金銀花色澤與酚酸類成分含量相關(guān)性研究

熊樂文， 金 瑩， 黃瑋慕， 王彥予， 黃文靜， 張永清， 趙宏偉， 張龍?chǎng)?/p>

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

金銀花具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱等功效，對(duì)治療外感風(fēng)熱、溫病發(fā)熱等感染性疾病療效顯著[1-3]。由于金銀花藥材市場(chǎng)需求量大，目前主要依靠人工栽培滿足需要，全國(guó)大部分省市均有種植。不同產(chǎn)區(qū)由于生態(tài)環(huán)境、采收時(shí)間與干燥方法等差異，致使金銀花藥材外觀及活性成分含量明顯不同[4-5]。如何科學(xué)合理地評(píng)價(jià)金銀花藥材質(zhì)量，是業(yè)內(nèi)近年研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[6-8]。早期人們利用眼看、手摸、鼻聞、口嘗等傳統(tǒng)方法，通過觀察外形、色澤、大小、斷面等來評(píng)判藥材質(zhì)量，并依此“辯狀論質(zhì)”“分級(jí)歸檔”[9-10]。《中國(guó)藥典》從2000年版開始對(duì)金銀花成分含量進(jìn)行限定，要求綠原酸含量不得少于1.5%[11]；2005年版增加木犀草苷，要求其含量不得少于0.10%[12]，2010年版修改為不得少于0.050%[13]；2020年版增加綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C，要求不得少于3.8%[1]。

藥材外觀性狀是其內(nèi)部物質(zhì)組成的外在反映，活性成分是藥材物質(zhì)組成的一部分，藥材外觀性狀與活性成分之間可能存在一定的相關(guān)性。熊吟等[14]發(fā)現(xiàn)金銀花的顏色主要與含有的總黃酮含量有關(guān)，王玲娜[15]、馬云等[16]研究證明金銀花的顏色與活性成分含量密切相關(guān)，周潔等[17]研究結(jié)果顯示金銀花的褐變程度與綠原酸、木犀草苷含量呈顯著負(fù)相關(guān)，均證明金銀花藥材顏色與活性成分含量之間具有密切的相關(guān)性。本研究中收集金銀花藥材樣品60份，利用色差儀測(cè)定其顏色指標(biāo)，對(duì)綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C進(jìn)行含量測(cè)定，分析探討金銀花藥材色澤與其酚酸類質(zhì)控成分含量之間的相關(guān)性，為明確依據(jù)外觀性狀評(píng)判藥材質(zhì)量的科學(xué)性及根據(jù)藥材色澤預(yù)測(cè)金銀花酚酸類成分含量提供參考。

1 材料

CM-600d1型色差儀(杭州柯盛行儀器有限公司)；1260高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；KQ-500DE型超聲儀(河南兄弟儀器設(shè)備有限公司)；ME204/02型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；四號(hào)藥典篩(紹興市上虞張興紗篩廠)。

綠原酸(批號(hào)Y22M8K36544，純度≥98%)、異綠原酸A(批號(hào)Z05M10X87215，純度≥98%)、異綠原酸C(批號(hào)Y03S10H95976，純度≥98%)對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司)。乙腈、甲醇、磷酸(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

金銀花藥材由山東中平藥業(yè)有限公司收集，共60批，編號(hào)為1～60，取自全國(guó)不同產(chǎn)區(qū)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)張永清教授鑒定，均為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花。

2 方法

2.1 顏色測(cè)定

2.1.1 掃描條件 將金銀花藥材粉碎后過四號(hào)藥典篩，四分法取樣，備用。測(cè)量條件光源為D65，觀察角度為10°，照明口徑Ф50 mm，波長(zhǎng)掃描范圍為780～380 nm，掃描速度為600 nm/min。將金銀花藥材粉末均勻平鋪于色差儀粉末測(cè)試盒內(nèi)，平行測(cè)定10次，取平均值。

2.1.2 精密度試驗(yàn) 取同一供試品粉末，連續(xù)測(cè)量10次，分別得出表征顏色的L*、a*、b*值，RSD分別為1.54%、1.72%、1.12%，表明色差儀精密度良好。

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品粉末5份，每份樣品平行測(cè)定10次取平均值，L*、a*、b*值的RSD分別為1.77%、1.92%、1.38%，表明重復(fù)性良好。

2.2 綠原酸和總酚酸含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Syncronis C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相0.1%磷酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～8 min，14%～19%B；8～14 min，19%B；14～34 min，19%～31%B；34～35 min，31%～90%B)；檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm；體積流量0.7 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；柱溫24 ℃。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C對(duì)照品適量，用75%甲醇溶解得質(zhì)量濃度分別為0.40、0.20、0.04 mg/mL混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 取藥材粉末約0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加75%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 取混合對(duì)照品溶液，稀釋后得混合對(duì)照品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣，測(cè)定綠原酸、異綠原酸A及異綠原酸C峰面積，以質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y綠原酸=8 830.4X-69.439(r=0.999 6)，Y異綠原酸A=10 580X-42.884(r=0.999 6)，Y異綠原酸C=10 580X-42.884(r=0.999 5)，表明綠原酸在80.0～400.0 μg/mL、異綠原酸A在40.0～200.0 μg/mL、異綠原酸C在8.0～40.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 將混合對(duì)照品溶液在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定綠原酸、異綠原酸A及異綠原酸C峰面積，RSD分別為0.47%、0.27%、0.39%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批金銀花藥材粉末制備供試品溶液，共6份，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C峰面積，RSD分別為0.96%、0.87%、0.90%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、4、8、12、24 h進(jìn)樣，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，3種成分峰面積的RSD分別為0.34%、0.65%、0.74%，說明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取5份供試品粉末，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別加入對(duì)照品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C平均加樣回收率分別為96.64%、97.35%、97.66%，RSD分別為1.65%、1.79%、1.69%。

2.3 相關(guān)性分析 將金銀花藥材顏色指標(biāo)值L*、a*、b*分別與酚酸類質(zhì)控成分綠原酸、總酚酸類含量相關(guān)聯(lián)，用SPSS 22.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

3 結(jié)果

3.1 含量測(cè)定結(jié)果 分別制備60批金銀花藥材的供試品溶液，每批樣品平行3次，測(cè)定峰面積平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C百分含量?？偡铀岷恳跃G原酸、異綠原酸A、異綠原酸C三者百分含量的總量計(jì)。結(jié)果見表1。

表1 各成分含量測(cè)定結(jié)果

表1中金銀花藥材顏色指標(biāo)是用CIE色度空間系統(tǒng)法L*、a*、b*表示的。L*代表亮度，L*值越大則表示亮度越高；a*代表紅-綠色值，a*越大表示顏色越紅，a*越小表示顏色越綠；b*代表黃-藍(lán)色值，b*越大表示顏色越黃，b*越小表示顏色越藍(lán)[18]。結(jié)果顯示，60份金銀花藥材樣品的顏色指標(biāo)變化范圍分別為L(zhǎng)*33.58～48.77、a*6.96～15.96、b*36.12～57.17；綠原酸含量變化范圍為0.58%～4.31%，總酚酸含量變化范圍為0.88%～6.12%。

3.2 顏色指標(biāo)與成分含量的相關(guān)性 金銀花藥材外觀顏色越綠，酚酸類成分含量越高。顏色越紅或越黃，酚酸類成分含量越低，見表2。

表2 金銀花藥材顏色指標(biāo)與綠原酸、總酚酸含量的相關(guān)性

表2結(jié)果顯示，綠原酸與L*、a*、b*的相關(guān)系數(shù)分別為0.842、-0.863和-0.907，雙尾檢驗(yàn)概率P均小于0.01，說明綠原酸含量與L*、a*、b*在0.01水平上有顯著相關(guān)性，且綠原酸與L*呈正相關(guān)，與a*和b*呈負(fù)相關(guān)；總酚酸與L*、a*、b*相關(guān)系數(shù)分別為0.796、-0.849和-0.879，雙尾檢驗(yàn)概率P均小于0.01，說明總酚酸含量與L*、a*和b*在0.01水平上有相關(guān)性，且總酚酸亦與L*呈正相關(guān)，與a*和b*呈負(fù)相關(guān)。

3.3 可行性分析 以綠原酸和總酚酸含量為因變量，顏色指標(biāo)L*、a*和b*為自變量，將表1數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸，得回歸方程Y綠原酸=4.108+0.057L*-0.105a*-0.065b*，R2=0.864；Y總酚酸=8.047+0.056L*-0.174a*-0.106b*，R2=0.811。

另取20批金銀花藥材，編號(hào)S1～S20，測(cè)定其顏色指標(biāo)L*、a*和b*，分別代入回歸方程計(jì)算綠原酸及總酚酸預(yù)測(cè)含量，并與實(shí)測(cè)含量進(jìn)行比較，結(jié)果見表3。

表3結(jié)果顯示，在金銀花中綠原酸平均實(shí)測(cè)含量低于平均預(yù)測(cè)含量3.79%，而總酚酸的平均實(shí)測(cè)含量高于平均預(yù)測(cè)含量7.64%。依據(jù)顏色指標(biāo)數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)，金銀花綠原酸含量全部符合要求，但有6個(gè)樣品總酚酸含量不能達(dá)標(biāo)。實(shí)測(cè)結(jié)果顯示有1個(gè)樣品綠原酸含量沒有達(dá)標(biāo)，3個(gè)樣品總酚酸含量不符合要求。實(shí)測(cè)與預(yù)測(cè)誤差超10%的樣品，綠原酸有5個(gè)，占25%，總酚酸有4個(gè)，占20%。有些樣品預(yù)測(cè)含量與實(shí)測(cè)含量相差較大，這與方程建立依據(jù)的樣品數(shù)量偏少有關(guān)。

4 討論

金銀花的主要功效為清熱解毒，酚酸類物質(zhì)是其藥效成分之一[19]。金銀花藥材顏色指標(biāo)與其酚酸類質(zhì)控成分含量之間具有極顯著相關(guān)性，可以根據(jù)顏色指標(biāo)來預(yù)測(cè)酚酸類質(zhì)控成分含量，簡(jiǎn)化操作程序，提高檢測(cè)效率。

表3 金銀花藥材預(yù)測(cè)與實(shí)測(cè)綠原酸、總酚酸含量(%)

金銀花藥材綠原酸和總酚酸含量均與L*呈正相關(guān)、與a*、b*呈負(fù)相關(guān)。依據(jù)測(cè)定結(jié)果，分析得到回歸方程，測(cè)得顏色指標(biāo)L*、a*和b*預(yù)測(cè)綠原酸、總酚酸含量。為驗(yàn)證預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，收集金銀花藥材樣品20份，分別對(duì)其綠原酸與總酚酸含量進(jìn)行預(yù)測(cè)和實(shí)測(cè)，結(jié)果綠原酸平均實(shí)測(cè)含量低于平均預(yù)測(cè)含量3.79%，總酚酸平均實(shí)測(cè)含量高于平均預(yù)測(cè)含量7.64%。

總酚酸含量超過3.8%，綠原酸含量會(huì)超過1.5%，若總酚酸含量達(dá)標(biāo)綠原酸含量必然達(dá)標(biāo)，通過預(yù)測(cè)總酚酸含量可達(dá)到判斷金銀花藥材是否符合要求。目前計(jì)算預(yù)測(cè)含量的回歸方程來自60份金銀花藥材樣品，增加樣品數(shù)量，回歸方程準(zhǔn)確度會(huì)進(jìn)一步提高。本研究為建立有效、簡(jiǎn)便、客觀的金銀花質(zhì)量評(píng)價(jià)體系奠定基礎(chǔ)。