阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究進展

孫琦月

江蘇護理職業(yè)學院，江蘇省淮安市 213001

阿爾茨海默氏病(AD)是最常見的神經(jīng)退行性疾病，患者的表現(xiàn)往往是以認知功能的減退為主，導致嚴重癡呆。超過95%的AD病例是晚期的，最大的危險因素是高齡，其他危險因素包括APOE4等位基因突變、心血管疾病危險因素、炎癥和創(chuàng)傷性腦損傷[1]。AD分為家族性AD和散發(fā)性AD。散發(fā)性AD 占大多數(shù)，但目前發(fā)現(xiàn)與散發(fā)型AD相關(guān)的基因僅載脂蛋白E(Apolipoprotein E，APOE)。家族性AD占AD發(fā)病總?cè)藬?shù)的5%左右[2]。關(guān)于AD發(fā)病的具體機制尚未有明確報道，只是提出一些假說，基于這些假說，建立多種動物模型，如慢性缺血性癡呆模型、Aβ腦內(nèi)注射模型、鋁元素中毒模型等，但這些模型模擬AD發(fā)病過程過于局限并不全面。轉(zhuǎn)基因小鼠成為目前臨床藥物研究中較多使用的一種動物模型，因為其有明確的致病因素，并且行為學和病理學均有明顯的可檢測的缺陷[3]。關(guān)于轉(zhuǎn)基因小鼠，目前可分為兩個大類，一種是表達突變基因，另一種是有無效基因的基因敲除鼠。本文就轉(zhuǎn)基因小鼠的理論基礎(chǔ)、評價做進一步介紹，但對基因敲除鼠暫不介紹。

AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型基于AD病理學改變，其特征性病變是細胞外Aβ沉積形成的老年斑(Senile plaque, SP)、細胞內(nèi)的Tau蛋白過度磷酸化導致的神經(jīng)纖維纏結(jié)(Neurofibrillary tangles, NFTs)，晚期AD患者的大腦因大面積萎縮而細胞丟失。目前的說法認為Aβ的大量沉積是引起AD原因之一，其中淀粉樣前體蛋白(APP)和早老素1、2(PS1，PS2)的突變會導致Aβ的沉積。APP蛋白是一種跨膜運輸?shù)牡鞍?，在神?jīng)元的細胞膜外,在APP基因中發(fā)現(xiàn)了第一個導致AD的基因突變。APP被α，β，γ裂解酶裂解，正常情況下生成Aβ，突變的APP基因有利于β，γ裂解酶對APP的水解加工，使Aβ生成與代謝失衡，促進Aβ的聚集[1]。早老素1、2的突變導致APP中γ-斷裂的移位，產(chǎn)生更多的淀粉樣蛋白Aβ42，腦中Aβ42/Aβ40的比例增高[4]?；谝陨现虏』?，以及典型的AD病理學特征，臨床上制備了大量的轉(zhuǎn)基因小鼠，以供AD的研究，根據(jù)小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)入的基因種類，可分為單轉(zhuǎn)基因鼠和多轉(zhuǎn)基因鼠。

1 單轉(zhuǎn)基因鼠

臨床上AD的單轉(zhuǎn)基因鼠包括單轉(zhuǎn)APP鼠、單轉(zhuǎn)PS鼠以及Tau蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠，而APOE小鼠大多是基因敲除鼠，這里不予論述。因轉(zhuǎn)入的基因帶有不同的突變位點，上述單轉(zhuǎn)基因鼠又分為不同的品系。

1.1 單轉(zhuǎn)APP鼠 現(xiàn)APP基因中發(fā)現(xiàn)20多個突變基因，其中一些被廣泛用于轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建。其中較多使用的單轉(zhuǎn)APP轉(zhuǎn)基因小鼠有APPV717I轉(zhuǎn)基因小鼠、Tg2576小鼠、APP23轉(zhuǎn)基因小鼠等。(1)隨著對AD病因的研究發(fā)現(xiàn)，性別是影響AD的重要因素之一，其中APPV717I轉(zhuǎn)基因小鼠隨年齡和性別有明顯的行為差異，提示APPV717I轉(zhuǎn)基因小鼠可能是研究AD性別差異的一個很好的候選小鼠。病理學方面，一些研究表明生命后期的APPV717I小鼠腦中有淀粉樣斑塊；行為學方面顯示，相同月齡小鼠在運動能力方面無明顯差異，6月齡時雄性小鼠有較明顯的焦慮；記憶方面顯示10月齡時出現(xiàn)損傷。該小鼠是研究AD性別差異的一個很好的候選[5]。(2)在APP轉(zhuǎn)基因鼠中，有一部分轉(zhuǎn)基因鼠過表達APP(APPswe)的瑞典雙突變(K670N/M671L)，Tg2576小鼠作為其中一種較多被使用，Tg2576小鼠4～5個月時明顯檢測到Aβ，6個月初步表現(xiàn)出老年癡呆的癥狀，但并未觀察到Aβ斑塊，屬AD發(fā)病早期，Aβ沉積、記憶缺損出現(xiàn)在10～12個月時,11～13個月時腦內(nèi)Aβ1～42/43的數(shù)量升高明顯，15～18個月出現(xiàn)突觸的丟失，屬于阿爾茨海默病發(fā)病末期[6-7]，Tg2576小鼠在受影響的腦區(qū)內(nèi)沒有表現(xiàn)出任何顯著的神經(jīng)元丟失，但最近的研究顯示，15～18個月的Tg2576小鼠在電鏡水平下可觀察到內(nèi)嗅皮質(zhì)的突觸密度顯著降低，此外，突觸密度的降低與Aβ斑塊的鄰近程度相關(guān)[8]。該鼠在飼養(yǎng)中性格較為暴躁，較難對其進行群居性研究。(3)另一個APP雙突變基因鼠APP23，與Tg2576不同，它是利用較長的751種氨基酸形式的APP，表達通過小鼠THY-1.2啟動子驅(qū)動，APP23 轉(zhuǎn)基因小鼠 6月齡時皮質(zhì)和海馬區(qū)開始出現(xiàn) Aβ 沉積，并隨月齡增加而逐漸沉積；老年斑在8～9月齡時可檢測到[9]，14～18月齡時，海馬CA1區(qū)的神經(jīng)細胞出現(xiàn)丟失，這與Tg2576不同。24月齡出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。此模型較好地模擬了AD患者老年斑形成的病理性發(fā)展。也是唯一一個報道有神經(jīng)元丟失的APP小鼠模型。

除此之外還有J20小鼠、APP22小鼠、TgCRND8小鼠模型，轉(zhuǎn)入的APP基因帶有兩種突變，此類型轉(zhuǎn)基因鼠只能模仿AD的部分病理特征，臨床上不被廣泛使用，且相關(guān)的報道有限。APP轉(zhuǎn)基因鼠模擬了AD患者的腦內(nèi)Aβ沉積和SP形成，主要用于研究APP、Aβ與AD的發(fā)病關(guān)系及臨床藥效學評價。但是該類小鼠模型卻存在一些缺陷，如該類小鼠腦內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)Tau蛋白的過度磷酸化、NFTs，APP轉(zhuǎn)基因小鼠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中沒有發(fā)現(xiàn)廣泛的神經(jīng)元死亡，這可能是因為AD患者的病變時間較漫長，而該轉(zhuǎn)基因小鼠的壽命過短[10]。目前APP轉(zhuǎn)基因鼠通過與其他致AD基因的轉(zhuǎn)基因鼠雜交從而產(chǎn)生多轉(zhuǎn)基因鼠，可以更全面顯示出AD的病理及行為學變化。

1.2 單轉(zhuǎn)PS小鼠 早老素的突變也導致FAD，迄今已鑒定出近200個突變，突變的基因有兩種即PS1和PS2。突變導致了APP水解過程中γ-斷裂的移位，使得Aβ42的增加，腦中Aβ42/Aβ40的比例增高。目前研究者已經(jīng)建立了多種突變體PS1或PS2轉(zhuǎn)基因小鼠。理想的動物模型要表現(xiàn)出AD典型的病理特征和行為特征。但PS轉(zhuǎn)基因小鼠的大腦中沒有發(fā)現(xiàn)斑塊的產(chǎn)生，并且其行為學方面的改變也并未觀察到。這可能是人與小鼠之間Aβ序列不同導致聚集的傾向降低的結(jié)果[4]。

在眾多PS轉(zhuǎn)基因小鼠中，PS1M146L小鼠是經(jīng)典的PS1轉(zhuǎn)基因鼠，29月齡可見較多 Aβ42，小鼠此時表現(xiàn)出線粒體活性的變化等，其行為學改變及病理變化未見報道。而其他品系的小鼠PSEN1(P117L)(line 13)與PSEN1-YAC(line G9)小鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)Aβ42增高，但仍未發(fā)現(xiàn)Aβ沉積等病理變化以及行為學改變[8]。PS-21在子代小鼠體內(nèi)可有Aβ增多，但未沉積。可進行抑制β-淀粉樣蛋白產(chǎn)生方面的研究[11]，關(guān)于此類型的小鼠模型文獻報道有限。

因此研究者們在PS1小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)入其他突變致病基因(如APP基因、Tau蛋白相關(guān)等)從而建立雙轉(zhuǎn)基因鼠和多轉(zhuǎn)基因鼠。此時驚喜地發(fā)現(xiàn)此類小鼠可以模擬部分AD的病理學及行為學特征。單獨表達PS1/PS2基因的小鼠雖然會出現(xiàn)某些病理改變，但行為損害程度較輕微[12]，且在模仿AD 的病理變化方面表現(xiàn)過于片面，所以多用于與其他轉(zhuǎn)基因鼠雜交產(chǎn)生多轉(zhuǎn)基因小鼠。

1.3 Tau蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型 有毒蛋白Tau是AD腦中的一個重要生物學特征，Tau在大腦的位置和程度與AD認知癥狀相關(guān)，其產(chǎn)生Tau蛋白的微管相關(guān)蛋白基因的突變與Tau具有相關(guān)性。Tau蛋白的變性會形成有害的神經(jīng)纖維纏結(jié)，從而影響神經(jīng)元的活性[13]。

JNPL3轉(zhuǎn)基因小鼠的出現(xiàn)，證明了Tau 蛋白會對神經(jīng)元造成損害，引起細胞的丟失與行為的異常。病理學方面，6月齡時即可出現(xiàn)神經(jīng)元丟失，神經(jīng)纖維纏結(jié)出現(xiàn)在9月齡。行為學方面在10月齡表現(xiàn)出運動障礙，只有不到10%的動物未出現(xiàn)，但是不會出現(xiàn) Aβ淀粉樣斑塊和認知障礙[14]。JNPL3小鼠較多的被用于研究NFTs與AD發(fā)病之間的關(guān)系與機制。Tau基因有多種突變位點，其中P301L等位點的基因突變引起AD。目前已發(fā)現(xiàn)P301L的突變基因有30多種，其中 rTg4510 轉(zhuǎn)基因小鼠的病理表現(xiàn)較接近AD，病理學方面，2.5個月時，在新皮層和海馬CAI區(qū)開始出現(xiàn)NTF，4個月時，NFT數(shù)量逐漸累積，穩(wěn)定表達，5.5個月時，海馬CAI區(qū)的NFT出現(xiàn)丟失，8.5個月后NFT大量丟失。行為學方面，2.5個月時認知記憶功能出現(xiàn)障礙，并且隨著月齡逐漸加重，但在確定轉(zhuǎn)基因Tau蛋白抑制對神經(jīng)元丟失和腦萎縮的影響時發(fā)現(xiàn)，抑制TauP301L時，神經(jīng)元的丟失與腦重量減輕的現(xiàn)象同時得到抑制，但NFTs穩(wěn)定增高。且該模型的NFTs損失數(shù)量遠遠超過人類AD患者，這也是該模型的局限性[14]。Tau蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型可以很好地將神經(jīng)纖維纏結(jié)這種AD患者的病理表現(xiàn)模擬出來，并且出現(xiàn)行為學的改變，但是未發(fā)現(xiàn)Aβ沉積。因此，只能進行單一的Tau蛋白相關(guān)的研究[13]。

2 多轉(zhuǎn)基因鼠

為了更全面的模擬AD的病理學特征，臨床上在單轉(zhuǎn)基因鼠的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)入更多的致病基因，制備了雙轉(zhuǎn)基因鼠和三轉(zhuǎn)基因鼠，大大彌補了單轉(zhuǎn)基因小鼠在模擬AD病理變化上的不足，為臨床實驗與藥物研究提供了更好的動物模型。

2.1 雙轉(zhuǎn)基因鼠 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠：將APP與PS1兩個易感基因整合后制備的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠近年來較多的在國內(nèi)外實驗中使用。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠主要包括APPswe/PS1dE9、APPswe/PS1L166P、APPswe/PS1M146L等[15]。相比其他雙轉(zhuǎn)基因鼠，APPswe/PS1dE9小鼠出現(xiàn)較晚，但因其出現(xiàn)Aβ較早，并隨月齡增長而增加，在AD的防治研究中較多的被使用。有研究證明[16]，行為學方面，APPswe/PS1dE9小鼠隨月齡增加而出現(xiàn)運動障礙，7～8個月出現(xiàn)學習障礙和認知功能損傷。在病理學方面，6周在大腦皮層發(fā)現(xiàn)Aβ沉淀，3～6個月在海馬皮層和紋狀體、丘腦上出現(xiàn)Aβ沉積，大約在4～5個月Aβ會表達在腦干上，Tau磷酸化和神經(jīng)炎表現(xiàn)，NFTs沒有觀測到。APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠早期即出現(xiàn)Aβ的沉積，并且與月齡的增長呈現(xiàn)正相關(guān)，大月齡的小鼠在行為學方面與病理學方面均有明顯改變，與AD患者的疾病變化相類似，因此是較理想的模型，廣泛應(yīng)用于AD的防治研究中[17]。

最近的一種被稱為TGF 344 AD大鼠的AD動物模型，是通過向大鼠原核注射“瑞典”突變體人淀粉樣前體蛋白(APPsw)和Δ外顯子9突變體人早老素-1(PS1ΔE9)而發(fā)育的。較好地模擬了AD早期空間導航功能障礙的問題，這可能是臨床前阿爾茨海默病的一個決定性行為標志。病理學方面顯示出特征性斑塊形成、內(nèi)源性纏結(jié)發(fā)病機制以及神經(jīng)炎癥、神經(jīng)血管功能障礙和細胞丟失[18]。行為學方面的表現(xiàn)主要體現(xiàn)在10～11個月時出現(xiàn)明顯的空間導航障礙。該模型為闡明AD空間定向障礙的神經(jīng)生物學機制提供了實質(zhì)性的希望[19]。

5× FAD模型：即APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶三個APP突變體及兩個PS1突變體，同時表達5種FAD突變。在認知功能方面，表現(xiàn)出多種類型的認知功能紊亂，更加接近于臨床上AD患者出現(xiàn)的多種認知功能下降的表現(xiàn)；在神經(jīng)病理學方面，此類型轉(zhuǎn)基因鼠的Aβ42沉積速度非?？欤?月齡左右時即可觀測到，2月齡時Aβ沉積已很明顯，尤其是在下托和深皮質(zhì)層。神經(jīng)膠質(zhì)過多癥也在2個月左右出現(xiàn)，4個月左右，突觸丟失及行為和記憶損害，神經(jīng)元丟失發(fā)生在9月齡，位置在Aβ沉積區(qū)[10]。該模型未觀察到神經(jīng)纖維。此模型的優(yōu)點在于對AD患者臨床病理特征的模擬較好，并且可以在較短的時間里產(chǎn)生大量的Aβ1～42，是適合研究神經(jīng)元內(nèi) Aβ42 誘導的神經(jīng)元退化和斑塊形成的動物模型。雖然研究5×FAD轉(zhuǎn)基因動物模型較晚，但國外的一些研究團隊已經(jīng)將5×FAD轉(zhuǎn)基因小鼠作為動物模型進行初步的藥物研究[20-21]。

TAPP雙轉(zhuǎn)基因小鼠在行為學的發(fā)病方式及出現(xiàn)時間方面同JNPL3轉(zhuǎn)基因小鼠相似，在病理學方面，可以同時出現(xiàn)Aβ沉積和NFTs，Aβ的變化與Tg2576 轉(zhuǎn)基因小鼠相似，可觀測到大量NFTs[13]，此種模型小鼠首次出現(xiàn)了AD兩大病理征，但是關(guān)于該型鼠的文獻并不多見。

2.2 多重轉(zhuǎn)基因模型 目前國際上已經(jīng)制備了APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因小鼠，攜帶有PS1M146V基因、APPSwe基因和TauP301L基因。祝艷秋等人的研究發(fā)現(xiàn)，4月齡時出現(xiàn)記憶功能障礙、晝夜節(jié)律紊亂的變化。6月齡時海馬 CA1、額葉和皮質(zhì)出現(xiàn)Aβ沉積，H2O2產(chǎn)物明顯增高，并出現(xiàn)短期記憶功能障礙及氧化應(yīng)激。其中Aβ的出現(xiàn)與月齡有較大的相關(guān)性，12月齡其皮質(zhì)、海馬區(qū)Aβ 沉積明顯，出現(xiàn)NFT，先海馬后皮質(zhì)。15月齡后皮質(zhì)區(qū) Aβ沉積明顯Tau 蛋白高度磷酸化，首現(xiàn) PHFs。在對比不同實驗室中的APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)現(xiàn)，其腦內(nèi)的病理變化存在差異性，在對比了雌性和雄性轉(zhuǎn)基因鼠的病理變化可以看出，雌性小鼠的病理變化更加明顯[22]?；诖丝梢园l(fā)現(xiàn)，該型小鼠有較大的性別差異性，可以進行性別相關(guān)的研究，其具體的病理表現(xiàn)會存在不同實驗室之間的差異性，因此在選擇該型小鼠進行實驗時，要對小鼠的月齡、性別、繁殖、品系以及居住條件等問題嚴格把關(guān)[23]。

三轉(zhuǎn)基因鼠能模擬較為復雜的AD病理變化，但是存在許多問題，如成膜周期較長、造價昂貴、基因表達不穩(wěn)定等，因此在使用該型小鼠時，要嚴格注意其月齡、性別、飼養(yǎng)方式等帶來的行為學以及病理學的差異性。

3 討論

AD的病因復雜且多樣，這在一定程度上限制了對于AD治療的研究。為了可以研究出有效的防治手段，亟須建立較為理想的動物模型。研究認為，理想的AD動物模型除了具備AD的典型病理學、行為學特征，如神經(jīng)元死亡、突觸丟失、記憶認知功能障礙等之外，AD患者還具有氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、小膠質(zhì)細胞激活等病理特征，轉(zhuǎn)基因小鼠可以對遺傳性AD進行較好的研究，但遺傳性AD占比不足10%，因此不具有典型的AD代表性，并且，轉(zhuǎn)基因模型只能表現(xiàn)AD的部分病理特征，并且受到經(jīng)濟、實用性等因素的限制。盡管現(xiàn)在的AD動物模型并不完善，隨著研究的深入，終將建立理想的AD模型，加速對AD病因病機及治療的研究進程。