八味沉香散對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

李永慧， 朱 琳， 寇毅英， 李永芳*

(1.青海省西寧市第一人民醫(yī)院，青海 西寧 810000；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001)

近年來(lái)，急性心肌梗塞的發(fā)病率與死亡率明顯上升，嚴(yán)重威脅人類的生命健康[1-2]。迅速恢復(fù)血供，即再灌注治療是挽救急性心肌梗死的根本措施。但恢復(fù)血供又可造成或加重心肌細(xì)胞的損傷，即心肌缺血再灌注損傷，成為再灌注療法獲益的主要障礙[3-4]。因此，尋找安全有效的治療藥物，提高急性心肌梗塞的再灌注治療療效，顯得尤為重要。藏藥八味沉香散具有消心熱、寧心安神、醒腦開(kāi)竅之功效，是藏醫(yī)臨床治療冠心病心絞痛的經(jīng)典常用藏醫(yī)藥方。研究發(fā)現(xiàn)，八味沉香散能明顯改善異丙腎上腺素和垂體后葉素引起的心肌缺血損傷[5-7]，但其對(duì)心肌缺血再灌注損傷是否也具有保護(hù)作用還待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)擬采用在體冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，研究八味沉香散抗心肌缺血再灌注損傷作用，以期為八味沉香散防治心肌缺血再灌注損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，開(kāi)拓藏藥在治療缺血性心臟病的領(lǐng)域。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康SD大鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量220～280 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK (陜) 2017-003。

1.2 試劑與藥物 八味沉香散(批號(hào)20171107)，購(gòu)自西藏神猴藥業(yè)有限責(zé)任公司，取適量用蒸餾水分別配置成0.4、0.8、1.6 g/kg藥液(低、中、高劑量)，備用。肝素鈉(批號(hào)170512)，購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司；2,3,5三苯基氯化四氮唑(TTC)(批號(hào)922G037)，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；烏拉坦(批號(hào)130412)，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司；乳酸脫氫酶 (LDH)、肌酸激酶 (CK)試劑盒(批號(hào)20170025)，購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器 DHX-150型動(dòng)物呼吸機(jī)，購(gòu)自成都儀器廠；Powerlab型數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)，購(gòu)自澳大利亞AD Instruments公司；723P型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，購(gòu)自上海光譜儀器有限公司；水浴鍋，購(gòu)自上海醫(yī)大儀器有限公司；TGL-16gR型高速離心機(jī)，購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠。

2 方法

2.1 分組與給藥 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和八味沉香散低、中、高劑量組(0.4、0.8、1.6 g/kg)，每組10只。八味沉香散各劑量組大鼠灌胃給予相應(yīng)劑量八味沉香散藥液，假手術(shù)組和模型組灌胃給予等量蒸餾水，每天1次, 連續(xù)10 d。末次灌胃后1 h，除假手術(shù)組大鼠不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈外，其余各組大鼠均行心肌缺血再灌注損傷。

2.2 缺血再灌注模型制備 大鼠以20%烏拉坦 (0.4 mL/100 g) 腹腔注射麻醉，仰位固定，四肢皮下插入針式電極，持續(xù)記錄肢體二導(dǎo)聯(lián)心電圖，切開(kāi)氣管、插管并連接動(dòng)物呼吸機(jī)(頻率70～80次/min，潮氣量 2～3 mL/100 g，呼吸比 2∶1)，穩(wěn)定10 min后，開(kāi)胸、剪開(kāi)心包、暴露心臟，于左心耳下緣肺動(dòng)脈圓錐旁以6-0無(wú)創(chuàng)縫合線穿過(guò)左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)，穩(wěn)定10 min后，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈，以心電圖ST段抬高或T波高聳作為結(jié)扎成功的標(biāo)志，心肌缺血30 min后打開(kāi)結(jié)扎線進(jìn)行復(fù)灌，抬高的ST段降低或高聳的T波恢復(fù)表示心肌再灌注成功，再灌注60 min，制備大鼠心肌缺血再灌注模型。

2.3 血清LDH、CK活性檢測(cè) 大鼠心肌缺血再灌注結(jié)束后，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心15 min，取血清，置于-80 ℃冰箱保存，按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)血清LDH、CK活性。

2.4 心肌梗死范圍檢測(cè) 大鼠腹主動(dòng)脈取血后，摘取心臟，剔除血管、脂肪等非心肌組織，濾紙吸去心表水分。平行房室溝，將心臟切成1.5～2.0 mm薄片，共5片，切片在37 ℃預(yù)溫的含1% TCC的Tris-HCl緩沖液中染色15 min，取出切片以4%甲醛溶液固定1 h，正常心肌呈紅色，梗死心肌呈灰白色，分別稱定正常、梗死心肌質(zhì)量，計(jì)算梗死心肌占整個(gè)心肌(梗死心肌與正常心肌之和)的質(zhì)量百分比, 即心肌梗死范圍。

2.5 心肌組織病理學(xué)檢測(cè) 每組取4只大鼠，心肌缺血再灌注后取心臟，置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化。該實(shí)驗(yàn)由青海省康樂(lè)醫(yī)院完成。

2.6 心肌超微結(jié)構(gòu)觀察 每組取4只大鼠，心肌缺血再灌注后取心臟，樣品經(jīng)3%戊二醛預(yù)固定，1%四氧化鋨再固定，丙酮逐級(jí)脫水，Epon812包埋，半薄切片光學(xué)定位，超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，日立H-600IV型透射電鏡觀察。該實(shí)驗(yàn)由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)檢測(cè)所完成。

3 結(jié)果

3.1 八味沉香散對(duì)缺血再灌注大鼠血清LDH、CK活性的影響 如表1所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清LDH、CK活性升高(P<0.01)；與模型組比較，八味沉香散各劑量組大鼠血清LDH、CK活性降低(P<0.05，P<0.01)。

表1 八味沉香散對(duì)大鼠血清LDH、CK活性的影響

3.2 八味沉香散對(duì)缺血再灌注大鼠心肌梗死范圍的影響 如表2所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌梗死范圍增加(P<0.01)；與模型組比較，八味沉香散中、高劑量組大鼠心肌梗死范圍減少(P<0.05，P<0.01)，八味沉香散低劑量組大鼠心肌梗死范圍減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 八味沉香散對(duì)缺血再灌注大鼠心肌梗死范圍的影響

3.3 八味沉香散對(duì)缺血再灌注大鼠心肌組織病理學(xué)的影響 如圖1所示，假手術(shù)組大鼠心肌組織無(wú)變性、壞死，間質(zhì)未見(jiàn)水腫及炎細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠心肌細(xì)胞橫紋不清晰，部分心肌纖維斷裂，心肌間質(zhì)可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，水腫明顯，血管擴(kuò)張，心肌組織有點(diǎn)片狀壞死，可見(jiàn)灶性出血；與模型組比較，八味沉香散各劑量組大鼠心肌細(xì)胞核大致正常、心肌纖維排列基本整齊，心肌間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，細(xì)胞間隙水腫減輕, 低劑量組心肌組織有少量點(diǎn)狀壞死和出血，中、高劑量組大鼠心肌組織未見(jiàn)壞死；且八味沉香散高劑量組大鼠心肌纖維損傷、間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞間隙水腫等病變情況較低、中劑量組更輕。

3.4 八味沉香散對(duì)缺血再灌注大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響 如圖2所示，假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)正常，肌膜完整，心肌纖維排列有序，線粒體結(jié)構(gòu)清晰、完整；模型組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常，胞漿內(nèi)線粒體明顯腫脹，呈現(xiàn)空泡化，部分肌纖維有溶解；八味沉香散低、中劑量組大鼠心肌細(xì)胞受損比模型組輕，但部分線粒體出現(xiàn)腫脹；八味沉香散高劑量組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，線粒體結(jié)構(gòu)清晰與假手術(shù)組比較無(wú)明顯差異。

4 討論

再灌注是治療急性心肌梗塞的主要措施，但大量研究表明，再灌注不一定會(huì)使缺血損傷的組織細(xì)胞得到恢復(fù)，在一定條件下反而造成或加重心肌細(xì)胞的損傷[8]，即心肌缺血再灌注損傷。藥物預(yù)/后處理、缺血預(yù)/后處理、遠(yuǎn)距離缺血預(yù)處理等措施可以有效減輕心肌缺血再灌注的損傷程度，縮小損傷范圍[9-11]。但急性心肌梗塞發(fā)生的不可預(yù)知性限制了缺血預(yù)/后處理、遠(yuǎn)距離缺血預(yù)處理在再灌注治療中的實(shí)際應(yīng)用，相比較而言，藥物預(yù)/后處理具有較安全、使用方便、易控制等優(yōu)點(diǎn)，因此，開(kāi)發(fā)安全有效的抗心肌缺血再灌注損傷藥物具有重要意義。

八味沉香散收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥》，氣芳香，味咸、澀、微苦，具有活血止痛、清心熱、養(yǎng)心、安神、開(kāi)竅的功效，是藏區(qū)臨床廣泛用于治療冠心病、心絞痛的藏成藥[12]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，八味沉香散水提液、95%醇提物、50%醇提物能明顯改善異丙腎上腺素和垂體后葉素引起的大鼠心電圖、血流動(dòng)力學(xué)、血清酶和組織病理學(xué)改變，減輕線粒體結(jié)構(gòu)損傷[5-7]。本研究通過(guò)冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法建立在體大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，探討了八味沉香散對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

心肌細(xì)胞內(nèi)有大量的CK和LDH，當(dāng)心肌發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)，心肌細(xì)胞膜通透性增加，心肌中大量CK、LDH釋放到血液，使血清中CK、LDH水平升高，導(dǎo)致活性增高，因此，血清中CK、LDH活性可反映心肌細(xì)胞受損程度[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，八味沉香散各劑量組大鼠血清CK、LDH活性均降低，說(shuō)明八味沉香散可在一定程度上減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷，減少心肌細(xì)胞CK、LDH的漏出。

心肌梗死范圍是評(píng)價(jià)心肌缺血再灌注損傷程度的一個(gè)重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，八味沉香散預(yù)防給藥能降低大鼠心肌缺血再灌注引起的心肌梗死范圍，改善心肌缺血再灌注損傷中心肌組織的炎細(xì)胞浸潤(rùn)、水腫及心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)一步證實(shí)了八味沉香散對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

線粒體是細(xì)胞能量產(chǎn)生的重要細(xì)胞器，是缺血再灌注損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)，已經(jīng)成為心肌損傷的關(guān)鍵參與者和調(diào)節(jié)者[13]，主要表現(xiàn)為三磷酸腺苷合成減少、活性氧產(chǎn)生過(guò)多、Ca2+超載及心肌細(xì)胞的凋亡等，進(jìn)一步損傷線粒體及心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能[14]，也成為中醫(yī)藥治療的重要靶點(diǎn)[15-16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，八味沉香散能減輕大鼠心肌缺血再灌注引起的線粒體腫脹、空泡和結(jié)構(gòu)改變，說(shuō)明八味沉香散抗大鼠心肌缺血再灌注損傷作用可能是通過(guò)保護(hù)心肌線粒體而發(fā)揮的，但保護(hù)線粒體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。