血清微小核糖核酸-4286與幽門螺旋桿菌感染的子癇前期患者妊娠結(jié)局的關(guān)系

于 艷，白青山，才蔚濤，高 慧

子癇前期（preeclampsia，PE）是妊娠期高血壓加重的表現(xiàn)之一，可導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)窘迫、死亡、溶血、肝酶升高及血小板減少 （hemolysis,elevated liver enzymes and low platelets，HELLP）綜合征及心力衰竭等，嚴重威脅著母嬰的生命安全[1]。有研究[2，3]表明，幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori，Hp）可誘發(fā)炎癥及脂代謝紊亂，破壞血管內(nèi)皮功能，并通過該方式參與PE發(fā)病。臨床中應(yīng)密切關(guān)注PE患者，避免不良妊娠事件發(fā)生，尤其是Hp感染的PE患者。探究預(yù)示Hp感染的PE患者妊娠結(jié)局的生物標志物，及時給予干預(yù)，可避免不良妊娠事件發(fā)生。

既往有多數(shù)微小核糖核酸（microRNAs，miRNAs）參與了PE發(fā)病和進展過程，如miR-30-5p[4]和miR-195[5]等。miR-4286作為miRNAs家族中一員，被報道可靶向轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）/Smad家族成員3（Smad3）抑制細胞凋亡和炎癥反應(yīng)，改善血管內(nèi)皮細胞損傷[6]。TGF-β1/Smad3通路參與了PE發(fā)病和進展過程[7]，此外血管內(nèi)皮細胞損傷亦與PE密切相關(guān)?；诖耍欣碛赏茰ymiR-4286與PE有關(guān)，或可用于預(yù)判PE妊娠結(jié)局。目前，鮮有研究分析miR-4286與PE及其妊娠結(jié)局的關(guān)系。筆者研究選取Hp感染的PE患者作為研究對象，分析miR-4286與PE及其妊娠結(jié)局的關(guān)系，以期為PE妊娠結(jié)局的預(yù)判提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 臨床材料

選擇2019年1月至2020年5月唐山市婦幼保健院的204例Hp感染的PE患者（Hp+PE組），年齡24～40歲，平均年齡31.87歲（標準差3.68歲）；孕前體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）21.01～31.55 kg/m2，平均孕前BMI 25.69 kg/m2（標準差2.42 kg/m2）；輔助生殖27例（13.24%）。選擇同期的89例Hp感染的孕婦（Hp組），年齡24～40歲，平均年齡31.67歲（標準差3.89歲）；孕前BMI 21.30～31.55 kg/m2，平均孕前BMI 25.47 kg/m2（標準差2.49 kg/m2）；輔助生殖14例（15.73%）。該研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》，經(jīng)唐山市婦幼保健院醫(yī)學倫理委員會批準（倫理編號：2019-015-001）。

選擇標準：①Hp感染依據(jù)13C-尿素呼氣試驗檢查結(jié)果；②PE診斷依據(jù)《婦產(chǎn)科學（第9版）》[8]中相關(guān)標準；③首次妊娠，且為單胎；④于妊娠28周前發(fā)??；⑤接受降壓治療；⑥簽署了知情同意書。

排除標準：①既往有冠心病史、精神疾病史、血液系統(tǒng)疾病史及惡性腫瘤史等；②肝腎功能嚴重異常；③有高血壓家族史或子癇家族史；④隨訪資料不完整。

Hp組與Hp+PE組年齡、孕前BMI和輔助生殖占比比較，差異均無統(tǒng)計學意義（t/χ2=0.417、0.680、0.321，P=0.677、0.497、0.571）。

1.1.2 主要試劑與儀器

Takara 9108 RNAiso Plus 9108 trizol RNA提取試劑和6011A PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit（TAKARA公司，日本）；miR-4286和內(nèi)參U6引物（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，中國）。

TDL5M型低溫離心機（杭州川一實驗儀器有限公司，中國）；752型紫外分光光度計（上海光學儀器五廠有限公司，中國）；9700型聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（ABI公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-4286水平檢測

用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTqPCR）法檢測血清miR-4286水平。抽取患者PE確診時（T1）、妊娠28周第1天（T2）和妊娠30周第1天（T3）的肘部靜脈血10 mL，于4℃3 000×g條件下離心5 min，提取上層血清；用trizol RNA提取試劑提取總RNA（OD260/280在1.9～2.0），用cDNA Synthesis Kit將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用PCR儀擴增cDNA，反應(yīng)條件95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃擴增30 s，40個循環(huán)[9]。miR-4286上游序列：5＇-ACCCCACUCCUGGUACC-3＇，下游序列：5＇-TACCAGGAGTGGGGTTT-3＇；U6上游序列：5＇-CTCGCTTCGGCAGCACA-3＇，下游序列：5＇-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3＇。用2-ΔΔct法計算miR-4286的相對水平。

1.2.2 隨訪及分組

隨訪Hp+PE組患者至孕婦生產(chǎn)，記錄其妊娠結(jié)局。參照文獻[10]，將隨訪過程中Ⅲ度（羊水呈棕黃色，稠厚）及以上羊水污染、胎兒宮內(nèi)窘迫、胎兒死亡、進展為子癇、并發(fā)HELLP綜合征、肺水腫或心力衰竭定義為不良妊娠結(jié)局。

根據(jù)隨訪過程中是否發(fā)生不良妊娠結(jié)局將Hp+PE組患者分為結(jié)局不良組和結(jié)局良好組。

1.2.3 觀察指標

（1）比較Hp組與Hp+PE組T2、T3時點miR-4286水平。

（2）比較結(jié)局不良組與結(jié)局良好組臨床資料（年齡、孕前BMI、輔助生殖、PE發(fā)病孕周、血壓、24 h尿蛋白、剖宮產(chǎn)、分娩孕周），用重復(fù)測量方差比較兩組T1、T2和T3時點的miR-4286水平。

（3）用受試者工作特性（receiver operating characteristics，ROC）曲線評價不同時間點的miR-4286對妊娠結(jié)局不良的診斷價值。

（4）用Logistic回歸分析miR-4286與Hp+PE妊娠結(jié)局的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計學方法

用R軟件（4.1.0版，https://cran.r-project.org）進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較用獨立樣本t檢驗；組內(nèi)兩兩比較用配對樣本t檢驗。非正態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)和四分位數(shù)間距[M（QR）]表示，兩組間比較用Mann-Whitney U檢驗。計數(shù)資料用例（%）表示，組間比較用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Hp組與Hp+PE組miR-4286水平比較

Hp組T2和T3時點miR-4286水平均高于Hp+PE組，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.987，P=0.003；t=8.891，P=0.000）；Hp組和Hp+PE組T3時點miR-4286水平均高于T2時 點（t=6.558，P=0.000；t=3.516，P=0.001），Hp組miR-4286水 平 升 高 程 度[0.38（0.56）]高于Hp+PE組[0.06（0.57）]，差異有統(tǒng)計學意義（Z=4.156，P=0.000）。見表1。

表1 Hp組與Hp+PE組miR-4286水平比較Tab.1 Comparison of miR-4286 levels between Hp group and Hp+PE group

2.2 Hp+PE患者妊娠結(jié)局及分組情況

隨訪204例Hp+PE組患者，其中27例失聯(lián)，隨訪率為86.76%。Hp+PE組中有121例（59.31%）妊娠結(jié)局不良，其中Ⅲ度及以上羊水污染58例，胎兒宮內(nèi)窘迫34例，胎兒死亡4例，進展為子癇9例，并發(fā)HELLP綜合征6例，肺水腫4例，心力衰竭6例。

根據(jù)隨訪過程中是否發(fā)生不良妊娠結(jié)局將Hp+PE組患者分為結(jié)局不良組（n=121）和結(jié)局良好組（n=83）。

2.3 結(jié)局不良組與結(jié)局良好組的臨床資料比較

結(jié)局不良組與結(jié)局良好組年齡、孕前BMI、輔助生殖占比和PE發(fā)病孕周差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)局不良組確診時收縮壓（systolic blood pressure，SBP）、舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）、24 h尿蛋白和剖宮產(chǎn)占比均高于結(jié)局良好組，分娩孕周低于結(jié)局良好組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 結(jié)局良好組與結(jié)局不良組臨床資料比較Tab.2 Comparison of clinical data between 2 groups

2.4 結(jié)局不良組與結(jié)局良好組miR-4286水平比較

兩組miR-4286水平比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義（F=99.072，P=0.000），即結(jié)局不良組T1、T2和T3時點miR-4286水均低于結(jié)局良好組（t=10.045、4.745、4.074，P=0.000、0.000、0.000）；兩組miR-4286水平存在時間差異（F=141.800，P=0.000），即兩組miR-4286水平隨時間進展均呈升高趨勢；miR-4286水平存在時間和組間的交互效應(yīng)（F=3.590，P=0.031），即結(jié)局不良組miR-4286水平升高程度[0.45（0.52）]高于結(jié)局良好組[0.32（0.45）]（Z=2.198，P=0.028）。見表3。

表3 結(jié)局良好組與結(jié)局不良組miR-4286水平比較Tab.3 Comparison of miR-4286 levels between 2 good outcome group and poor outcome group

2.5 不同時間點miR-4286對妊娠結(jié)局不良診斷價值分析

T1時點的miR-4286判斷妊娠結(jié)局不良的ROC曲線下面積（area under curve，AUC）高于T2和T3時點miR-4286，差異均有顯著統(tǒng)計學意義（Z=3.677、4.177，P=0.000、0.000）。T2時點miR-4286判斷妊娠結(jié)局不良的ROC AUC略高于T3時點miR-4286，但差異無統(tǒng)計學意義（Z=0.260，P=0.795）。見表4和圖1。

表4 miR-4286判斷妊娠結(jié)局不良的價值Tab.4 Value of miR-4286 in diagnosis of poor pregnancy outcomes

圖1 miR-4286判斷妊娠結(jié)局不良的ROC曲線Fig.1 ROC curve of miR-4286 in diagnosis of poor pregnancy outcome

2.6 miR-4286與Hp+PE妊娠結(jié)局的關(guān)系

分別以204例患者的SBP、DBP、24 h尿蛋白、分娩孕周和T1時點miR-4286水平中位數(shù)為界值將其轉(zhuǎn)換為二分類變量，變量賦值見表5。將妊娠結(jié)局作為因變量，將SBP、DBP、24 h尿蛋白、分娩孕周、剖宮產(chǎn)和T1時點miR-4286水平作為自變量，納入多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示SBP＞154 mmHg、24 h尿蛋白＞2.37 g和剖宮產(chǎn)是Hp+PE患者妊娠結(jié)局不良的獨立危險因素（P＜0.05），分娩孕周＞37周和T1時點miR-4286水平＞1.47是Hp+PE患者妊娠結(jié)局不良的獨立保護因素（P＜0.05）。見表6。

表5 變量賦值Tab.5 Variable assignment

表6 Hp+PE患者妊娠結(jié)局的Logistic回歸分析結(jié)果Tab.6 Logistic regression analysis results of pregnancy outcomes of Hp+PE patient

3 討論

目前，臨床尚無有效手段治療PE，為避免不良妊娠相關(guān)疾病發(fā)生，唯一的方法就是終止妊娠。終止妊娠的時間選取至關(guān)重要，過早或過度延長妊娠時間均會導(dǎo)致妊娠結(jié)局不良；此外，過度延長妊娠時間還會導(dǎo)致各種并發(fā)癥[10]。探尋準確預(yù)判PE妊娠結(jié)局的指標有著重要意義，其對治療方案的制定有著決定性作用。

miR-4286可通過調(diào)節(jié)細胞凋亡和炎癥反應(yīng)參與血管內(nèi)皮損傷過程[6]，其可能通過以下機制參與了PE發(fā)病。PE發(fā)病機制包括氧化應(yīng)激、母胎免疫平衡失調(diào)及滋養(yǎng)細胞浸潤異常等[11]。孕婦胎盤淺著床會導(dǎo)致胎盤血流灌注相對不足，血管內(nèi)皮生成因子的分泌會減少，同時還會刺激機體分泌更多的抗血管生成因子，如可溶性FMS樣酪氨酸激酶-1、可溶內(nèi)皮糖蛋白等，促進活性氧生成和缺氧誘導(dǎo)因子-1等炎性細胞因子分泌，誘發(fā)內(nèi)皮功能障礙，最終導(dǎo)致PE發(fā)病[12]。筆者研究比較了Hp組和Hp+PE組T2和T3時點miR-4286水平，結(jié)果顯示Hp組T2和T3時點miR-4286水平均高于Hp+PE組，該結(jié)果提示miR-4286水平與PE發(fā)病有關(guān)。此外，研究結(jié)果還顯示兩組miR-4286水平隨時間進展均呈升高趨勢，但Hp組miR-4286水平升高程度高于Hp+PE組，該結(jié)果亦提示miR-4286水平與PE發(fā)病有關(guān)，或許與妊娠結(jié)局有著一定聯(lián)系。

筆者研究比較了不同妊娠結(jié)局患者的miR-4286水平，結(jié)果顯示結(jié)局不良組T1、T2和T3時點miR-4286水平均低于結(jié)局良好組，該結(jié)果提示miR-4286水平與Hp+PE妊娠結(jié)局有關(guān)；兩組的miR-4286水平隨時間進展呈升高趨勢，結(jié)局不良組miR-4286水平升高程度高于結(jié)局良好組，該結(jié)果進一步佐證了miR-4286水平與Hp+PE妊娠結(jié)局有關(guān)，檢測其水平或可有助于妊娠結(jié)局的判斷。遂比較了T1、T2和T3時點miR-4286水平判斷妊娠結(jié)局不良的價值，結(jié)果顯示T1時點miR-4286水平判斷妊娠結(jié)局不良的ROC AUC為0.864，高于T2和T3時點miR-4286，該結(jié)果提示T1時點miR-4286水平判斷妊娠結(jié)局不良的價值較高，遂將其納入Logistic回歸分析。

進一步通過Logistic回歸分析miR-4286與妊娠結(jié)局的關(guān)系，結(jié)果顯示T1時點miR-4286水平＞1.47是Hp+PE患者妊娠結(jié)局不良的獨立保護因素。miR-4286通過TGF-β1/Smad3通路抑制氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的人臍帶血管內(nèi)皮細胞凋亡和炎癥反應(yīng)，改善血管內(nèi)皮細胞損傷[6]。TGF-β1/Smad3通路及血管內(nèi)皮細胞損傷均參與了PE發(fā)病和進展過程，TGF-β1/Smad3通路的激活不僅與血管內(nèi)皮的損傷有關(guān)[6]，還會增強人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞的生長、增殖及遷移侵襲能力[7，13]，血管內(nèi)皮的損傷會引起多系統(tǒng)器官的受損，嚴重威脅著母胎生命安全[14]。miR-4286與妊娠結(jié)局有關(guān)，推測其原因是其可調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3通路或血管內(nèi)皮損傷參與PE進展，其水平與患者血管內(nèi)皮損傷有關(guān)，進而反映妊娠結(jié)局。麥彩園等[15]研究顯示PE孕婦24 h尿蛋白定量較高與母嬰不良妊娠結(jié)局的發(fā)生有關(guān)，吳立英[16]研究顯示妊娠期高血壓和剖宮產(chǎn)是不良妊娠結(jié)局發(fā)生的獨立危險因素。筆者研究結(jié)果顯示SBP＞154 mmHg、24 h尿蛋白＞2.37 g和剖宮產(chǎn)是Hp+PE患者妊娠結(jié)局不良的獨立危險因素，與上述研究結(jié)果一致。此外，研究結(jié)果還顯示分娩孕周＞37周是Hp+PE患者妊娠結(jié)局不良的獨立保護因素。分娩孕周＞37周表示胎兒屬于足月產(chǎn)，其不良事件，如胎兒宮內(nèi)窘迫、胎兒死亡等的發(fā)生率低于早產(chǎn)兒。

綜上所述，PE確診時miR-4286水平＞1.47與Hp+PE患者妊娠結(jié)局良好有關(guān)。筆者研究僅比較了PE確診、妊娠28周第1天和妊娠30周第1天 時miR-4286水平與妊娠結(jié)局的關(guān)系，下一步將增加時間梯度，分析各時點指標的價值；此外，對于miR-4286水平是否可用于孕周28周后PE發(fā)病或未感染Hp的PE患者妊娠結(jié)局的判斷，還未可知，下一步將針對上述不足，進行補充，充實研究內(nèi)容。