代謝組學(xué)在干眼研究中的應(yīng)用進(jìn)展△

金 拓 高衛(wèi)萍

干眼是由于淚液的質(zhì)或量以及動(dòng)力學(xué)異常導(dǎo)致的淚膜不穩(wěn)定或眼表微環(huán)境失衡所致的慢性眼病，可伴有眼表炎癥反應(yīng)、組織損傷及神經(jīng)異常等病理改變，造成患者眼部多種不適癥狀和(或)視功能障礙[1]。近年來，干眼在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率不斷上升。調(diào)查顯示，全球范圍內(nèi)干眼發(fā)病率為5.5%～33.7%[2]。干眼患者多表現(xiàn)為眼內(nèi)異物感、眼部不適、干燥感、畏光、灼燒、疼痛和視物模糊等[3]。目前關(guān)于干眼的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，這就需要新的研究方法更好地了解這種疾病的發(fā)病機(jī)制，從而促進(jìn)其預(yù)防和治療。代謝組學(xué)是現(xiàn)代組學(xué)在生物系統(tǒng)綜合分析中新興的一門學(xué)科，是一種對代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定和定量的組學(xué)技術(shù)，因其靈敏度和準(zhǔn)確性高已被越來越多地應(yīng)用于眼科研究中。借助代謝組學(xué)識別新的生物標(biāo)志物和紊亂的代謝通路有助于更好地理解干眼的病理生理學(xué)，并可能指出新的治療靶點(diǎn)。本文綜述了代謝組學(xué)在干眼研究中的應(yīng)用進(jìn)展，并提出了未來研究的方向。

1 代謝組學(xué)概述

1.1 代謝組學(xué)的研究意義代謝產(chǎn)物作為生物反應(yīng)和活動(dòng)的中間體，在連接各種細(xì)胞通路和不同系統(tǒng)之間的通信中起著重要作用。代謝產(chǎn)物的水平取決于相應(yīng)酶的含量、活性和性質(zhì)，它們參與多種生化反應(yīng)，涉及不同的調(diào)控過程，發(fā)揮不同的功能[4]。基因決定可能發(fā)生的事情，代謝產(chǎn)物則代表正在發(fā)生的事情[5]。因此，代謝產(chǎn)物的水平代表了細(xì)胞或組織對遺傳或環(huán)境變化所產(chǎn)生反應(yīng)的表型的綜合信息，是生物體內(nèi)部活動(dòng)(基因表達(dá)、蛋白質(zhì)活性、細(xì)胞代謝)和外部因素(如飲食、健康狀況、生活方式、腸道微生物、藥物等)相互作用的結(jié)果[6]。由于代謝組學(xué)檢測的是基因表達(dá)的最終產(chǎn)物，所鑒定的代謝產(chǎn)物和代謝途徑比許多其他組學(xué)技術(shù)更接近表型，所以它被認(rèn)為是一種更敏感的測量生物表型的方法[7]。因此，代謝組學(xué)研究現(xiàn)已越來越多地被應(yīng)用于診斷疾病以及發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物。代謝組學(xué)可以在生物體整個(gè)器官、組織和體液中開展研究，無論是在體外還是在體內(nèi)均可進(jìn)行，代謝組學(xué)研究常見的生物樣本包括肝臟、腫瘤、腦、脂肪、尿液、血清、血漿、唾液、眼淚、胰液、腸液等[8]。

1.2 代謝組學(xué)的分類及主要分析技術(shù)一個(gè)典型的代謝組學(xué)研究工作流程包括：研究設(shè)計(jì)、樣本收集和制備、儀器分析、數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。代謝組學(xué)可分為靶向性代謝組學(xué)和非靶向性代謝組學(xué)，靶向性代謝組學(xué)分析的主要是特定的代謝產(chǎn)物，非靶向性代謝組學(xué)范圍寬泛，目標(biāo)是從生物樣本中同時(shí)分析盡可能多的代謝產(chǎn)物[9]，兩者目的有所區(qū)別，設(shè)計(jì)研究時(shí)應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇相應(yīng)的方式。

目前代謝組學(xué)采用的主要分析技術(shù)有核磁共振波譜和質(zhì)譜[10]兩種。核磁共振波譜法主要檢測可溶性代謝產(chǎn)物，不破壞樣品，可以對體內(nèi)樣品進(jìn)行無創(chuàng)、長時(shí)間的重復(fù)分析。與質(zhì)譜相比波譜的敏感性和代謝產(chǎn)物分辨率較低。質(zhì)譜更靈敏，可以覆蓋更廣泛的代謝產(chǎn)物，但會破壞分析樣品。質(zhì)譜技術(shù)為了進(jìn)一步提高靈敏度，通常聯(lián)用不同的分離技術(shù)，常用的如氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)[11]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)[12]和毛細(xì)管電泳質(zhì)譜聯(lián)用(CE-MS)[13]。GC-MS是代謝組學(xué)中廣泛使用的分析技術(shù)[14]，GC-MS靈敏度高、峰分辨率高、重現(xiàn)性好[15]。但是，GC-MS只能用于分離和鑒定相對分子質(zhì)量較低以及揮發(fā)性的代謝產(chǎn)物，為了檢測具有極性、熱穩(wěn)定性差、非揮發(fā)性的代謝產(chǎn)物，在分析之前需要對樣品進(jìn)行化學(xué)衍生化[16]。與GC-MS相比，LC-MS不需要對樣品進(jìn)行衍生化預(yù)處理，可分析熱穩(wěn)定性差、非揮發(fā)性、不易衍生化及相對分子質(zhì)量較大的代謝產(chǎn)物[17-18]。正因?yàn)榫哂羞@些優(yōu)點(diǎn)，LC-MS是目前代謝組學(xué)中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)[19]。其缺點(diǎn)是分離效率低，耗時(shí)較長。CE-MS是代謝組學(xué)中較為成熟的分析技術(shù)，特別適合對極性和帶電代謝產(chǎn)物的分析[13]，分離效率比LC-MS和GC-MS更高，但是由于其重復(fù)性低，在代謝組學(xué)研究中往往不受青睞[20]，使用較少。不同的聯(lián)用技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，因此，為了測量不同類別的代謝產(chǎn)物，增加代謝組覆蓋率，需要同時(shí)使用不同的分離方法[21]。

2 代謝組學(xué)在干眼研究中的應(yīng)用

干眼的病因復(fù)雜，通常是由多種因素引起的，包括瞼板腺功能障礙、老化、淚腺功能障礙、性激素水平變化以及不良的外部環(huán)境等。大多數(shù)患者經(jīng)過治療，癥狀和體征可能會得到改善，但并不能完全治愈[22]。2017年，國際淚膜和眼表學(xué)會干眼病工作組第二次會議發(fā)布了一份報(bào)告，將干眼分為兩大類:水液缺乏型干眼和蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼，前者本身又可根據(jù)有無干燥綜合征(SS)分為兩個(gè)子類:即SS型干眼和非SS型干眼[23]。SS是一種慢性自身免疫性疾病，可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種，其特征是唾液腺和淚腺內(nèi)單核細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致組織破壞引發(fā)嚴(yán)重干眼[24]。

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后迅速發(fā)展起來的生化研究領(lǐng)域，其主要研究內(nèi)容包括鑒定和量化生物樣本在特定條件或疾病下的所有代謝產(chǎn)物或特定代謝產(chǎn)物，并識別相關(guān)的代謝途徑和基因[25]。代謝物作為體內(nèi)代謝過程中的產(chǎn)物或底物，受到基因、環(huán)境和日常飲食習(xí)慣的共同影響，參與機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)維護(hù)，可作為生物標(biāo)志物，指示正常的生物過程、致病過程或?qū)χ委煾深A(yù)的藥理反應(yīng)[26]。目前，代謝組學(xué)在干眼方面的研究主要集中于對血液、淚液、唾液、細(xì)胞及尿液等樣本的分析。

2.1 血液標(biāo)志物與干眼Vehof等[27]采用基于氣相和液相色譜結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)對2819名受試者血清樣本進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，測試了222種已知血清代謝產(chǎn)物與干眼之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，雄激素水平降低與干眼，特別是癥狀之間存在高度的相關(guān)性，雄激素可以作為干眼的生物標(biāo)志物。Fernández-Ochoa等[28]采用基于高效液相-電噴霧-四級桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜的代謝組學(xué)方法對從SS患者和健康志愿者采集的血漿樣本進(jìn)行分析。他們發(fā)現(xiàn)，在健康志愿者和SS患者的血漿中有31個(gè)代謝產(chǎn)物存在顯著性差異，其中12個(gè)血漿代謝產(chǎn)物可以被注釋。這些發(fā)現(xiàn)有助于對SS發(fā)病機(jī)制的探索。Osae等[29]通過代謝組學(xué)技術(shù)分析了高脂肪飲食組小鼠和正常飲食組小鼠血漿中的膽固醇酯、甘油三酯、神經(jīng)酰胺和神經(jīng)鞘磷脂代謝變化。結(jié)果顯示，與正常飲食組小鼠相比，高脂肪飲食組小鼠血漿中膽固醇酯、甘油三酯、神經(jīng)酰胺和神經(jīng)鞘磷脂水平更高，并且高脂肪飲食組小鼠瞼板腺出現(xiàn)肥大，說明高脂肪飲食不僅會導(dǎo)致血脂異常，還會改變瞼板腺結(jié)構(gòu)和功能。這些發(fā)現(xiàn)提示飲食控制是瞼板腺功能障礙所致干眼治療策略中值得考慮的一個(gè)重要因素。

2.2 淚液標(biāo)志物與干眼Chen等[30]利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間二級質(zhì)譜技術(shù)對18例干眼患者和19名正常人的淚液樣本進(jìn)行了代謝產(chǎn)物譜分析，共鑒定出156種代謝產(chǎn)物，其中有34種代謝產(chǎn)物在干眼患者淚液與正常人淚液顯示出明顯差異。這其中有很多代謝產(chǎn)物被報(bào)道具有抗炎活性和保護(hù)作用，包括3-羥基-2-氨基苯甲酸、焦谷氨酸、尿刊酸、尿苷、肉堿、肌苷、精氨酸和黃嘌呤。這些代謝產(chǎn)物有可能成為干眼潛在的診斷性生物標(biāo)志物，有助于提高對干眼診斷的準(zhǔn)確性。Jiang等[31]采集干眼患者及正常人淚液樣本，使用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間二級質(zhì)譜技術(shù)對代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)20個(gè)候選標(biāo)志物中有4個(gè)與眼表疾病指數(shù)評分顯著相關(guān)，57個(gè)候選標(biāo)志物中有42個(gè)與淚膜破裂時(shí)間顯著相關(guān)，26個(gè)與熒光素染色評分顯著相關(guān)。從這三組的重疊部分來看，51種代謝產(chǎn)物中有48種促進(jìn)干眼的發(fā)生，不同年齡組代謝產(chǎn)物有明顯的變化。代謝途徑分析表明，其主要途徑為葡萄糖代謝、氨基酸代謝和谷胱甘肽代謝。這項(xiàng)研究顯示了干眼患者和非干眼患者以及不同年齡組之間存在不同的代謝組學(xué)特征，部分闡明了代謝產(chǎn)物變化、干眼癥狀和年齡之間的關(guān)系。Pieragostino等[32]使用LC-MS技術(shù)分析了14例女性干眼患者和13名健康女性的淚液樣本，結(jié)果顯示，與健康人群相比，干眼患者的淚液樣本中皮質(zhì)醇、雄烯二酮和17α-羥基孕酮含量顯著降低。性激素失衡是導(dǎo)致干眼的一項(xiàng)重要原因，性激素水平變化通常會改變淚液代謝，通過鑒別淚液中類固醇水平可對干眼的診斷提供幫助。

2.3 唾液標(biāo)志物與干眼Kageyama等[33]用GC-MS技術(shù)分析了原發(fā)性SS患者及健康人的唾液樣本。他們共檢測到88種代謝產(chǎn)物，其中41種在原發(fā)性SS患者樣本中含量降低。此研究結(jié)果表明，代謝組學(xué)能發(fā)現(xiàn)唾液中的生物標(biāo)志物，這些標(biāo)志物可以作為原發(fā)性SS的診斷工具或作為探索該疾病潛在發(fā)病機(jī)制的研究工具。Herrala等[34]對原發(fā)性SS患者及健康人唾液樣本進(jìn)行了質(zhì)子核磁共振波譜分析，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性SS患者唾液樣本中膽堿在各時(shí)間點(diǎn)、?；撬嵩谧詈笕齻€(gè)時(shí)間點(diǎn)、丙氨酸在最后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)以及甘氨酸在最后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)濃度均顯著升高。代謝產(chǎn)物輸出分析結(jié)果顯示，膽堿在患者體內(nèi)變異最低。盡管個(gè)體內(nèi)和個(gè)體間存在相當(dāng)大的差異，但原發(fā)性SS患者的特定代謝產(chǎn)物水平與健康人不同，這可能會成為監(jiān)測治療反應(yīng)的新的標(biāo)志物。原發(fā)性SS的早期診斷和治療可以有效防止腺體和器官的不可逆性損傷，特異度和靈敏度更高的診斷方法無疑會使原發(fā)性SS患者更加受益[35]。

2.4 細(xì)胞標(biāo)志物與干眼Chen等[36]采用了正常人結(jié)膜細(xì)胞系IOBA-NHC細(xì)胞作為模型，研究高滲透壓引起的代謝產(chǎn)物變化。通過整體代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，高滲透壓下IOBA-NHC細(xì)胞中甘油磷酰膽堿水平呈劑量依賴性增加。這一趨勢通過靶向代謝組學(xué)分析得到了證實(shí)，表明甘油磷酰膽堿是優(yōu)于其他內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的首選滲透保護(hù)劑。并且還首次發(fā)現(xiàn)甘油磷酰膽堿合成和氧-乙酰氨基葡萄糖糖基化是高滲透壓下眼表層細(xì)胞的關(guān)鍵激活途徑。這些發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展了目前人們對干眼代謝物標(biāo)志物方面的認(rèn)知，并為其提供了潛在的治療靶點(diǎn)。Wang等[37]對應(yīng)激人角膜上皮細(xì)胞進(jìn)行了代謝組學(xué)研究，跟蹤了135種代謝產(chǎn)物。使用催淚蛋白處理樣品10 min后有29種代謝產(chǎn)物含量發(fā)生改變，細(xì)胞中氧化磷酸化增強(qiáng)(谷氨酸和谷氨酰胺下降)、蛋白質(zhì)聚集減少(炔諾酮減少)。其機(jī)制與快速促進(jìn)自噬通量、迅速恢復(fù)細(xì)胞代謝和線粒體融合有關(guān)，表明外源性催淚蛋白能恢復(fù)干眼患者淚液的穩(wěn)態(tài)，這為干眼的治療提供了新的方案。

2.5 尿液標(biāo)志物與干眼Lee等[38]使用核磁共振氫譜分析測定干眼模型組及正常對照組大鼠尿液中的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物。使用主成分分析和正交偏最小二乘判別分析對全局剖析中的核磁共振波譜進(jìn)行模式識別，發(fā)現(xiàn)干眼模型組和正常對照組代謝產(chǎn)物之間存在不同的簇。并發(fā)現(xiàn)尿液樣本中苯丙氨酸、苯乙酸、泛酸、甘氨酸、琥珀酸、甲醇、纈氨酸、丙二醇、組氨酸、蘇氨酸、乳酸、乙酸在干眼模型組和正常對照組大鼠之間有顯著差異。這些結(jié)果可能有助于人們理解干眼所涉及的代謝調(diào)節(jié)，并有助于尋找與干眼相關(guān)的潛在標(biāo)志物，提高干眼臨床診斷的準(zhǔn)確性。

3 總結(jié)

代謝組學(xué)作為研究機(jī)體代謝產(chǎn)物變化的一種新方法，能幫助人們更好、更深入地了解生物系統(tǒng)對環(huán)境和基因變化的響應(yīng)，在揭示復(fù)雜性疾病的機(jī)制方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。近年來，代謝組學(xué)的研究呈現(xiàn)突飛猛進(jìn)的發(fā)展勢頭。雖然眼睛在理論上是代謝組學(xué)研究的合適對象，但是由于眼部組織及液體不容易獲得，所以代謝組學(xué)在眼科學(xué)研究中仍處于探索階段，其中對于干眼的研究更是十分有限。目前應(yīng)用于干眼研究的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)大部分來自少量的臨床樣本，相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也開展的較少。代謝組學(xué)對于干眼診斷、機(jī)制研究以及潛在藥物開發(fā)方面的巨大潛力并未被完全發(fā)掘，未來需要在大樣本、多中心、盲性和隨機(jī)化的條件下開展更進(jìn)一步的研究。