擬可可毛球二孢菌等7種草珊瑚內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性研究

蒙思妤，鄧業(yè)成，廖金梅，韋堅芬，鄧志勇，駱海玉

（珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護省部共建教育部重點實驗室/廣西師范大學生命科學學院，廣西 桂林 541006）

0 引言

【研究意義】草珊瑚[Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai]是傳統(tǒng)的中草藥，隸屬于金粟蘭科草珊瑚屬多年生草本植物[1]，因其成熟果實與紅色珊瑚相似而得此名，又名腫節(jié)風和九節(jié)茶[2]。草珊瑚具有重要的藥用價值，全株可入藥，味苦、辛，性平，可用于治療創(chuàng)傷性骨折、喉痛、關(guān)節(jié)腫脹和膿腫等癥狀[3]，同時還具有抗菌消炎、抗病毒、抗腫瘤等生物活性。我國民間還出現(xiàn)了許多具有顯著效果的含草珊瑚處方，其中苗醫(yī)利用草珊瑚治療創(chuàng)傷性骨折的處方已經(jīng)被列入國家非物質(zhì)文化遺傳保護名錄[4]。草珊瑚植株具有較強的抗菌活性，探尋對植物和動物致病菌抑制效果顯著的拮抗菌株，研發(fā)高效無害的廣譜殺菌劑，對控制植物病害的危害具有重要意義。【前人研究進展】經(jīng)現(xiàn)代化學分析技術(shù)研究，草珊瑚提取物主要含有萜類、黃酮類、香豆素、酚酸類、揮發(fā)油等成分[5-7]。在有關(guān)草珊瑚化學成分的研究中，多認為其黃酮類成分的含量與植株的質(zhì)量是成正比的，即黃酮類成分含量越高，其價值就越高[8]，而在《中國藥典》中則以香豆素中的異嗪皮啶含量為評判標準[9]。在抗菌活性方面，邵佳[10]發(fā)現(xiàn)草珊瑚總黃酮對大腸桿菌的抑制率為47.03%。郭蒙蒙[11]使用草珊瑚提取物對耐藥幽門螺桿菌菌株開展了抑菌研究，于體外試驗中發(fā)現(xiàn)其對耐藥幽門螺旋桿菌有明顯的抑制效果，MIC 介于 11.9～47.5 μg·mL-1，與阿莫西林等常見抗生素聯(lián)合抗菌表現(xiàn)出協(xié)同作用，其作用機制可能與破壞幽門螺桿菌的外膜屏障功能有關(guān)。郁建生等[12]在治療禽類細菌感染性疾病時發(fā)現(xiàn)，草珊瑚口服液和注射液對禽霍亂等動物病害具有良好的治療效果。此外，宋利沙等[13]在測定草珊瑚內(nèi)生真菌（橡膠生擬莖點霉菌和新殼梭孢菌）的抑菌活性時，發(fā)現(xiàn)其對三七灰霉病菌等7種病原真菌具有較強的抑制作用，抑菌率均達80%以上?！颈狙芯壳腥朦c】植物內(nèi)生真菌不僅能為寄主植物提供營養(yǎng)，為寄主植物提高抗生物和非生物逆境能力，還能與寄主植物協(xié)同進化產(chǎn)生具有不同生物活性的次生代謝物[14-15]。同時，植物內(nèi)生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)相比較于植物的生長繁殖具有不受自然環(huán)境的限制、生長成本低、可控性強以及產(chǎn)量高等優(yōu)點，具有較強的應(yīng)用潛力。近幾年對于草珊瑚的研究大多集中在其化學成分、臨床應(yīng)用和藥理研究等方向，相對其內(nèi)生真菌的生物活性方面的研究報道較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】擬從草珊瑚內(nèi)生真菌中分離篩選出具有抗菌活性的菌種，旨在從活性菌株中進一步分離得到具有高效抑菌活性的單體化合物，有效推動草珊瑚資源的利用與發(fā)展，進一步為防治植物病害生物領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試內(nèi)生真菌 擬可可毛球二孢菌（Lasiodiplodia pseudotheobromae），由本實驗室分離。

1.1.2 供試植物病原真菌 供試植物病原真菌如表1所示。

1.1.3 供試病原細菌 供試病原細菌如表2所示。

1.2 試驗方法

1.2.1 7株草珊瑚內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物抗真菌活性 首先對各菌株進行活化，接著將孔徑0.4 cm的菌餅接入PDB培養(yǎng)基中（1菌餅/100 mLPDB），置于恒溫箱中（27 ℃ ) 靜置培養(yǎng)45 d，得到發(fā)酵種子液。后使用張澤等[16]的方法，得到乙酸乙酯萃取浸膏、正丁醇萃取浸膏和萃余層浸膏。再將所得濾渣使用甲醇浸泡72 h，m（濾渣）∶V（甲醇）＝1∶3，提取3次，使用超聲波清洗儀提取30 min，重復抽濾3次去渣留液，濃縮蒸干濾液，即得到菌絲體甲醇萃取浸膏。

參考Deng等[17]的菌絲生長速率法，將羅漢果根腐病菌和甘蔗鳳梨病菌作為指示菌株，對7株草珊瑚內(nèi)生菌株進行篩選。在超凈工作臺中將活性菌株各個萃取層的浸膏用丙酮溶解，并稀釋成質(zhì)量濃度為20 mg·mL-1的藥液，待用。溶解PDA培養(yǎng)基呈液狀，待其降至50～60℃，將1 mL藥液與9 mL培養(yǎng)基混合，搖晃均勻，配置成含藥2 mg·mL-1的帶藥平板。將直徑為0.4 cm的菌餅菌絲面朝下接種于帶藥平板上（3個菌餅/1個培養(yǎng)基），使3個菌餅在平板中心并呈一個邊長為3 cm的等邊三角形排列。將指示菌株接于PDA平板中點作為對照組。于（27±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，運用十字交叉法測量菌株菌落的長短直徑（計量單位統(tǒng)一為cm），根據(jù)下列公式計算抑菌率。

式中，D0為對照組菌落直徑，D1為處理組菌落直徑。

1.2.2 7株草珊瑚內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物抗細菌活性測定參考陸春雷等[18]、潘立衛(wèi)等[19]的最低抑制濃度法并稍加修改測定7株內(nèi)生真菌萃取物（乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、菌絲體甲醇萃取物）對3種病原細菌的抗菌活性。將供試細菌置于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基搖床發(fā)酵12 h，后用無菌水稀釋10倍，待用。樣品用V（丙酮）∶V（水）＝1∶1配成一系列濃度梯度。取8支試管，分別編號1-8號。1-6號試管：由高到低依次加入上述濃度梯度的0.1 mL樣品藥液、0.1 mL病原細菌稀釋液和0.8 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基；7號試管：加等量稀釋菌液和培養(yǎng)基，不加藥液，作為陽性對照；8號試管：加入 0.1 mLV（丙酮）∶V（水）＝1∶1和等量培養(yǎng)基作為陰性對照。于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，若試管澄清透明，搖勻后仍然澄清，認為該試管無菌生長，若試管呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，表明該試管有菌生長。以無菌生長的最低濃度為MIC[20]。

1.2.3 內(nèi)生真菌 J-10 發(fā)酵培養(yǎng) 活化 J-10 后，其發(fā)酵產(chǎn)物處理同 1.2.1。

1.2.4 內(nèi)生真菌 J-10對 7 種植物病原真菌毒力 采用菌絲生長速率法，測定內(nèi)生菌株J-10的 3 種萃取物（乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、 菌絲體甲醇萃取物）對 7 種供試植物病原真菌的抑菌活性。方法同 1.2.1，配置一定濃度梯度帶藥培養(yǎng)基。通過SPSS19.0 軟件統(tǒng)計抑制率，再按照武懷恒等[21]的方法計算得到毒力回歸方程。

1.2.5 內(nèi)生真菌 J-10對11種致病細菌的最低抑制濃度 采用最低抑制濃度法，測定內(nèi)生菌株J-10的 3種萃取物（乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、 菌絲體甲醇萃取物）對 11種供試致病細菌的抑菌活性，試驗方法同1.2.2。

1.2.6 活性菌株的鑒定 選取抑菌效果最為顯著的內(nèi)生真菌J-10，觀察其菌落形態(tài)，驗證其生物學特征并結(jié)合光學顯微鏡進行形態(tài)學鑒定。再委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行ITS測序分析,將所獲序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 7株草珊瑚內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物抗真菌活性

以羅漢果根腐病菌和甘蔗鳳梨病菌為指示菌株，采用菌絲生長速率法測定了7株草珊瑚內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性。圖1為7株內(nèi)生真菌菌落形態(tài)圖，圖2為7株內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對兩種指示菌株的菌斑圖（抑菌率＞50%）。7種內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對羅漢果根腐病菌和甘蔗鳳梨病菌的抑制結(jié)果（表3）顯示，J-10甲醇萃取物和乙酸乙酯萃取物對兩種指示菌株的抑制效果最強，抑制率介于84.84%～88.51%；G-5甲醇萃取物和乙酸乙酯萃取物對甘蔗鳳梨病菌的抑菌率達86.23%和92.75%，其正丁醇萃取物對羅漢果根腐病的抑制率為73.53%；J-12乙酸乙酯萃取物對甘蔗鳳梨病菌的抑制率為73.9%，但是其余萃取層對兩種指示菌的抑制效果不佳甚至無活性。

表3 7種內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對羅漢果根腐病菌和甘蔗鳳梨病菌的抑制效果Table 3 Antimicrobial activity of fermentation products of 7 endophytic fungi against C.paradoxa and F.solani

圖1 7種草珊瑚內(nèi)生真菌菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphologies of 7 endophytic fungi

圖2 7株內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對羅漢果根腐病菌和甘蔗鳳梨病菌抑制活性菌斑圖（抑菌率＞50 %）Fig.2 Antimicrobial activity of secondary metabolites of 7 endophytic fungi against C.paradoxa and F.solani (bacteriostatic rate＞50%)

2.2 7株草珊瑚內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物抗細菌活性

以溶壁微球菌（G+）、普通變形桿菌（G-）和羅漢果青枯菌（G-）作為指示菌株，采用最低抑制濃度法測定J-9、J-10、J-12、J-20、G-4、G-5、Y-8等7株內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抗細菌活性，結(jié)果見表4。菌株J-10的甲醇提取物和乙酸乙酯提取物對3種指示菌株均有較強的抑制活性，其MIC值均＜0.6 mg·mL-1。7種活性菌株發(fā)酵產(chǎn)物的甲醇和乙酸乙酯提取物對3種活性菌株的抑制活性相當，都具有一定抑制活性；除菌株J-9和J-10外，其余菌株的正丁醇提取物對3種指示菌株的抑制活性較低甚至無活性。

表4 7種內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對3種致病細菌的抑制作用Table 4 Antimicrobial activities of 7 endophytic fungi fermentation products against 3 pathogens

綜合7株草珊瑚內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對2種植物病原真菌和3種致病細菌的試驗結(jié)果，選擇J-10菌株進一步測定其抑菌活性，以期篩選出具有廣譜抑菌性且抑菌效果顯著的菌株。

2.3 內(nèi)生真菌J-10發(fā)酵產(chǎn)物對植物病原真菌的毒力

為進一步評價菌株J-10發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性，采用生長速率法測定了J-10發(fā)酵產(chǎn)物的2種不同溶劑萃取物對7種常見植物致病真菌的毒力，結(jié)果如表5、圖3所示。結(jié)果顯示，J-10的乙酸乙酯萃取物對7種供試植物致病真菌的毒力最為顯著，EC50介于0.199 5～1.172 2 mg·mL-1，其中，對玉米大斑病菌的毒力最強，對羅漢果根腐病菌的毒力最弱。J-10菌絲體甲醇提取物對7種致病真菌的EC50介于0.125 5～9.468 7 mg·mL-1，其中，對茶輪斑病菌的毒力最強，對羅漢果根腐病的毒力最弱。

圖3 J-10發(fā)酵產(chǎn)物不同溶劑萃取層對7種植物病原真菌的抑制活性（菌斑圖）Fig.3 Antimicrobial activities of J-10 extracts against 7 plant pathogens (plaque diagram)

表5 J-10發(fā)酵產(chǎn)物不同溶劑層對7種植物病原菌的抑制活性Table 5 Antimicrobial activities of J-10 extracts against 7 plant pathogens

2.4 內(nèi)生真菌J-10發(fā)酵產(chǎn)物對11種致病細菌的最低抑制濃度

采用最低抑制濃度法測定內(nèi)生真菌J-10的乙酸乙酯、正丁醇和菌絲體甲醇萃取物對11種常見致病細菌的 MIC 值。結(jié)果（表6）顯示內(nèi)生真菌J-10正丁醇和菌絲體甲醇萃取物對11種供試細菌的MIC介于0.125 0～5.000 0 mg·mL-1，其中，對普通變形桿菌和大腸桿菌的抑菌效果最好。其乙酸乙酯萃取物對11種供試細菌的MIC介于0.125 0～2.500 0 mg·mL-1，其中對普通變形桿菌、大腸桿菌、羅漢果青枯菌和溶壁微球菌的抑菌效果最好，均＞5.000 0 mg·mL-1，其中對蠟樣芽胞桿菌的抑菌效果最好。此外，3種不同溶劑提取物對革蘭氏陰性菌的抑制效果優(yōu)于革蘭氏陽性菌。

表6 J-10發(fā)酵產(chǎn)物不同溶劑層對11種致病細菌的抑制活性Table 6 Antimicrobial effects of J-10 extracts against 11 pathogens

2.5 活性內(nèi)生真菌的鑒定

將菌株J-10送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，基于測序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），結(jié)合菌落形態(tài)學分析，最終確定J-10為擬可可毛球二孢菌。

圖4 菌株J-10的18srDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 18S rDNA of J-10

2.6 內(nèi)生真菌J-10菌落特征

圖5為擬可可毛色二孢菌菌落形態(tài)，其菌落在PDA平板培養(yǎng)基上最初呈白色圓形，菌絲蓬松，生長速度快。在27 ℃的自然光條件下，24 h后測量菌落直徑為49 mm，38 h后可長滿培養(yǎng)基（d=90 mm）。大約5 d后表面顏色變?yōu)闇\灰白色，培養(yǎng)基背面顏色變?yōu)闇\灰色至灰色，圓心有一圈灰褐色菌絲，20 d后整個培養(yǎng)基呈現(xiàn)灰褐色絨狀，培養(yǎng)基背面為黑褐色，后正背面均變?yōu)樘亢谏?/p>

圖5 擬可可毛球二孢菌菌落生長形態(tài)Fig.5 Cultured L.pseudotheobromae colonies

3 討論

本研究探討了7種草珊瑚內(nèi)生真菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)G-5乙酸乙酯萃取物對甘蔗鳳梨病菌的抑制活性最強，但是擬可可毛球二孢菌發(fā)酵產(chǎn)物甲醇和乙酸乙酯萃取物對菌株的抑制作用更為廣泛，且抑制效果顯著 。草珊瑚內(nèi)生真菌擬可可毛球二孢菌對辣椒炭疽病菌、茶輪斑病菌、甘藍黑斑病菌、甘蔗鳳梨病菌、玉米大斑病菌、貢柑鏈格孢菌和羅漢果根腐病菌等7種植物病原真菌具有較強的抑制作用；對普通變形桿菌、傷寒沙門氏菌、羅漢果青枯菌、大腸桿菌、溶壁微球菌、蠟樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、炭疽桿菌、藤黃微球菌和金黃色葡萄球菌等11種致病細菌具有一定的抗菌活性。目前，草珊瑚及其亞種海南草珊瑚在我國分布較廣泛，童悅[22]對二者粗提物對芒果膠孢炭疽菌抑菌效果進行比較，結(jié)果表明后者對芒果膠孢炭疽菌的活性遠高于前者，前者EC50為15.85 mg·mL-1，后者EC50為1.46 mg·mL-1。張焱珍等[23]測定了77種植物提取物對12種較為常見的植物病原真菌的抑制活性，其中，海南草珊瑚0.2 mg·mL-1粗提物對玉米大斑病菌無抑菌活性。本研究在草珊瑚中分離得到擬可可毛球二孢菌，而其發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯層萃取物表現(xiàn)出較強的抗菌活性，其中，對玉米大斑病菌的EC50為0.199 5 mg·mL-1。另外，其不同溶劑萃取層對11種致病細菌MIC值介于0.125～5.000 mg·mL-1，與前人[24-27]的研究相比，擬可可毛球二孢菌的抑菌效果相對較強。此外，該菌甲醇萃取物和乙酸乙酯萃取物對玉米大斑病菌、茶輪斑病菌和貢柑鏈格孢菌的抑菌活性以及該菌乙酸乙酯萃取物對辣椒炭疽病菌的抑菌活性均低于多菌靈[28]（98%原液，MIC分別為 8.765 9、7.226 9、1.422 4、1.372 9 mg·mL-1）。目前關(guān)于草珊瑚的研究仍然集中在探索其提取物的活性上，該植株的藥理作用與化學成分之間的相關(guān)性尚未明確，值得進一步展開研究。

擬可可毛色二孢菌是一種生長繁殖快速、生物量較大的一種真菌，不僅能抑制上述供試致病菌的生長，同時也是一種在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上危害極其嚴重的病原菌，廣泛寄生在熱帶、亞熱帶地區(qū)一些果樹和楠木[29]上，危害植物的枝干和果實，引起潰瘍病[30]等病癥，可致使果樹枝葉及其果實腐爛。擬可可毛色二孢菌雖是一種植物致病菌，但本研究發(fā)現(xiàn)其次生代謝物中可能含有與抑菌有關(guān)的物質(zhì)，大部分在乙酸乙酯萃取層，為尋找活性成分縮小了一定范圍，為生物源抗菌劑的開發(fā)應(yīng)用提供了理論依據(jù)。