BRAFV600E基因突變與PTC患者病灶數目及碘攝入量的相關性分析

李小妹，李 想，王利利，杜麗艷，宋愛林

甲狀腺癌（thyroid cancer，TC）是臨床多見的內分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，且發(fā)病率呈逐年增加趨勢，其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid of carcinoma，PTC）占80%～90%[1]。越來越多研究發(fā)現，PTC與鼠類肉瘤病毒癌基因同源物B1（v-raf murinesarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）基 因 突 變 存 在 相 關 性。隨 著BRAFV600E基因突變研究的深入，該突變已被證實是影響PTC侵襲性的危險因素，且多中心臨床研究結果顯示，BRAFV600E基因突變與腫瘤侵襲性病理特征、復發(fā)、生存情況密切相關[2，3]，因此研究BRAFV600E基因突變的相關因素對于臨床治療具有重要指導意義。流行病學研究表明，長期高碘攝入可增加PTC發(fā)生風險，而PTC中是BRAFV600E基因突變最常見、最有特異性遺傳突變[4]，故而可推測BRAFV600E基因突變與高碘攝入量存在相互關系。在臨床實踐發(fā)現仍有部分BRAFV600E突變型PTC患者有良好預后，表明BRAFV600E基因突變難以有效預測PTC患者預后情況[5]。PTC患者手術方式是影響預后重要因素，而病灶數目、病灶分布決定手術方式選擇，如單灶或者多灶位于一側腺葉者，以甲狀腺患側葉及峽部切除聯(lián)合患側中央區(qū)淋巴結清掃術為主；多灶位于兩側者，則需行甲狀腺全切聯(lián)合雙側中央區(qū)淋巴結清掃術[6]。目前，關于BRAFV600E基因突變與PTC患者病灶數目及碘攝入量關系尚不明確，因此筆者將通過實例進一步探討和研究BRAFV600E基因突變與術后復發(fā)的關系，旨在為臨床治療提供指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 臨床材料

選擇2018年6月至2020年10月在邢臺醫(yī)學高等專科學校第一附屬醫(yī)院收治的248例PTC患者，其中男性68例，女性180例；年齡32～70歲，平均年齡52.28歲（標準差5.44歲）；腫瘤T分期，T1期148例，T2期61例，T3期30例，T4期9例；病灶數目，單病灶176例，多病灶72例；淋巴結轉移57例。

選擇標準：①符合術后病理診斷為PTC，且接受碘放射治療；②患者均接受BRAFV600E基因檢測；③均初次接受甲狀腺手術，術前未曾接受過放化療及其他輔助治療；④臨床病理資料完整，且均完成3年隨訪；⑤患者均簽署知情同意書，且該研究已獲得倫理委員會批準。

排除標準：①復發(fā)后再次手術或者因殘余癌灶而行二次手術；②合并其他部位非甲狀腺轉移性腫瘤；③合并有其他病理類型的TC；④頭頸部放射治療史及遠處轉移；⑤未行中央區(qū)淋巴結清掃。

1.1.2 主要試劑與儀器

BRAFV600E基因突變熒光試劑盒（檢測靈敏度為1%。廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司，中國）。7500型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國）。

1.2 方法

1.2.1 BRAFV600E突變基因檢測

于PTC手術中獲取PTC組織標本。

采用實時熒光定量PCR技術的擴增阻滯突變系統(tǒng)檢測法進行BRAFV600E突變基因檢測，實驗過程按試劑盒操作步驟進行。借助Primer 5引物設計軟件設計引物。

PCR反應體系共50μL，包括上、下游引物各2μL，0.25μL Taq酶，10μL 2×Taq PCR MasterMix，1μL DNA模版，2μL dNTP Mixture，無菌水定容至50μL。PCR擴增條件：95℃×10 min；92℃×15 s，60℃×60 s，共45個循環(huán)。PCR產物經純化后，取5μL擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈檢查擴增結果。根據突變情況分為突變組和未突變組。

1.2.2 觀察指標

根據突變情況對患者進行分組后，統(tǒng)計兩組癌灶平均大小、淋巴結陽性（指淋巴結清掃個數高于5個，檢測到至少5個淋巴結發(fā)生轉移）、T分期（tumor node metastasis classification）（參照第8版TNM系統(tǒng)[7]，T1為原發(fā)灶最大徑≤3 cm，T2為原發(fā)灶最大徑3～5 cm，T3為原發(fā)灶最大徑5～7 cm，T4為原發(fā)灶最大徑＞7 cm）、復發(fā)風險分級[高風險：腫瘤不完全切除，輕微腺外侵犯，遠處轉移淋巴結（＞3 cm）；中風險：輕微腺外侵犯，具有侵襲性組織學，血管侵犯或≥5個淋巴結（0.2～3.0 cm）；低風險：局限于腺內的分化型甲狀腺癌，＜5個淋巴結微轉移（＜0.2 cm）[2]]、腺外侵犯（病理學檢查報告顯示腫瘤侵犯甲狀腺外纖維脂肪組織）、病灶數目、碘攝入量。

1.2.3 腫瘤無復發(fā)生存分析

對PTC患者進行隨訪。分析病灶數目、碘攝入量、BRAFV600E基因突變與腫瘤無復發(fā)生存（relapse free survival，RFS）關系。根據病灶數目分組，分為單灶性組和多灶性組；根據突變情況分為突變組和未突變組；以尿碘值表示碘攝入量，采用過硫酸銨消化砷鈰催化分光光度法檢測尿碘值，以尿碘值中位數值為臨界值，將患者分為高碘攝入組和低碘攝入組。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。連續(xù)型正態(tài)分布計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料以例數（%）表示，采用χ2檢驗。腫瘤RFS分析采用Kaplan-Meier檢驗，采用Cox多元回歸分析BRAFV600E基因突變相關危險因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者基線資料比較

248例PTC患者中BRAFV600E基因突變178例（71.77%），未突變70例（28.23 %）。兩組患者的性別、年齡、癌灶平均大小、淋巴結陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。復發(fā)風險分級、腺外侵犯、T分期、病灶數目及碘攝入量與BRAFV600E基因突變有關（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組患者基線資料比較Tab.1 Comparison of baseline data between 2 groups

2.2 BRAFV600E基因突變相關因素Cox多元回歸分析

Cox多元回歸分析顯示，復發(fā)風險分級、腺外侵犯、T分期、病灶數目及碘攝入量均是BRAFV600E基因突變相關危險因素（P＜0.05）。見表2。

表2 BRAFV600E基因突變相關因素Cox多元回歸分析Tab.2 Cox multiple regression analysis of BRAFV600E gene mutation related factors

2.3 腫瘤無復發(fā)生存分析

2.3.1 基于BRAFV600E基因突變分層PTC患者的RFS分析

隨訪3年，共有54例患者復發(fā)。突變組與未突變組PTC患者的RFS曲線差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.295，P=0.038），突變組患者有更高的復發(fā)風險，風險比（hazard ratio，HR）（95 % CI）=2.095（1.034～3.330）。見圖1。

圖1 突變組與未突變組PTC患者的RFS曲線比較Fig.1 Comparison of RFS curves between mutation group and non-mutation group of PTC patients

2.3.2 基于病灶數目分層PTC患者的RFS分析

病灶數目多灶性組與單灶性組PTC患者的RFS曲線差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.349，P=0.037），多灶性組患者有更高的復發(fā)風險，HR（95%CI）=1.775（1.040～3.488）。見圖2。

圖2 多灶性組與單灶性組PTC患者的RFS曲線比較Fig.2 Comparison of RFS curves between multiple lesions group and single lesion group of PTC patients

2.3.3 基于碘攝入量分層PTC患者的RFS分析

高碘攝入量組（118例）與低碘攝入量組（130例）PTC患者的RFS曲線差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.602，P=0.032），高碘攝入量組患者有更高的復發(fā)風險，HR（95%CI）=1.804（1.052~3.065）。見圖3。

圖3 高碘攝入量組與低碘攝入量組PTC患者的RFS曲線Fig.3 Comparison of RFS curves between high-iodine-intake group and low-iodine-intake group of PTC patients

3 討論

PTC屬于分化良好的惡性腫瘤，死亡風險較低，10年生存率高達90%，即使患者確診時已發(fā)生頸部淋巴結轉移，仍具有較好預后情況[8]。PTC中約40%～80%患者存在BRAFV600E基因突變，BRAFV600E基因突變是PTC中最常見的遺傳學改變。BRAFV600E基因突變是PTC侵襲性分子機制的致癌基因，參與調控腫瘤侵襲性病理特征，影響腫瘤復發(fā)及預后，因此臨床上可根據BRAFV600E基因突變情況篩選高危人群，從而指導臨床精準治療及預后評估。

筆者研究結果顯示基因突變發(fā)生率為71.77 %（178/248例），與既往研究結果相近[9，10]。BRAF基因位于人類7號染色體，其作用是編碼RAF家族絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，進而調控絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/細胞外調節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK）信號通路，影響細胞的生長、增殖、分化、分裂等生物學過程。BRAF基因突變中T1799A點突變占90%以上，即第600位密碼子的谷氨酸替代纈氨酸（V600E），進而導致編碼的激酶活化，促進細胞的無限增殖、分裂，最終發(fā)生癌變，故而BRAFV600E基因突變對于PTC的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義[11]。筆者研究結果顯示，復發(fā)風險分級、腺外侵犯、T分期、病灶數目及碘攝入量與BRAFV600E基因突變有關（P＜0.05），且通過Cox多元回歸分析進一步證實以上臨床病理特征均是BRAFV600E基因突變相關危險因素 （P＜0.05）。Ayala MD等[12]研究表明，存在BRAFV600E基因突變的PTC患者，即使確診時處于疾病早期階段，腫瘤的復發(fā)風險也高于野生型（未發(fā)生基因突變），推測認為基因突變可降低對放射性131I的吸收率，進而影響PTC的預后，從而增加復發(fā)風險。另外，從分子水平上推測認為，長期的高碘攝入導致鈉碘同向轉運體mRNA表達降低，抑制甲狀腺組織攝取碘及甲狀腺激素合成，進而引起下丘腦過度分泌促甲狀腺激素，使得發(fā)生甲狀腺腫，引起甲狀腺癌的發(fā)生，而PTC患者中多數存在BRAFV600E基因突變[13，14]，故而筆者研究顯示高碘攝入量是BRAFV600E基因突變相關危險因素。BRAFV600E基因突變在PTC癌組織中具有高度的特異性，是PTC侵襲性分子機制的致癌基因，進而增加腺外侵襲、淋巴結轉移風險，增加腫瘤病灶數目，故而腫瘤病灶數目與BRAFV600E基因突變顯著相關。

盡管PTC患者死亡風險較小，但疾病復發(fā)率仍然較高，特別是BRAFV600E基因突變的PTC患者，需要接受更徹底的治療方案，且配合長期隨訪，從而降低疾病復發(fā)、死亡風險。國外很多研究表明BRAFV600E基因突變者預后較差[15]，在中國PTC患者中BRAFV600E基因突變率較高，但并沒有明確證據顯示BRAFV600E變異型預后更差，因此該基因突變在評估PTC患者預后中的價值尚待確證。筆者研究結果顯示，隨訪3年，共有54例患者復發(fā)，其中BRAFV600E基因突變組患者有更高的復發(fā)風險（P＜0.05），與朱長雨等[5]研究結果相近，BRAFV600E基因突變加強PTC的侵襲性，是PTC復發(fā)的高危因素。研究認為BRAFV600E與老年PTC患者間存在更明顯的相關性，相對年輕患者具有更差的臨床結果，包括更高的PTC復發(fā)率和特異性死亡率[16]，結合此次研究結果，進一步證實BRAFV600E基因突變可增加術后復發(fā)風險。Angell TE等[17]研究認為BRAFV600E基因與PTC患者的異常免疫反應有關，即突變型基因可能增加腫瘤免疫抑制，導致PTC預后不良。同時，筆者研究顯示，高碘攝入量組患者有更高的復發(fā)風險（P＜0.05），分析認為長期的高碘攝入一方面可通過“脫逸”現象、Wolff Chaikoff效應引起膠質性甲狀腺腫，并誘發(fā)自身免疫反應、細胞凋亡，進而導致甲狀腺細胞過度死亡；另一方面，還可以抑制鈉碘同向轉運體表達、轉錄，損傷甲狀腺濾泡上皮細胞的攝取碘功能，進而減少甲狀腺激素分泌，升高促甲狀腺激素水平，促甲狀腺激素的長期刺激引起甲狀腺濾泡上皮細胞增生，最終增加TC發(fā)生風險[18]。BRAFV600E基因突變、高碘攝入均可降低鈉碘同向轉運體mRNA表達，進而降低甲狀腺癌細胞攝碘能力，最終影響放射性碘的治療效果，增加術后復發(fā)風險。另外，多灶性組患者有更高的復發(fā)風險（P＜0.05），分析認為病灶數目影響手術切除范圍的選擇，多病灶手術切除相對復雜，特別是對于難以識別的微小腫瘤，往往容易忽視而導致腫瘤殘留，增加復發(fā)風險，因此對可疑病灶進行基因檢測[19]，可為穿刺組織的病理診斷提供重要線索。

綜上所述，PTC患者病灶數目及碘攝入量均是BRAFV600E基因突變相關危險因素，多灶性、高碘攝入量、BRAFV600E基因突變患者有更高的復發(fā)風險。