中藥注射劑安全性及其無菌保障體系的現(xiàn)狀與思考

李 輝， 馬仕洪， 王 蘭， 田 斌， 繩金房

(1.陜西盛德泰林生物安全技術(shù)檢測(cè)有限公司，陜西 西安 710065；2.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021；3.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；4.陜西省藥品技術(shù)審評(píng)中心，陜西 西安 710065)

中藥注射劑在我國的研制及使用已有近八十年，是中國中藥現(xiàn)代化進(jìn)程中的一個(gè)重要里程碑[1]，其銷售總規(guī)模已達(dá)千億元[2]，是我國中成藥的特色品種。在中藥采購金額最高的品種中，80%是中藥注射劑[3]。截至2020年4月24日，我國共有一百三十多個(gè)品種949個(gè)批準(zhǔn)文號(hào)的中藥注射劑，涉及二百一十多家企業(yè)，分布于28個(gè)省份[2,4]，其中臨床常用的品種有30個(gè)左右[4]。魚腥草注射液、香丹注射液、柴胡注射液、丹參注射液的批準(zhǔn)文號(hào)較多，均超過50個(gè)，這4個(gè)品種僅占中藥注射劑品種的3%，批準(zhǔn)文號(hào)卻占中藥注射劑總批準(zhǔn)文號(hào)的35%。中藥注射劑作用迅速，生物利用度高，能夠解決中醫(yī)臨床沒有急癥用藥的痼疾[5]，尤其在我國抗擊新型冠狀病毒中，中藥注射劑以藥效迅速、作用可靠、使用范圍廣等優(yōu)勢(shì)發(fā)揮重要作用[6]。盡管如此，中藥注射劑依然存在基礎(chǔ)研究不充分，不良反應(yīng)頻發(fā)等問題，其安全性受到廣泛關(guān)注，制約中藥注射劑的發(fā)展，亟待研究引起中藥注射劑不良反應(yīng)的原因、物質(zhì)基礎(chǔ)、發(fā)生機(jī)制及質(zhì)量控制等，以提高中藥注射劑的安全性。

1 中藥注射劑的安全現(xiàn)狀及問題分析

中藥注射劑的安全性是制約其發(fā)展的重點(diǎn)和難點(diǎn)問題，而不良反應(yīng)是影響中藥注射劑安全性的主要因素。引起中藥注射劑不良反應(yīng)的原因較多，主要有基礎(chǔ)研究較為薄弱，特別是物質(zhì)基礎(chǔ)和臨床試驗(yàn)研究不充分、原料藥質(zhì)量可控性差、生產(chǎn)工藝及相關(guān)技術(shù)不完善、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量控制滯后、產(chǎn)品的再開發(fā)和再評(píng)價(jià)缺乏等[3-4,7-8]。不良反應(yīng)有過敏樣反應(yīng)(類過敏反應(yīng))、刺激反應(yīng)、熱原反應(yīng)等[9]，其中類過敏反應(yīng)約占77%，主要表現(xiàn)在皮膚、消化、呼吸、神經(jīng)、心血管等系統(tǒng)[5]。類過敏反應(yīng)的過敏原具有多成分多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，研究尚不充分[1,5,10-14]，其中動(dòng)植物蛋白、鞣質(zhì)、雜質(zhì)等極易作為致敏原引起過敏反應(yīng)[15]。此外，經(jīng)滅菌后的殘留菌體及代謝產(chǎn)物也可能成為過敏原。

中藥注射劑全生命周期安全性包括中藥注射劑從研發(fā)、生產(chǎn)、流通到臨床使用整個(gè)過程的安全問題，而生產(chǎn)階段是影響中藥注射劑安全性的主要方面。中藥注射劑全生命周期安全性影響因素見圖1，分析和控制關(guān)鍵環(huán)節(jié)，減少過敏原的引入和形成對(duì)于保障中藥注射劑的安全性具有重要意義。

1.1 研發(fā)階段 “質(zhì)量源于設(shè)計(jì)”(QbD)理念已被業(yè)界廣泛接受，中藥注射劑新藥應(yīng)在研發(fā)階段盡可能明確不良反應(yīng)，設(shè)計(jì)開發(fā)出安全性高，質(zhì)量可靠的新藥。已上市品種，由于歷史原因，部分中藥注射劑物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，藥理學(xué)、藥動(dòng)學(xué)及不良反應(yīng)原因和機(jī)制研究不深入，缺乏系統(tǒng)的臨床研究[16]，大部分品種仍停留在藥效評(píng)價(jià)水平，難以進(jìn)行質(zhì)量控制[17]。因此，對(duì)已上市中藥注射劑品種進(jìn)行再評(píng)價(jià)乃至二次開發(fā)實(shí)屬必要。以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)為核心的中藥注射劑作用機(jī)制研究[17]等思路的提出，有助于逐漸明確中藥注射劑的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，存精去雜，設(shè)計(jì)和優(yōu)化中藥注射劑處方，從根本上減少毒副作用，提高安全性。在生產(chǎn)工藝設(shè)計(jì)和選擇的各環(huán)節(jié)，應(yīng)考慮引入微生物的風(fēng)險(xiǎn)，可以考慮采用藥液過濾、藥液存放時(shí)限控制等方法來降低注射劑滅菌前的生物負(fù)載。

1.2 生產(chǎn)階段 生產(chǎn)階段是影響中藥注射劑安全性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，涉及到多個(gè)工藝單元，主要包括提取、過濾、濃縮、醇沉、吸附、洗脫、收膏、干燥、配液、滅菌、灌裝等[18]，而生產(chǎn)階段的原輔料質(zhì)量、生產(chǎn)工藝、執(zhí)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、偏差調(diào)查以及采取的糾正與預(yù)防措施等都會(huì)影響到安全性，從原輔料、滅菌工藝、加工環(huán)節(jié)等多個(gè)環(huán)節(jié)降低蛋白質(zhì)大分子、熱原、毒素、雜質(zhì)等的引入，是降低過敏原的有效途徑。

1.2.1 原輔料質(zhì)量 原輔料中的大分子可能引起不良反應(yīng)，其主要來源可分為內(nèi)源性和外源性。內(nèi)源性雜質(zhì)來自于藥材中的核酸、蛋白質(zhì)、多糖、樹脂、鞣質(zhì)等；外源性的雜質(zhì)來自微生物污染和人為添加的輔料如聚山梨酯80[19]，將魚腥草注射液中聚山梨酯80更換為注射級(jí)別并降低濃度可降低類過敏反應(yīng)[20]。長期以來忽視的中藥原料微生物污染問題可能導(dǎo)致殘留菌體及代謝產(chǎn)物通過原料環(huán)節(jié)引入中藥注射劑，引起不良反應(yīng)。

1.2.2 生產(chǎn)工藝 中藥注射劑的劑型較新但技術(shù)含量略低，在制備工藝方面也存在問題[21]。中藥注射劑普遍采用水醇法、醇水法、水蒸氣蒸餾法等工藝制備，雖經(jīng)大孔樹脂吸附、活性炭吸附、膜過濾等工藝精制，但都無法將色素、鞣質(zhì)、樹脂及其他大分子雜質(zhì)充分去除[13,22-23]。工藝中的包裝材料及生產(chǎn)過程潔凈度不合格，也易導(dǎo)致中藥注射劑中引入異物、纖維等未濾除的物質(zhì)，引起不良反應(yīng)[7]。滅菌工藝中常用的濕熱滅菌可能影響制劑有效成分，而且可能改變其pH值、澄明度，從而影響藥物的質(zhì)量及用藥安全[24]，工藝的不完善可能是中藥注射劑在臨床上引起類過敏反應(yīng)最根本原因[13]。生產(chǎn)工藝特別是滅菌工藝的選擇是生產(chǎn)階段保障中藥注射劑安全性的重要方面，應(yīng)根據(jù)滅菌工藝選擇的決策樹確定適合的滅菌工藝。

1.2.3 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 無菌檢查是反映注射劑無菌性的關(guān)鍵指標(biāo)，是中藥注射劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要組成部分。由于污染微生物具有隨機(jī)性和不均一性的分布特點(diǎn)，而無菌檢查法是基于概率的方法，自身存在局限性，更應(yīng)注重方法的適用性。理化標(biāo)準(zhǔn)方面，采用指紋圖譜等質(zhì)量控制方法，可較為全面的評(píng)價(jià)中藥注射劑的安全性[25-27]，完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于保障其安全性具有重要意義。

1.3 流通階段 在流通階段中藥注射劑的安全性也不能忽視，主要涉及運(yùn)輸、儲(chǔ)藏等環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制。中藥制劑的運(yùn)輸要根據(jù)劑型的特點(diǎn)，避免光照、潮濕等不利因素，減少不良反應(yīng)[21]。如刺五加事件就是由于雨水浸泡導(dǎo)致藥品污染經(jīng)銷商更換標(biāo)簽[28]，即為流通階段控制不嚴(yán)導(dǎo)致的安全性問題。

1.4 使用階段 在臨床使用階段尚存在說明書對(duì)臨床用藥指導(dǎo)不足和臨床應(yīng)用環(huán)節(jié)不合理等問題[29]。例如超說明書使用問題主要表現(xiàn)為超溶媒、超單次劑量、超療程、超適應(yīng)癥[30]，臨床使用環(huán)節(jié)溶媒的種類、溫度、pH值、溶解度的改變等[31]，合并用藥的數(shù)量[32]等因素都可能引起不良反應(yīng)。此外，使用環(huán)節(jié)的環(huán)境衛(wèi)生不良、消毒不當(dāng)、操作失誤都有是可能引入微生物的風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)，應(yīng)予以重視。

2 中藥注射劑安全問題的微生物學(xué)思考

微生物控制對(duì)于中藥注射劑的安全性至關(guān)重要，主要體現(xiàn)在微生物導(dǎo)致的內(nèi)源性雜質(zhì)和外源性污染。一方面，在生產(chǎn)階段，原輔料生物負(fù)載超標(biāo)、人員造成的污染、滅菌工藝不完善、環(huán)境監(jiān)控不充分、設(shè)備實(shí)施運(yùn)轉(zhuǎn)不良、質(zhì)量管理體系不完善等都可能導(dǎo)致內(nèi)源性雜質(zhì)及毒素升高，存在潛在風(fēng)險(xiǎn)，見圖2；另一方面，微生物污染作為外源性污染的關(guān)鍵，是注射劑臨床不良反應(yīng)發(fā)生的原因之一[33]，直接影響中藥注射劑的安全性。

2.1 源頭控制 中藥注射劑以中藥飲片提取物為原料，而中藥飲片微生物污染嚴(yán)重[34-35]，長期以來原輔料的生物負(fù)載問題未引起足夠重視，盡管經(jīng)過精制、除雜、滅菌等工藝，依然無法保證完全去除由微生物引入的毒素等大分子物質(zhì)，推測(cè)其在一定程度上影響中藥注射劑的安全性。

2.2 過程控制 注射劑生產(chǎn)過程控制包括過程分析技術(shù)(PAT)和無菌保障體系等方面。藥品生產(chǎn)PAT是實(shí)現(xiàn)QbD理念的有效工具[36]，采用PAT可及時(shí)測(cè)定原料、過程中物料及生產(chǎn)過程的關(guān)鍵質(zhì)量及性能指標(biāo)[37]，以實(shí)現(xiàn)對(duì)藥品生產(chǎn)的全過程控制。然而，在配液、過濾、滅菌等關(guān)鍵步驟中，還沒有中藥注射液引入PAT對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控與控制[18]，在控制理念和技術(shù)上與化學(xué)藥品注射劑控制還存在一定差距。中藥原輔料及生產(chǎn)過程引入的潛在微生物及其代謝產(chǎn)物可能引入熱原及過敏原。注射劑生產(chǎn)中的微生物控制即無菌保障體系對(duì)于其安全性至關(guān)重要，無菌制劑生產(chǎn)過程中，滅菌、無菌操作、除菌過濾等生產(chǎn)步驟是關(guān)鍵工藝控制點(diǎn)[38]，然而無菌保障體系在潔凈度監(jiān)測(cè)、設(shè)施設(shè)備、除菌工藝等方面存在問題[39]。此外，中藥注射劑大分子雜質(zhì)難以界定，由滅菌工藝產(chǎn)生的雜質(zhì)缺乏深入考察，也可能引起不良反應(yīng)。

2.3 終端檢查 注射劑的終端檢查通常執(zhí)行無菌檢查，而無菌檢查具有取樣數(shù)量有限、培養(yǎng)條件有限、可能存在不可培養(yǎng)微生物、偏差調(diào)查困難等局限性。對(duì)于中藥注射劑，絕大多數(shù)的單方或復(fù)方注射劑均有較深的顏色，如棕色、棕黃或棕紅色[40]，較深的顏色也會(huì)影響無菌檢查的結(jié)果觀察，對(duì)結(jié)果判定造成潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，中藥注射劑的微生物安全不能僅依賴于無菌檢查[41]，而應(yīng)通過無菌保障體系，全面控制微生物污染及其代謝產(chǎn)物對(duì)中藥注射劑安全性的影響。

3 中藥注射劑的無菌保障體系思考

無菌保障體系的建立和運(yùn)行可減少生產(chǎn)過程中熱原、毒素等微生物及其代謝物相關(guān)大分子的引入，減少和控制滅菌過程中雜質(zhì)的形成以及提高生產(chǎn)過程中微生物的控制水平。無菌保障體系并非一個(gè)技術(shù)在一個(gè)環(huán)節(jié)中的應(yīng)用，而是微生物檢測(cè)與控制技術(shù)群在中藥注射劑生產(chǎn)全過程中的應(yīng)用，從源頭、過程、終端等方面全面減少微生物對(duì)中藥注射劑安全性產(chǎn)生的影響，是從根本上提高中藥注射劑的安全性的思路和方法。

3.1 原輔料微生物控制，從源頭減少熱原和毒素的引入 嚴(yán)格的無菌保障體系，是控制熱原的有效途徑[42]。盡管加熱、輻照等方法能夠有效殺滅中藥原料藥的負(fù)載微生物，但是已殺滅微生物及其代謝產(chǎn)物難以從原料藥中完全除去，從而影響安全性。魚腥草是魚腥草注射液的主要原料，調(diào)查顯示魚腥草微生物負(fù)載較高，即使經(jīng)加熱炮制處理，仍有大量殘留微生物存活[43]，生物負(fù)載及其代謝產(chǎn)物的大量存在導(dǎo)致除雜困難，影響魚腥草注射劑的安全性。因此，利用無菌保障體系等新技術(shù)、新理念加強(qiáng)中藥原輔料的源頭控制，可減少熱原及毒素引入中藥注射劑。

3.2 滅菌工藝優(yōu)化，減少雜質(zhì)的形成和有效成分的降解 滅菌工藝是無菌保障體系關(guān)注的主要內(nèi)容之一，在中藥注射劑的生產(chǎn)階段選擇滅菌工藝條件時(shí)，應(yīng)采用指紋圖譜等指標(biāo)，全面考察滅菌工藝對(duì)注射劑質(zhì)量的影響[16]，同時(shí)采用生物指示劑驗(yàn)證滅菌工藝，研究雜質(zhì)譜的變化規(guī)律，評(píng)估其對(duì)安全性的影響，優(yōu)化滅菌工藝，降低工藝過程對(duì)安全性的影響。注射劑滅菌工藝的選擇原則是既要能殺滅制劑中的微生物，以保證患者用藥的安全性，又要避免制劑中原輔料性質(zhì)的變化，以免影響藥品的藥效和安全性[44]。在對(duì)甘草酸二銨磷脂復(fù)合物注射劑滅菌工藝的研究中發(fā)現(xiàn)，采用流通蒸汽和高壓滅菌法時(shí)對(duì)含量、過氧化值、粒徑等指標(biāo)均無明顯影響，而輻射滅菌可導(dǎo)致含量下降、過氧化值升高[45]。在對(duì)丹紅注射劑的研究中發(fā)現(xiàn)，有效成分丹酚酸B、紫草酸和丹酚酸A的水溶液穩(wěn)定性較差，在高溫、pH值大于5的情況下降解迅速[46]。在對(duì)三七的滅菌工藝研究中發(fā)現(xiàn)，高壓蒸汽滅菌會(huì)破壞三七皂苷R1等皂苷成分，導(dǎo)致活性成分含量下降[47]。此外，中藥注射劑色差與滅菌工藝密切相關(guān)[23]，中藥顏色變化反映其內(nèi)在物質(zhì)(雜質(zhì))的變化，對(duì)于該類變化應(yīng)充分研究滅菌工藝對(duì)雜質(zhì)形成影響。目前，對(duì)于中藥注射劑滅菌工藝中雜質(zhì)譜的研究還是薄弱環(huán)節(jié)，因此，應(yīng)重視滅菌工藝對(duì)中藥注射劑安全性的影響，如在涉及到加熱、高溫滅菌工藝時(shí)，應(yīng)充分考慮有效成分降解和雜質(zhì)譜變化。

3.3 生產(chǎn)過程微生物控制，減少熱原的引入 中藥注射劑生產(chǎn)過程中的原料、輔料、溶媒、容器具等由于各種原因均有可能被微生物污染，從而使得中藥注射劑更容易產(chǎn)生熱原[42]。近年來，制藥環(huán)境的微生物監(jiān)測(cè)取得了較大發(fā)展，傅里葉變換紅外光譜技術(shù)、基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜、16S rRNA核酸測(cè)序、RiboPrinter核糖體分型技術(shù)等鑒定和分析技術(shù)廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)，無菌保障體系的保障能力獲得進(jìn)一步加強(qiáng)，為中藥注射劑生產(chǎn)過程的微生物控制提供了可能，通過這些技術(shù)的應(yīng)用，可加強(qiáng)生產(chǎn)過程的微生物控制，降低微生物及熱原引入風(fēng)險(xiǎn)。

3.4 無菌保障體系整體控制，保證藥品的無菌性 中藥注射劑的無菌檢查法在培養(yǎng)體系、不可培養(yǎng)微生物、時(shí)間長、概率事件等方面存在缺陷，不能僅依賴無菌檢查保證藥品的無菌性，而是要通過無菌保障體系全面保證藥品無菌性，提高安全性。中藥注射劑的無菌性不僅需要無菌檢查的判定，而且需要無菌保障體系的評(píng)估。無菌保障體系的評(píng)估通常包括原輔料、包材和中間過程產(chǎn)品微生物載荷的控制，對(duì)水系統(tǒng)和生產(chǎn)環(huán)境的監(jiān)測(cè)，對(duì)除菌/滅菌工藝的驗(yàn)證，無菌檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室及相關(guān)SOP的合理性，以及OOS調(diào)查程序等[48]。樣品質(zhì)量是否符合放行標(biāo)準(zhǔn)并不是產(chǎn)品合格的唯一的判定依據(jù)[8]，要結(jié)合生產(chǎn)過程的合規(guī)性，無菌保障體系的有效性等綜合判斷。

4 中藥注射劑安全性展望

隨著理念的更新、技術(shù)的進(jìn)步、標(biāo)準(zhǔn)的提高，中藥注射劑的安全性將逐步由關(guān)鍵環(huán)節(jié)的關(guān)鍵參數(shù)控制轉(zhuǎn)變?yōu)槿芷谫|(zhì)量控制。無菌保障體系是中藥注射劑安全性的關(guān)鍵影響因素，而長期以來對(duì)該問題的重視不夠，特別是原輔料微生物負(fù)載的控制，滅菌工藝的驗(yàn)證，生產(chǎn)環(huán)境的微生物監(jiān)控等無菌保障策略對(duì)中藥注射劑安全性的影響研究較少。藥品微生物控制防線從終端檢驗(yàn)推向過程分析和源頭控制是我國藥品微生物控制發(fā)展的必然趨勢(shì)[49]，而無菌保障體系是實(shí)現(xiàn)中藥注射劑微生物源頭和過程控制的重要途徑。控制藥品雜質(zhì)譜是提升藥品安全性的關(guān)鍵，而雜質(zhì)界定是雜質(zhì)譜控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[50]，引起中藥注射劑安全性問題的大分子雜質(zhì)來源主要有微生物污染、藥材原生代謝物和輔料[22]等，由于中藥注射劑雜質(zhì)的界定困難，雜質(zhì)譜的控制難度較大，而微生物來源的雜質(zhì)控制卻可一定程度通過無菌保障體系實(shí)現(xiàn)。中藥注射劑的無菌保障體系可從控制微生物污染和降低大分子雜質(zhì)等方面提高質(zhì)量保障水平，為提高中藥注射劑安全性提供新思路。