個(gè)體化腫瘤疫苗的作用機(jī)理及臨床研究進(jìn)展*

馮煒紅 杜學(xué)明

天津市北辰醫(yī)院腫瘤科 300400

腫瘤新抗原通常由腫瘤細(xì)胞基因組突變產(chǎn)生，僅存在腫瘤細(xì)胞，所以又稱為腫瘤特異性抗原(Tumor specific antigen，TSA)。由于正常細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生和表達(dá)TSA，所以能被主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex, MHC)分子處理和提呈。T細(xì)胞識(shí)別出的突變位點(diǎn)被稱為“新表位”[1]。然而，絕大多數(shù)已發(fā)現(xiàn)的突變抗原是每個(gè)患者特有的，尋找個(gè)體化的治療靶點(diǎn)難以實(shí)現(xiàn)。二代測(cè)序(Next-generation sequencing, NGS)可以快速測(cè)序基因組，它與專用的生物信息學(xué)工具一起綜合描繪一種癌癥中的所有突變(統(tǒng)稱為“突變組”)并預(yù)測(cè)MHC分子結(jié)合的新表位。然而，個(gè)體癌癥患者的分析顯示自發(fā)免疫應(yīng)答僅針對(duì)其一小部分突變(<1%)[2]，使人們對(duì)突變的免疫原性產(chǎn)生懷疑。這導(dǎo)致了一個(gè)假設(shè)，即只有具有高突變負(fù)荷的腫瘤以及與之相應(yīng)高度多樣性的腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞，才能有效進(jìn)行新抗原免疫治療。

1 臨床前研究和個(gè)體化突變疫苗的臨床翻譯

為了明確哪一部分突變能夠誘導(dǎo)新表位特異性免疫反應(yīng)，Ugur Sahin等[3]給小鼠接種了長(zhǎng)肽或抗原編碼RNA，代表著同基因腫瘤中經(jīng)NGS鑒定的50種突變，其中相當(dāng)一部分突變是免疫原性并由腫瘤排斥反應(yīng)介導(dǎo)[4]，大多數(shù)新表位(占隨機(jī)選擇突變的20%～25%)可以被CD4+T輔助細(xì)胞識(shí)別，用這些新表位進(jìn)行疫苗接種可控制晚期小鼠腫瘤的生長(zhǎng)。從同基因小鼠到人類的臨床轉(zhuǎn)化更為復(fù)雜，包括突變的識(shí)別、潛在新表位的預(yù)測(cè)以及疫苗的設(shè)計(jì)和制造。一般通過(guò)取得患者活檢的腫瘤組織和正常組織(外周血白細(xì)胞)進(jìn)行二代測(cè)序，獲取腫瘤和正常DNA序列，可以確定腫瘤特異性的非同義單核苷酸變異或蛋白質(zhì)編碼基因中的突變插入或缺失，通過(guò)計(jì)算檢查突變肽區(qū)域是否與病人的人白細(xì)胞抗原(Human leukocyte antigen,HLA)等位基因(基于預(yù)測(cè)的親和力)結(jié)合，以及其他被認(rèn)為與潛在疫苗靶點(diǎn)排序相關(guān)的突變蛋白特征，這些有助于選擇多個(gè)突變以設(shè)計(jì)、制造獨(dú)特的新表位疫苗。在一項(xiàng)試驗(yàn)中，3例黑色素瘤患者接受了體外加載的7種合成9-聚體肽的樹突細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)，這些肽代表每例患者預(yù)測(cè)與常見的HLA-A2結(jié)合的個(gè)體突變，21個(gè)肽中的9個(gè)檢測(cè)到了疫苗誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì)相應(yīng)的免疫原具有特異性，然而該實(shí)驗(yàn)未評(píng)估對(duì)自體黑色素瘤細(xì)胞的識(shí)別，疫苗反應(yīng)的相關(guān)性仍不明確。兩個(gè)隨后報(bào)告的臨床試驗(yàn)加入了Ⅲ～Ⅳ期黑色素瘤患者，在一項(xiàng)試驗(yàn)中，6例患者皮下注射了長(zhǎng)肽，代表著多達(dá)20個(gè)突變，每例患者同時(shí)使用佐劑[5]。在第二個(gè)試驗(yàn)中，13例患者注射了RNA，編碼27聚體的10個(gè)[6]。兩項(xiàng)研究中T細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)都需要患者抗原的提呈和處理，均顯示總免疫原性率高達(dá)60%。而且在兩項(xiàng)研究中，大多數(shù)疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答都是新啟動(dòng)的，在疫苗接種前無(wú)法檢測(cè)到。根據(jù)臨床前發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)新表位誘導(dǎo)了功能性CD4+Thelper1(TH1)細(xì)胞，無(wú)論在RNA試驗(yàn)(結(jié)合MHCⅠ類和Ⅱ類預(yù)測(cè)新表位選擇)還是肽試驗(yàn)(僅依賴于MHCⅠ類結(jié)合預(yù)測(cè))中，新表位特異性CD8+T細(xì)胞對(duì)RNA或肽疫苗的反應(yīng)分別為25%和16%。在RNA試驗(yàn)中，多個(gè)CD8+反應(yīng)具有很高的強(qiáng)度。兩個(gè)試驗(yàn)都顯示了對(duì)所選疫苗誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的自體腫瘤細(xì)胞系的識(shí)別。在兩名接受RNA疫苗接種的患者中，有證據(jù)表明CTL浸潤(rùn)和腫瘤細(xì)胞被新表位特異性T細(xì)胞殺傷。

盡管隊(duì)列規(guī)模較小，但這些研究為單獨(dú)使用疫苗和隨后聯(lián)合使用檢查點(diǎn)抑制劑的臨床活性提供了依據(jù)。在RNA試驗(yàn)中，疫苗接種顯著減少了13例高危黑色素瘤患者的疾病復(fù)發(fā)累積次數(shù)。其中1例患者因進(jìn)展迅速而停止接種疫苗，并在隨后的檢查點(diǎn)阻斷治療后迅速完全緩解。在肽試驗(yàn)中，6例接種疫苗的患者中有4例在整個(gè)隨訪期內(nèi)沒(méi)有復(fù)發(fā)，而2例迅速進(jìn)展，并在隨后的抗PD-1治療后實(shí)現(xiàn)了腫瘤完全消退。

2 使用新抗原刺激腫瘤免疫

合理免疫治療的一個(gè)關(guān)鍵原則是恢復(fù)免疫系統(tǒng)的功能，即所謂的癌癥免疫周期[7-8]。腫瘤排斥反應(yīng)主要是由細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞引起的，疫苗的方法依賴于潛在的MHCⅠ類表位，然而越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明，新抗原特異性CD4+T細(xì)胞對(duì)癌癥免疫治療的有效性起著至關(guān)重要的作用[9]。由于腫瘤突變組為MHCⅡ類新表位提供了豐富的來(lái)源，突變組疫苗有動(dòng)員TH1 CD4+T細(xì)胞的潛能[4]。CD8+效應(yīng)蛋白的主要作用方式是殺傷遞呈同源抗原的細(xì)胞[10]，而CD4+效應(yīng)蛋白具有更廣泛的功能，包括協(xié)調(diào)各種細(xì)胞類型的獲得性和先天性免疫系統(tǒng)[11]。CD4+T細(xì)胞可以誘導(dǎo)有效CD8+T細(xì)胞，不同區(qū)域的TH1 CD4+T細(xì)胞通過(guò)同源CD40配體/CD40受體相互作用激活DCs，DCs可以提呈腫瘤細(xì)胞釋放的抗原。然后DCs成熟，產(chǎn)生白細(xì)胞介素12和化學(xué)誘導(dǎo)劑，并上調(diào)共刺激分子。這些情況與CTL針對(duì)腫瘤抗原持續(xù)的反應(yīng)有關(guān)，腫瘤抗原是由腫瘤細(xì)胞死亡釋放并交叉呈現(xiàn)的。多表位疫苗已被證明可同時(shí)驅(qū)動(dòng)新抗原特異性CD8+和CD4+T細(xì)胞，通過(guò)協(xié)同作用，它們可以啟動(dòng)癌癥免疫循環(huán)：在淋巴結(jié)疫苗反應(yīng)的啟動(dòng)階段，TH1細(xì)胞有效地輔助樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)有效的新表位特異性CTL，提高其向腫瘤的浸潤(rùn)能力，并能產(chǎn)生長(zhǎng)期存活的記憶CD8+T細(xì)胞[12]。在腫瘤中，疫苗誘導(dǎo)的TH1 CD4+T細(xì)胞可通過(guò)作用于各種免疫細(xì)胞類型來(lái)促進(jìn)炎癥微環(huán)境[4，13]。IFNγ是TH1細(xì)胞的關(guān)鍵細(xì)胞因子，可以上調(diào)腫瘤細(xì)胞MHCⅠ類分子，以改善CD8+效應(yīng)蛋白的殺傷作用。同時(shí)，通過(guò)誘導(dǎo)MHCⅡ類表達(dá)，以更易識(shí)別IFN-γ敏化腫瘤細(xì)胞，并被細(xì)胞毒性TH1 CD4+T效應(yīng)蛋白直接殺傷?？傊?，通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡和新抗原釋放供DCs攝取，結(jié)合免疫原性微環(huán)境，CD4+T細(xì)胞可以啟動(dòng)T細(xì)胞觸發(fā)、擴(kuò)增和抗原擴(kuò)散的連續(xù)循環(huán)，從而擴(kuò)大抗腫瘤T細(xì)胞的能力。

3 疫苗設(shè)計(jì)中的突變發(fā)現(xiàn)、新表位預(yù)測(cè)和靶抗原選擇

3.1 突變發(fā)現(xiàn) 個(gè)體化腫瘤疫苗面臨的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)是精確定位腫瘤突變組，以便選擇最適合的突變以獲得最佳的免疫應(yīng)答。NGS分析正在不斷改進(jìn)，臨床應(yīng)用需要標(biāo)準(zhǔn)的操作程序，以確保數(shù)據(jù)的可重復(fù)性、質(zhì)量控制和隱私。通常，這些分析依賴于從單個(gè)腫瘤病灶中采集的用于常規(guī)診斷的小活檢組織，因此序列數(shù)據(jù)可能不能代表腫瘤的完整克隆譜。另一個(gè)需要解決的問(wèn)題是錯(cuò)誤的突變測(cè)定，確定單個(gè)NGS數(shù)據(jù)集中真實(shí)突變的標(biāo)準(zhǔn)化算法，對(duì)于單核苷酸變異非常有效,這是最豐富的腫瘤突變類型，如果它們出現(xiàn)在一個(gè)表達(dá)的蛋白質(zhì)中并且是非同義的，它們可以產(chǎn)生T細(xì)胞識(shí)別的新表位，其他可能相關(guān)的突變類型是基因融合或小的插入和缺失，它們可以導(dǎo)致高度免疫原性的移碼[14]。除了這些明確定義的突變類別外，與癌癥相關(guān)的表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后畸變特征較少，可能會(huì)產(chǎn)生新的表位，并大大擴(kuò)展疫苗靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)空間[15]。作為新抗原的癌癥特異性和可用性很難用現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行評(píng)估，目前正在研究中。

3.2 新表位預(yù)測(cè) 抗原的處理和呈遞是一個(gè)復(fù)雜的、多步驟的過(guò)程。技術(shù)上的可行性和成本限制了可以被整合到藥物產(chǎn)品中突變的數(shù)量。到目前為止，對(duì)于如何優(yōu)選突變還沒(méi)有達(dá)成共識(shí)，最低要求是突變基因在腫瘤中的表達(dá)及其可產(chǎn)生序列改變的表位，并能被提呈給MHCs。MHC肽復(fù)合物的穩(wěn)定性被認(rèn)為是比MHC結(jié)合親和力更好的免疫原性預(yù)測(cè)因子。然而，目前可用的MHC肽穩(wěn)定性預(yù)測(cè)算法僅覆蓋少數(shù)MHC等位基因，且依賴于小數(shù)據(jù)集，只有一小部分突變肽被預(yù)測(cè)為人類MHCⅠ類等位基因的高親和力結(jié)合物，是MHCⅠ類配體。MHCⅠ類的表達(dá)受突變基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。一般來(lái)說(shuō)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，基因表達(dá)水平、翻譯蛋白的數(shù)量、MHC配體的細(xì)胞表面密度、免疫識(shí)別和細(xì)胞裂解都是正相關(guān)的[16]，因此高表達(dá)可以在一定程度上補(bǔ)償弱MHCⅠ結(jié)合，反之亦然。這表明新抗原優(yōu)化可以通過(guò)兼顧預(yù)測(cè)的MHC Ⅰ結(jié)合力和突變的表達(dá)水平來(lái)實(shí)現(xiàn)[17]。表達(dá)水平可以通過(guò)NGS數(shù)據(jù)中包含變化的mRNA測(cè)序讀數(shù)來(lái)挖掘，然而并不是每一個(gè)突變的MHCⅠ類配體均具有免疫原性，但目前的I類預(yù)測(cè)算法可以用于處理強(qiáng)免疫原性新表位[1，6]。

3.3 靶抗原選擇 準(zhǔn)確預(yù)測(cè)與MHCⅡ類結(jié)合的配體具有挑戰(zhàn)性。MHC-Ⅱ結(jié)合變性蛋白質(zhì)或被修剪的大肽，而MHC-Ⅰ則依靠預(yù)先生成的大小肽。由于MHC-Ⅱ分子的結(jié)合槽在兩端都是開放的，因此肽的長(zhǎng)度和結(jié)合域的定義較少，因而不易預(yù)測(cè)。根據(jù)親和力預(yù)測(cè)臨界值，HLAⅡ類結(jié)合評(píng)分<1、1～10或>10分別對(duì)應(yīng)70%、45%或34%的突變誘發(fā)新表位特異性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答[6]。

4 個(gè)性化疫苗的臨床應(yīng)用

個(gè)性化疫苗的臨床應(yīng)用面臨的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)是個(gè)性化疫苗的快速生產(chǎn)和及時(shí)投放。疫苗生產(chǎn)的周轉(zhuǎn)時(shí)間取決于疫苗的設(shè)計(jì)。個(gè)體化疫苗有長(zhǎng)肽、RNA、DNA質(zhì)粒、病毒載體、工程菌和抗原負(fù)載DCs。最近報(bào)道的完全個(gè)人化的臨床試驗(yàn)使用了與突變序列相對(duì)應(yīng)的多肽混合物(長(zhǎng)度為15～30個(gè)氨基酸)，或具有內(nèi)在佐劑活性并編碼多個(gè)預(yù)測(cè)新表位鏈的mRNA，從開始處理患者的突變到疫苗給藥，為3～4個(gè)月。在生產(chǎn)出個(gè)體化疫苗之前，患者一直接受其他標(biāo)準(zhǔn)或?qū)嶒?yàn)藥物治療，對(duì)于肽和mRNA疫苗平臺(tái)，預(yù)期將減少到4周以下。

另一個(gè)挑戰(zhàn)是確定最適合的疫苗接種臨床環(huán)境。治療性疫苗最有可能在佐劑或殘留最小病灶中發(fā)揮特別好的作用，在這種情況下，腫瘤負(fù)荷低，免疫抑制機(jī)制尚未完全建立，控制較大的腫瘤負(fù)荷可能需要聯(lián)合免疫療法[18]。新表位疫苗可將“冷”腫瘤轉(zhuǎn)化為“熱”腫瘤，并在腫瘤微環(huán)境中介導(dǎo)PDL1的上調(diào)。因此，它可以將抗PD-1/PD-L1療法的應(yīng)用擴(kuò)展。此外，新表位疫苗誘導(dǎo)的TH1+和CD8+T細(xì)胞可能通過(guò)促進(jìn)強(qiáng)大的記憶反應(yīng)來(lái)增強(qiáng)抗PD-1/PD-L1療效的持久性。臨床試驗(yàn)NCT0289765和NCT0328962旨在評(píng)估PD-1/PD-L1阻斷聯(lián)合新表位疫苗接種的效果，類似的CTLA4、LAG-3、TIM-3、IDO或TGF-β等抑制因子和共刺激分子(如OX40、GITR、CD137)的作用，以及T細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性細(xì)胞因子的添加，在臨床前被證明對(duì)癌癥疫苗增效。

5 個(gè)體化腫瘤疫苗的發(fā)展前景

腫瘤中的體細(xì)胞突變數(shù)量從幾到幾千不等，而且它們?cè)诤艽蟪潭壬蠈?duì)每位患者都是獨(dú)一無(wú)二的。腫瘤與宿主和環(huán)境因素(如HLA單倍型和其他遺傳多態(tài)性、微生物群、年齡、其他疾病、免疫細(xì)胞庫(kù)、腫瘤微環(huán)境的組成)之間存在微妙的相互作用，定義了免疫狀態(tài)(“癌癥免疫設(shè)定點(diǎn)”)，塑造了每個(gè)癌癥個(gè)體[7]。個(gè)體化突變疫苗有望解決腫瘤異質(zhì)性問(wèn)題，這是傳統(tǒng)抗癌治療失敗的原因?；颊叩囊呙绯煞挚梢葬槍?duì)不同的克隆，因?yàn)樗軌蜥槍?duì)一個(gè)腫瘤內(nèi)的多個(gè)表位，并且可以根據(jù)腫瘤的變化進(jìn)行調(diào)整。

個(gè)性化的癌癥疫苗的挑戰(zhàn)包括確定最合適的臨床背景、縮短生產(chǎn)周轉(zhuǎn)時(shí)間、擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模和確?？韶?fù)擔(dān)性[19]。數(shù)字時(shí)代的新趨勢(shì)和新技術(shù)將改進(jìn)預(yù)測(cè)新表位的計(jì)算。通過(guò)TCR譜分析、高通量單細(xì)胞測(cè)序和循環(huán)腫瘤DNA檢測(cè)，可以對(duì)腫瘤、微環(huán)境和免疫進(jìn)行更高分辨率的分析。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析出腫瘤細(xì)胞的表型和功能狀態(tài)可以支持聯(lián)合治療的選擇。突變是致癌過(guò)程和治療失敗的關(guān)鍵啟動(dòng)點(diǎn)，是所有癌癥的共同點(diǎn)，因此一種個(gè)性化的突變疫苗有可能成為一種治療癌癥普遍適用的方法。