雷公藤紅素遺傳毒性研究

黃 鶴， 張 莉， 涂如霞， 吳思瀾， 李恒華

(重慶市中藥研究院，重慶市藥物安全評(píng)價(jià)中心，重慶 400065)

雷公藤紅素，又名南蛇藤素，是一種醌甲基三萜，主要存在于衛(wèi)矛科雷公藤屬及南蛇藤屬植物中，是一個(gè)具有多種生物活性的天然產(chǎn)物[1-2]。雷公藤紅素具有顯著的抗炎、免疫抑制、抗腫瘤、抑制血管生成、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、神經(jīng)保護(hù)等作用[3-8]，具有較大的研究和開(kāi)發(fā)價(jià)值。但雷公藤紅素的毒性也不容忽視，有研究表明其對(duì)斑馬魚(yú)胚胎具有心臟毒性[9]，對(duì)膽管細(xì)胞具有毒性[10]，對(duì)造血系統(tǒng)也有一定的損傷[11]，其毒性機(jī)制不甚清楚，尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道雷公藤紅素是否具有致基因突變和染色體畸變的遺傳毒性。因此，本研究根據(jù)藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則規(guī)定，通過(guò)鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)(Ames試驗(yàn))、體外培養(yǎng)中國(guó)倉(cāng)鼠肺(CHL)細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)和小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，為雷公藤紅素研究開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株 組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門(mén)菌TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535，購(gòu)自美國(guó)Moltox公司，實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行菌株鑒定，均符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞 中國(guó)倉(cāng)鼠肺(CHL)細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，實(shí)驗(yàn)前檢測(cè)無(wú)支原體污染。

1.3 動(dòng)物 選用性成熟雄性昆明小鼠60只，7～8周齡，SPF級(jí)，體質(zhì)量30～40 g，由重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(渝)2017-0003。實(shí)驗(yàn)在本單位藥物安全性評(píng)價(jià)中心屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行，并經(jīng)本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.4 試劑與藥物 雷公藤紅素(北京融誠(chéng)鑫德科技發(fā)展有限公司，批號(hào)L-003-170611)。環(huán)磷酰胺、ICR191、2-硝基芴(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)WXBC7023V、SLBV4070、S43858V)；絲裂霉素(美國(guó)Apexbio公司，批號(hào)A4452)；疊氮鈉(成都麥卡?；び邢薰?，批號(hào)150309002)；2-氨基芴、D-生物素、L-組氨酸鹽酸鹽一水物(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)J1311022、D1524076、H1518057)；1,8-二羥基蒽醌[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，批號(hào)WXBB0392V]；二甲基亞砜(DMSO)、秋水仙堿(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)93D00104、77010150)；α-MEM(美國(guó)HyClone公司，批號(hào)SH30 265.01)；0.25%Trypsln-EDTA、青霉素鏈霉素混合液(美國(guó)Genview公司，批號(hào)811120101100、811200101100)；0.4%臺(tái)盼蘭染液、NADP-Na2(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20181127、410F024)；胎牛血清[賽爾博克斯生物制品(香港)貿(mào)易發(fā)展有限公司，批號(hào)P252018]；肝微粒體酶(S9)(美國(guó)Moltox公司，批號(hào)3533)；底層培養(yǎng)基、頂層培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂(青島日水生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20180816、20180816、20180426、20180724)；葡萄糖-6-磷酸二鈉(山東西亞化學(xué)股份有限公司，批號(hào)F09443)。體外細(xì)菌試驗(yàn)中雷公藤紅素用DMSO配制，陽(yáng)性藥用DMSO或滅菌水配制或稀釋，溶劑對(duì)照為同體積DMSO；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中雷公藤紅素用DMSO溶解，再加細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋，陽(yáng)性藥均用滅菌水配制，溶劑對(duì)照為含等濃度DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液；小鼠實(shí)驗(yàn)中雷公藤紅素用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液配制，陽(yáng)性藥用0.9%氯化鈉溶液配制，溶劑對(duì)照為等體積0.5%CMC-Na溶液。

1.5 儀器 1384A2生物安全柜、IGS180生化培養(yǎng)箱、4111CO2培養(yǎng)箱、ST16R高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；Scan 300菌落計(jì)數(shù)儀(法國(guó)Interscience公司)；GR85DA立式高溫高壓滅菌器[致微(廈門(mén))儀器有限公司]；HWS-26電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；細(xì)胞用超純水機(jī)(重慶市安特生環(huán)保設(shè)備有限公司)；SW-CJ-2FD雙人單面垂直凈化工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；IX71倒置熒光顯微鏡、CX31光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法

按照2018年《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》設(shè)計(jì)要求，分別應(yīng)用鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)、體外培養(yǎng)CHL細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)和小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn)檢測(cè)雷公藤紅素的遺傳毒性[12]。

2.1 Ames試驗(yàn) 選用5株鼠傷寒沙門(mén)氏菌突變型菌株(TA97a、TA98、TA100、 TAl02和TAl535)，試驗(yàn)前對(duì)菌株進(jìn)行遺傳特性鑒定，均符合要求。根據(jù)前期劑量篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)選擇雷公藤紅素的劑量為2 000、400、80、16、3.2 μg/mL，另設(shè)陰性對(duì)照組、溶媒對(duì)照組(DMSO)和陽(yáng)性對(duì)照組。陽(yáng)性對(duì)照組不加S9時(shí)，TA97a加入1 μg/皿的ICR191，TA98加入5 μg/皿的2-硝基芴，TA100和TA1535加入1.5 μg/皿的疊氮鈉，TA102加入0.5 μg/皿的絲裂霉素；加S9時(shí)，TA97a、TA98、TA100加入10 μg/皿的2-氨基芴，TA102加入50 μg/皿的1，8-二羥基蒽醌，TA1535加入200 μg/皿的環(huán)磷酰胺，每皿給藥體積為0.1 mL，設(shè)3個(gè)平行皿，37 ℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)每皿的回復(fù)突變菌落數(shù)。至少在一個(gè)菌株上，在有或無(wú)代謝活化系的情況下，供試品多誘發(fā)的回復(fù)突變菌落數(shù)出現(xiàn)質(zhì)量劑量依賴性的增加和/或在一個(gè)或多個(gè)質(zhì)量濃度組上出現(xiàn)可重復(fù)性的增加(回復(fù)突變菌落數(shù)均數(shù)比相應(yīng)菌株的陰性對(duì)照菌落均數(shù)增加1倍以上)，可判定為陽(yáng)性結(jié)果。

2.2 染色體畸變實(shí)驗(yàn) 根據(jù)細(xì)胞毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)在無(wú)或有S9代謝活化系統(tǒng)，暴露4 h條件下，雷公藤紅素劑量為300、150、75、37.5 μg/mL；在無(wú)S9代謝活化系統(tǒng)，暴露24 h條件下，雷公藤紅素劑量為180、90、45、22.5 μg/mL；同時(shí)另設(shè)陰性對(duì)照組(α-MEM培養(yǎng)液)、溶媒對(duì)照組(DMSO 10 μL/mL，以α-MEM培養(yǎng)液為溶媒)和陽(yáng)性對(duì)照組(加S9時(shí)為1.25 mg/mL環(huán)磷酰胺，不加S9時(shí)為12.5 μg/mL絲裂霉素)，給藥體積均為0.1 mL，設(shè)2個(gè)平行培養(yǎng)瓶，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至24 h，終止培養(yǎng)前2 h，加入50 μg/mL秋水仙堿0.1 mL，使染色體停滯在分裂中期，培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)細(xì)胞，并計(jì)算各劑量組相對(duì)群體倍增數(shù)(RPD)，以反應(yīng)細(xì)胞毒性情況。群體倍增數(shù)(PD)=[log(處理后的細(xì)胞數(shù)/處理前的細(xì)胞數(shù))]/log2；RPD=(處理組的倍增數(shù)/對(duì)照組的倍增數(shù))×100%；細(xì)胞抑制率=100%-RPD。剩余細(xì)胞懸液離心后棄上清液，保留細(xì)胞沉淀物，經(jīng)低滲、固定、制片、Giemsa染色，油鏡觀察300個(gè)中期分裂相細(xì)胞，分別記錄各組含有結(jié)構(gòu)畸變?nèi)旧w的細(xì)胞數(shù)和畸變類型，計(jì)算染色體畸變率。受試物所誘發(fā)的染色體畸變率呈劑量依賴性增加，或出現(xiàn)可重復(fù)性增加，可判定為陽(yáng)性結(jié)果。

2.3 小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn) 用7～8周齡健康KM雄性小鼠60只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為溶媒對(duì)照組(0.5% CMC-Na)，環(huán)磷酰胺組(40 mg/kg)，雷公藤紅素100、50、25、12.4 mg/kg組。雷公藤紅素各劑量組及溶媒對(duì)照組每天灌胃給藥1次，容量為0.2 mL/10 g，連續(xù)3 d；環(huán)磷酰胺組于第3天腹腔注射給藥1次，給藥體積為0.1 mL/10 g。末次給藥后約24 h，進(jìn)行股骨骨髓采樣并制作涂片，甲醇固定，姬姆薩染色，油鏡下觀察。每只小鼠計(jì)數(shù)4 000個(gè)多染紅細(xì)胞，并計(jì)算微核率；同時(shí)計(jì)數(shù)500個(gè)骨髓紅細(xì)胞[多染紅細(xì)胞(PCE)加正染紅細(xì)胞(NCE)]，求出多染紅細(xì)胞/總紅細(xì)胞的比值，即PCE/(PCE+NCE)。受試物所誘發(fā)的微核率呈劑量依賴性升高，或某一劑量組在某一測(cè)試點(diǎn)呈現(xiàn)可重復(fù)性升高，可判定為陽(yáng)性結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 Ames試驗(yàn) 各培養(yǎng)皿上背景菌苔生長(zhǎng)良好，2次試驗(yàn)中各菌株自發(fā)回復(fù)突變菌落數(shù)(陰性對(duì)照組)均在正常范圍內(nèi)，陽(yáng)性對(duì)照組回復(fù)突變菌落數(shù)均高于陰性對(duì)照組2倍以上(P<0.05，P<0.01)，提示本試驗(yàn)體系可靠。在加或不加S9代謝活化系統(tǒng)條件下，雷公藤紅素1 000 μg/皿劑量作用于各菌株均有紅色沉淀產(chǎn)生，影響結(jié)果觀察，不計(jì)入統(tǒng)計(jì)；雷公藤紅素在個(gè)別劑量下表現(xiàn)出一定的細(xì)菌毒性(回復(fù)突變菌落數(shù)降低)(P<0.05，P<0.01)。在有或無(wú)代謝活化系統(tǒng)的情況下，雷公藤紅素各劑量組回復(fù)突變菌落數(shù)均未見(jiàn)有可重復(fù)劑量相關(guān)性升高，個(gè)別劑量作用下某些菌株回復(fù)突變菌落數(shù)有一定增加，但未超過(guò)陰性對(duì)照組回復(fù)突變菌落數(shù)的2倍，且在以往Ames試驗(yàn)對(duì)照范圍內(nèi)，未見(jiàn)劑量相關(guān)性升高，故無(wú)毒理學(xué)意義。因此，0.32～200 μg/皿的雷公藤紅素均未引起所有測(cè)試菌株基因突變，Ames試驗(yàn)結(jié)果為陰性。具體結(jié)果見(jiàn)表1～3。

表1 雷公藤紅素對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌突變型菌株回復(fù)突變菌落數(shù)的影響(平行試驗(yàn)一)(個(gè)/皿，

表2 雷公藤紅素對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌突變型菌株回復(fù)突變菌落數(shù)的影響(平行試驗(yàn)二)(個(gè)/皿，

表3 陽(yáng)性對(duì)照藥物及劑量

3.2 體外培養(yǎng)CHL細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn) 高劑量雷公藤紅素表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，見(jiàn)表4。在有或無(wú)S9代謝活化系統(tǒng)暴露4 h和無(wú)S9代謝活化系統(tǒng)暴露24 h，與陰性對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組染色體畸變率均升高(P<0.01)，表明試驗(yàn)系統(tǒng)可靠；溶媒對(duì)照組、雷公藤紅素各劑量組染色體結(jié)構(gòu)畸變率無(wú)明顯變化(P>0.05)，雷公藤紅素個(gè)別劑量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，P<0.01)，但未見(jiàn)重復(fù)性劑量依賴性升高，故無(wú)毒理學(xué)意義。結(jié)果表明，雷公藤紅素未引起CHL細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)畸變率升高，染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果為陰性，見(jiàn)表5。

3.3 小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn) 環(huán)磷酰胺組小鼠骨髓微核率高于溶媒對(duì)照組(P<0.01)，顯示本實(shí)驗(yàn)體系可靠。實(shí)驗(yàn)期間，小鼠出現(xiàn)腹瀉癥狀，雷公藤紅素劑量越高，腹瀉動(dòng)物數(shù)越多，同時(shí)隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，腹瀉小鼠數(shù)也增多。雷公藤紅素劑量為100、50、25 mg/kg時(shí)，腹瀉次數(shù)分別為20、21、6次。與溶媒對(duì)照組比較，雷公藤紅素100、50、25、12.4 mg/kg組小鼠體質(zhì)量均降低(P<0.05，P<0.01)，劑量越高，給藥時(shí)間越長(zhǎng)，體質(zhì)量降低幅度越大，這與雷公藤紅素引起的動(dòng)物腹瀉情況一致；雷公藤紅素100、50、25 mg/kg組小鼠PCE/(PCE+NCE)值降低(P<0.01)，提示雷公藤紅素對(duì)骨髓有抑制作用；雷公藤紅素各劑量組小鼠骨髓微核率無(wú)明顯變化(P>0.05)。結(jié)果表明，各劑量雷公藤紅素均未引起骨髓細(xì)胞染色體完整性損害或?qū)е氯旧w分離異常，微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性，見(jiàn)表6～8。

4 討論

近年來(lái)，雷公藤紅素的抗腫瘤作用使其成為研究熱點(diǎn)之一。目前抗腫瘤藥物大都具有明顯的細(xì)胞毒性，并且很多都具有潛在的遺傳毒性，可引起人體體細(xì)胞和生殖細(xì)胞不可逆轉(zhuǎn)的遺傳損傷[13-14]。雷公藤紅素是否具有遺傳毒性，目前尚未見(jiàn)研究報(bào)道，而遺傳毒性研究是藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容，它與其他毒理學(xué)研究尤其是致癌性研究、生殖毒性研究有著密切的聯(lián)系，是藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)及上市的重要環(huán)節(jié)[15-18]，因此，本研究采用目前公認(rèn)檢測(cè)受試物致突變的幾種檢測(cè)方法，分別從體外到體內(nèi)，在微生物、離體細(xì)胞和整體動(dòng)物水平上系統(tǒng)評(píng)價(jià)雷公藤紅素的遺傳毒性。

表4 各劑量雷公藤紅素的細(xì)胞毒性

表5 雷公藤紅素對(duì)CHL細(xì)胞染色體畸變的影響

表6 雷公藤紅素對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

表7 雷公藤紅素對(duì)小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)的影響

表8 雷公藤紅素對(duì)小鼠骨髓微核的影響

Ames試驗(yàn)是經(jīng)典的檢測(cè)基因突變的方法之一，主要通過(guò)檢測(cè)組氨酸靶基因中的堿基置換或移碼突變來(lái)評(píng)價(jià)受試物的致突變性，從基因水平反映了遺傳物質(zhì)受損傷狀況[19]。本研究結(jié)果顯示，在加或不加S9的條件下，3.2～200 μg/皿雷公藤紅素均未引起細(xì)菌回復(fù)突變數(shù)有意義的增加，試驗(yàn)結(jié)果為陰性，提示雷公藤紅素對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌無(wú)致突變性。染色體畸變實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備細(xì)胞中期分裂相染色體標(biāo)本，在光鏡下直接觀察染色體數(shù)目和形態(tài)的變化，以檢測(cè)細(xì)胞染色體的損傷情況[20-21]。本研究表明，22.5～180 μg/mL(接觸24 h，不加S9)以及37.5～300 μg/mL(接觸4 h，加或不加S9)的雷公藤紅素均未引起CHL細(xì)胞染色體畸變率有意義的升高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性，提示雷公藤紅素對(duì)哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞染色體無(wú)致畸變作用。小鼠微核實(shí)驗(yàn)是用于快速檢測(cè)化學(xué)毒物損傷細(xì)胞染色體和干擾細(xì)胞有絲分裂的方法，微核的產(chǎn)生與染色體斷裂及紡錘體受損有關(guān)，微核率大小可間接反映染色體受損情況，能檢測(cè)受試物導(dǎo)致染色體完整性的改變和分離，改變兩種遺傳終點(diǎn)[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，灌胃給予100、50、25、12.4 mg/kg雷公藤紅素均未引起骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率有意義的增高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性，提示雷公藤紅素?zé)o致小鼠股骨骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核形成作用，不會(huì)影響細(xì)胞染色體完整性及有絲分裂進(jìn)程。

綜上所述，本研究采用Ames試驗(yàn)、染色體畸變實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)微核實(shí)驗(yàn)這3個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)組合進(jìn)行雷公藤紅素的遺傳毒性評(píng)價(jià)，結(jié)果提示，其不具有潛在的致基因突變和染色體畸變的遺傳毒性，與很多抗腫瘤藥物相比，顯示出一定的優(yōu)勢(shì)，具有極大的開(kāi)發(fā)潛力。本研究為雷公藤紅素進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了毒理學(xué)依據(jù)，但雷公藤紅素作用靶點(diǎn)尚未完全闡明，其相關(guān)毒性以及具體機(jī)制有待更進(jìn)一步深入研究。