白，在軟骨下骨和軟骨基質(zhì)之間對(duì)OA產(chǎn)生影響，貫穿OA疾病的全程[22]。在一項(xiàng)絕經(jīng)后婦女的前瞻性研究中，膝關(guān)節(jié)OA患者血清POSTN水平顯著低于對(duì)照組[23]。在另一項(xiàng)研究中，膝關(guān)節(jié)OA患者和對(duì)照組的血漿POSTN水平?jīng)]有顯著差異，但此項(xiàng)研究中POSTN采用不同的測(cè)定方法評(píng)估[24]。在以往研究中大量來(lái)自蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的標(biāo)志物已經(jīng)開(kāi)發(fā)出來(lái)。然而，只有少數(shù)對(duì)幾個(gè)特征明顯標(biāo)志物進(jìn)行了臨床研究。為了分析它們?cè)贠A管理中的潛在臨床效用，這些新的檢測(cè)方法需要在技術(shù)上得到改進(jìn)。

2.7 小分子核糖核酸 表觀遺傳學(xué)是遺傳學(xué)的一個(gè)領(lǐng)域，細(xì)胞表型的變化被認(rèn)為是由調(diào)節(jié)基因活動(dòng)的外部因素造成的。MicroRNAs(miRNAs)可能在OA中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因?yàn)槠渲幸恍┦菂⑴c軟骨發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和骨關(guān)節(jié)炎病理的基因調(diào)控因子。一些體外和體內(nèi)的研究已經(jīng)證明，miRNA參與了OA的發(fā)生和進(jìn)展，到目前為止，已證明46個(gè)miRNA與OA相關(guān)[25]。與對(duì)照組相比，患有輕度至中度OA的絕經(jīng)后女性血清miR-146a-5p表達(dá)增加。重要的是，血清miR-186在未來(lái)4年將出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)OA的女性中也會(huì)增加，因此它可能有能力檢測(cè)膝關(guān)節(jié)OA的臨床前水平[26]。研究人員還發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，OA患者軟骨中miR-146-5p顯著上調(diào)，血清miR-146-5p水平升高，證實(shí)了該miRNA作為OA生物標(biāo)志物的臨床應(yīng)用價(jià)值[27]。近期發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，OA患者的滑膜液中miR-140和miR-199水平下調(diào)，并與OA疾病的進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)，提示miR-140和miR-199可能通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-3和IL-1β mRNA的表達(dá)影響相關(guān)金屬蛋白酶和細(xì)胞因子的表達(dá)水平[28-29]。最后，長(zhǎng)鏈非編碼RNA可以影響OA發(fā)生和發(fā)展。表觀遺傳學(xué)極大地拓展了對(duì)OA發(fā)病機(jī)制的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)。在一些小規(guī)模的研究中已經(jīng)建立了一些miRNA標(biāo)記，但在更大規(guī)模的研究中還有待研究。

3 影響OA診治的可溶性生物標(biāo)志物

3.1 影響OA表型的可溶性生物標(biāo)志物 在過(guò)去的幾年里，在OA疾病表征方面的重要進(jìn)展是將患者分為幾種臨床表型。表型對(duì)應(yīng)一組具有某種疾病的共同可觀察特征的患者，如形態(tài)學(xué)、發(fā)育、生化或生理特性或行為。這些表型會(huì)涉及特定的分子通路。而且OA是一種復(fù)雜的疾病，其表型可能是多種失調(diào)通路的結(jié)果。OA的表型包括炎性反應(yīng)表型、代謝綜合征表型、滑膜液表型和骨表型[30-32]。炎性反應(yīng)表型的標(biāo)志物包括血清hs-CRP、CRPM、C3M和內(nèi)脂素，代謝綜合征表型的標(biāo)志物包含MMP-1、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10和MMP-12[33-34]，上述標(biāo)志物的升高促進(jìn)OA的發(fā)生?；ひ罕硇蜕叽龠M(jìn)OA發(fā)生發(fā)展[35]。骨表型包括α-CTX-Ⅰ表位和CTX-Ⅱ表位，這些表位表達(dá)增加對(duì)OA具有高骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)的患者診斷有效[36]。疼痛的表型包括ADAMTS-5酶、TNF-α水平、IL-6、IL-8、血清COL3/ADAMTS水平，它們的升高對(duì)OA診斷具有幫助[37]。雖然許多表型已經(jīng)提出，但目前用于這些表型的可溶性標(biāo)志物似乎更有限。如果臨床試驗(yàn)?zāi)軐A患者的表型與藥物靶向的分子途徑相對(duì)應(yīng)，那么潛在藥物的效果將更容易發(fā)現(xiàn)。

3.2 影響OA治療、預(yù)后、發(fā)展的可溶性生物標(biāo)志物 影響早期OA預(yù)后的生物標(biāo)志物包括血清COMP、透明質(zhì)酸(HA)和Ⅰ型膠原交聯(lián)N端肽(NTX-Ⅰ)、血漿葡萄糖烷、血清C2M、尿Coll2-1 NO2、血清C1M和尿CTX-Ⅱ，這些物質(zhì)在早期OA中增加。影響OA發(fā)展的生物標(biāo)志物包括血清PRO-C2、HA、IL-1、ARGS、PⅡANP、TLR4、COMP，尿CTX-Ⅱ、凝聚素肽、光蛋白聚糖、潤(rùn)滑素、彈性蛋白酶和滑液中TGF-β1水平，這些標(biāo)志物在預(yù)測(cè)膝關(guān)節(jié)或髖關(guān)節(jié)OA疾病進(jìn)展方面有效[38]。雖然一些臨床和放射學(xué)研究證明其具有OA治療的生物學(xué)價(jià)值，但是它們的敏感度和特異度差。因此，生物標(biāo)志物具有互補(bǔ)的作用。研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)組織轉(zhuǎn)換的生物標(biāo)志物可能對(duì)OA治療有幫助。研究表明，血清COMP水平升高的OA患者較血清COMP水平較低的患者治療效果好[39]。有些生物標(biāo)志物可以影響OA治療效果，如血清CTX-Ⅱ、YKC-40、COMP和尿CTX-Ⅱ、NTX-Ⅰ，它們的降低對(duì)OA的治療有很大幫助[40]。

4 小結(jié)與展望

上述研究表明，生化標(biāo)志物可能成為評(píng)估OA診斷、治療和預(yù)后的基石。雖然發(fā)現(xiàn)有很多生物標(biāo)志物影響OA，但臨床數(shù)據(jù)不全面阻礙其發(fā)展。提高生化標(biāo)志物效能的方法是充分挖掘它們的生物學(xué)基礎(chǔ)并進(jìn)行大規(guī)模的臨床研究。希望未來(lái)的研究解決上述缺陷，為OA患者提供更好的診斷、治療、預(yù)后措施。