溫腎填精方及其拆方對腎陽虛不孕小鼠生殖功能的影響

董文然， 劉 奕， 陸 華

(成都中醫(yī)藥大學，四川 成都 610075)

現(xiàn)代社會發(fā)展迅速，人類面對日益增加的壓力，熬夜、酗酒、暴飲暴食、縱欲等不良生活作息頻率升高，陽虛質(zhì)升高至整體人群偏頗體質(zhì)前3位[1]，誘發(fā)腎陽不足成為當代人群常見證候，更是成為不孕癥的主要證候之一[2]。腎陽對機體有調(diào)節(jié)臟腑功能和增強機體活動的作用，而線粒體的功能在于為人體活動提供能量，現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，腎陽虛證與線粒體功能減退、能量代謝失調(diào)存在一定相關(guān)性[3]。本研究聚焦于腎陽虛證不孕小鼠生殖功能，從腎陽虛-線粒體動力學-能量代謝-生殖層面探討溫腎填精復方的效用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF級昆明雌性小鼠144只，4～6周齡，體質(zhì)量(20±2)g；SPF級昆明雄性小鼠20只，6～8周齡，體質(zhì)量(30±3)g，均由成都達碩實驗動物有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(川)2020-030，飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，采用分籠飼養(yǎng)，每籠6只，自由進食飲水，保持溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，晝夜光照。

1.2 藥物 羥基脲片(500 mg/片)購于山東齊魯制藥有限公司)，取2 g研成粉末，50 mL冰生理鹽水配成混懸液，置于4 ℃冰箱中保存；孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG，1 000 IU/支)購于北京索萊寶科技有限公司，溶于20 mL 0.9%生理鹽水中，置于-20 ℃冰箱中保存；人絨毛膜促性腺激素(chorionic gonadotropin，HCG，2 000 IU/支)購于麗珠集團麗珠制藥廠，溶于20 mL 0.9%生理鹽水中，置于-20 ℃冰箱中保存。溫腎填精免煎劑由熟地黃15 g、山藥15 g、山茱萸15 g、菟絲子15 g、淫羊藿10 g、肉蓯蓉10 g、骨碎補10 g組成，1劑相當于免煎顆粒11.4 g，溶于0.9%生理鹽水中配成0.23 g/mL混懸液；拆方一(資沖顆粒免煎劑)由熟地黃15 g、山藥15 g、山茱萸15 g、菟絲子15 g組成，1劑相當于免煎顆粒8.4 g，溶于0.9%生理鹽水中配成0.17 g/mL混懸液；拆方二(溫腎補陽免煎劑)由淫羊藿10 g、肉蓯蓉10 g、骨碎補10 g組成，1劑相當于免煎顆粒3.0 g，溶于0.9%生理鹽水中配成0.06 g/mL混懸液，均由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司提供。

1.3 試劑 透明質(zhì)酸酶(北京索萊寶科技有限公司，貨號H3884)；Quinn’s緩沖培養(yǎng)液ART-1023(美國SAGE公司，批號19230140)；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號C2006)；RNA提取液(TRIzol，美國Invitrogen公司，貨號15596018)；HyPureTMMolecular Biology Grade Water(美國HyClone公司，貨號SH30 538.02)；5×All-In-One MasterMix(with AccuRT Genomic DNA Removal Kit)(貨號G492)、EvaGreen Express 2×qPCR MasterMix-No Dye(貨號0194844830001)(加拿大ABM公司)；MOUSE ATP/NO/cAMP/cGMP ELISA KIT(上海聯(lián)邁生物工程有限公司，貨號EDL202009068)；伊紅、蘇木素(美國Thermo Fisher公司，批號392155、420699)；中性環(huán)保速干膠(南昌雨露實驗器材有限公司，批號2018042101)；4%多聚甲醛通用型組織固定液(北京蘭杰柯科技有限公司，批號1810898)。三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司，貨號10006818、80109218、10009218)；95%乙醇、二甲苯、多聚甲醛(成都市科隆化學品有限公司，批號2018012501、2018011701、2017041401)。

1.4 儀器 SW-CK-2FD型潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；Allegra X-15R型臺式冷凍離心機(美國Beckman Coulter公司)；CFX96型實時熒光定量PCR系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；V4800型組織勻漿機(北京鼎昊源科技有限公司)；80102型激光共聚焦培養(yǎng)皿(無錫耐思生命科技股份有限公司)；LSM710型激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)；CK-40解剖顯微鏡(日本Olympus公司)；3111型CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；Vortex-5型振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；Finnpipetter F3型微量移液器、Multiskan FC型酶標儀(美國Thermo Fisher公司)；WGLL-125BE型恒溫干燥箱、KD-98-ⅡA型恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；RM2235型石蠟切片機、DM1000型徠卡顯微成像系統(tǒng)、819型切片刀(德國Leica公司)；10212020C型蓋玻片、1a5105型載玻片(江蘇世泰實驗器材有限公司)。

2 方法

2.1 分組與造模 小鼠適應性飼養(yǎng)1周后觀察其陰道涂片，將動情周期規(guī)律的72只4周齡小鼠納入實驗，隨機數(shù)字表法分為自然周期組、促排對照組、陽虛模型組、溫腎填精顆粒組、溫腎補陽顆粒組、資沖顆粒組。參考課題組前期陽虛小鼠造模方式[4]并進行優(yōu)化，自然周期組、促排對照組每天上午9：00灌胃給予15 mL/kg生理鹽水，其他4組小鼠同時間點灌胃給予400 mg/kg冰羥基脲混懸液，其間監(jiān)測小鼠體質(zhì)量、肛溫、動情周期改變。21 d后，小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量和肛溫下降、動情周期紊亂的現(xiàn)象，提示造模成功。

2.2 給藥 造模結(jié)束后各組小鼠灌胃給予相應藥物，每天1次，連續(xù)15 d，劑量為按《人和動物間按體表面積折算的等效劑量比率表》(成人體質(zhì)量按60 kg計，小鼠平均體質(zhì)量按20 g計)換算后的20倍，即溫腎填精顆粒組、資沖顆粒組、溫腎補陽顆粒組分別為3.4、2.5、0.9 g/kg，而自然周期組、促排對照組、陽虛模型組小鼠灌胃給予等容量生理鹽水。

2.3 合籠 干預結(jié)束后，除自然周期組外，各組小鼠下午16：00腹腔注射5 IU PMSG，48 h后(即第3天下午16：00)腹腔注射5 IU HCG，超促排卵后每組隨機選取6只雌鼠，與雄鼠1∶1～2∶1比例進行合籠。第2天早上觀察各籠小鼠陰栓情況，如發(fā)現(xiàn)陰栓即代表受孕，另置于其他籠中飼養(yǎng)并進行標記，待子代小鼠出生后進行計數(shù)。

2.4 標本收集與處理 超促排完成后各組隨機選取6只雌鼠，于超促排卵后12 h(自然周期組通過陰道涂片選取動情前期者)腹腔注射4%水合氯醛麻醉，眼眶靜脈叢采血，收集到2 mL離心管中，4 ℃冰箱靜置過夜，3 000 r/min離心10 min，分離得到血清。脫頸椎法處死，摘取雙側(cè)卵巢，將一側(cè)卵巢放在4%多聚甲醛固定液中，另一側(cè)置于凍存管內(nèi)，放入液氮中保存待檢。

2.5 ELISA法檢測血清ATP、NO、cAMP、cGMP水平 根據(jù)相應試劑盒說明書步驟，檢測各組小鼠血清ATP、NO、cAMP、cGMP水平。

2.6 卵母細胞獲取及計數(shù) 除自然周期組外，其余各組隨機選取6只小鼠，超促排卵后16 h(自然周期組通過陰道涂片選取動情前期者)水合氯醛麻醉，摘取雙側(cè)輸卵管至35 mm培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡下戳破輸卵管壺腹部，逐漸撕扯輸卵管，釋放所有卵丘，置于含透明質(zhì)酸酶的培養(yǎng)皿中，分離顆粒細胞，將其卵母細胞再次放入含有M2培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿內(nèi)，在顯微鏡下觀察卵母細胞分期并進行計數(shù)及鑒定。結(jié)果，GV期胞漿內(nèi)可見生發(fā)泡；MⅠ期生發(fā)泡破裂，第一極體尚未排出；MⅡ期胞質(zhì)均勻、卵周隙小，第一極體排出且表面光滑、透明帶清晰均勻；異常卵的卵子形狀不規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)折光區(qū)或大空泡，透明帶增厚或凸起。

2.7 卵母細胞線粒體膜電位(ΔΨm)檢測 按“2.6”項下方法分離卵母細胞，置于含JC-1工作液的培養(yǎng)皿中，在37 ℃下孵育20 min，JC-1緩沖液洗滌2次，將卵母細胞轉(zhuǎn)移共聚焦培養(yǎng)皿內(nèi)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照，通過Zen blue lite 2.3軟件分析圖像，測量紅、綠熒光數(shù)值。

2.8 HE染色觀察卵巢組織病理形態(tài) 小鼠卵巢經(jīng)固定、沖洗、脫水、透明后包埋于石蠟中，切成5 μm薄片，在溫水中展平后撈起，貼附于載玻片后進行烘烤，二甲苯脫蠟后進行HE染色，樹脂膠封片，采用顯微成像系統(tǒng)對組織樣品進行拍照，通過Image Pro Plus 6.0軟件對圖片中卵巢的各級卵泡和黃體計數(shù)。

2.9 RT-qPCR法檢測線粒體功能相關(guān)基因的mRNA表達 液氮中取出小鼠卵巢組織，加入TRIzol后放入勻漿儀中進行總RNA抽提，檢測RNA濃度及純度，稀釋至500 ng/μL，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用EvaGreen Express 2× qPCR MasterMix-No Dye進行擴增，條件為預變性95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40個循環(huán)，每批樣品設3個復孔，以β-actin為內(nèi)參，2-ΔΔCT法計算各指標相對表達量，引物序列見表1，由生工生物工程上海(股份)有限公司合成。

表1 引物序列

3 結(jié)果

3.1 溫腎填精方及其拆方對小鼠合籠情況的影響 與自然周期組、促排對照組比較，陽虛模型組小鼠產(chǎn)仔數(shù)減少(P<0.01)；與陽虛模型組比較，各中藥組小鼠產(chǎn)仔數(shù)均有所增加，以資沖顆粒組、溫腎補陽顆粒組更明顯(P<0.05)；與自然周期組、促排對照組比較，陽虛模型組小鼠活胎數(shù)減少(P<0.01)；與陽虛模型組比較，各中藥組小鼠活胎數(shù)增加(P<0.01)；各組小鼠死胎數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組小鼠合籠子代數(shù)量

3.2 溫腎填精方及其拆方對小鼠血清ATP、NO、cAMP、cGMP水平的影響 與自然周期組比較，陽虛模型組小鼠血清ATP、cAMP水平降低(P<0.05，P<0.01)，NO水平升高(P<0.05)，cGMP水平無明顯變化(P>0.05)；與促排對照組比較，陽虛模型組小鼠血清NO、cGMP水平升高(P<0.05，P<0.01)，cAMP水平降低(P<0.01)，ATP水平無明顯變化(P>0.05)；與陽虛模型組比較，各中藥組小鼠血清ATP、cAMP水平升高(P<0.05，P<0.01)，cGMP水平均降低(P<0.01)，但各中藥組組間無顯著差異(P>0.05)；與陽虛模型組比較，溫腎填精顆粒組、資沖顆粒組小鼠血清NO水平降低(P<0.01)，溫腎補陽顆粒組無明顯變化(P>0.05)；溫腎補陽顆粒組較資沖顆粒組NO水平有所升高(P<0.05)，見表3。

表3 各組小鼠血清ATP、NO、cAMP、cGMP水平

3.3 溫腎填精方及其拆方對小鼠獲卵數(shù)的影響 與自然周期組比較，陽虛模型組小鼠異常卵數(shù)減少(P<0.01)，MⅡ期卵率降低(P<0.01)，總卵數(shù)、MⅡ期卵數(shù)、異常卵率無明顯變化(P>0.05)；與促排對照組比較，陽虛模型組小鼠總卵數(shù)、MⅡ期卵數(shù)減少(P<0.01)，MⅡ期卵率降低(P<0.01)，異常卵率升高(P<0.01)，異常卵數(shù)無明顯變化(P>0.05)；與陽虛模型組比較，各中藥組小鼠總卵數(shù)組增加，以溫腎填精顆粒組、溫腎補陽顆粒組更明顯(P<0.01)；與陽虛模型組比較，各中藥組小鼠MⅡ期卵數(shù)增加(P<0.05，P<0.01)，MⅡ期卵率升高(P<0.01)，異常卵率降低(P<0.01)，異常卵數(shù)無明顯變化(P>0.05)；溫腎補陽顆粒組較資沖顆粒組MⅡ期卵率升高更顯著(P<0.05)，見表4、見圖1。

表4 各組小鼠獲卵分期及計數(shù)

圖1 超促排卵后16 h小鼠輸卵管采集MⅡ期卵和異常卵(×100)

3.4 溫腎填精方及其拆方對小鼠卵母細胞ΔΨm的影響 與自然周期組、促排對照組比較，陽虛模型組小鼠卵母細胞ΔΨm降低(P<0.05，P<0.01)；與陽虛模型組比較，各中藥組小鼠卵母細胞ΔΨm升高(P<0.05)，但各中藥組組間無顯著差異(P>0.05)，見表5、圖2。

表5 各組小鼠

圖2 不同卵母細胞ΔΨm(×400)

3.5 溫腎填精方及其拆方對小鼠卵巢內(nèi)各級卵泡的影響 與自然周期組、促排對照組比較，陽虛模型組小鼠原始卵泡數(shù)、成熟卵泡數(shù)、黃體數(shù)減少(P<0.01)，次級卵泡數(shù)、閉鎖卵泡數(shù)增加(P<0.01)；陽虛模型組小鼠初級卵泡數(shù)較自然周期組增加，較促排對照組減少(P<0.05)；與陽虛模型組比較，各中藥組小鼠原始卵泡數(shù)、成熟卵泡數(shù)增加(P<0.01)，閉鎖卵泡數(shù)減少(P<0.01)，初級卵泡數(shù)、次級卵泡數(shù)、黃體數(shù)無明顯變化(P>0.05)；與資沖顆粒組比較，溫腎填精顆粒組、溫腎補陽顆粒組小鼠閉鎖卵泡數(shù)減少(P<0.01)，見表6、圖3。

表6 各組小鼠卵巢各級卵泡數(shù)及黃體數(shù)

圖3 各組小鼠卵泡期卵巢HE染色(×200)

3.6 溫腎填精方及其拆方對小鼠卵巢線粒體功能的影響 與自然周期組比較，陽虛模型組小鼠Mfn1、OPA1 mRNA表達降低(P<0.05，P<0.01)，Drp1 mRNA表達升高(P<0.01)；與陽虛模型組比較，溫腎填精顆粒組小鼠Mfn1、OPA1 mRNA表達升高(P<0.05，P<0.01)，溫腎填精顆粒組和資沖顆粒組小鼠Drp1 mRNA表達降低(P<0.05，P<0.01)；與溫腎填精顆粒組比較，資沖顆粒組和溫腎補陽顆粒組OPA1 mRNA表達降低(P<0.05，P<0.01)；各組小鼠Fis1 mRNA比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表7。

4 討論

溫腎填精方是由四川省名中醫(yī)陸華研究員的經(jīng)驗方資沖顆粒結(jié)合溫腎補陽類中藥而成，方中熟地黃、山茱萸、山藥肝腎脾并補，以補腎陰為主；淫羊藿、肉蓯蓉補腎壯陽，暖宮助孕，全方配伍滋腎填精、溫腎補陽，共同發(fā)揮補腎益天癸、養(yǎng)血滋沖任的功效[5]。本研究依據(jù)中醫(yī)理論，在前期羥基脲模型的基礎上對腎陽虛模型加以優(yōu)化，將冰水與羥基脲復合進行灌胃，小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降、肛溫降低等表現(xiàn)，結(jié)合合籠后小鼠無法成功受孕等結(jié)果分析，冰羥基脲可以更敏銳地建立腎陽虛證不孕的動物模型，隨后將溫腎填精復方拆解為養(yǎng)腎精的資沖顆粒方和溫腎陽的溫腎補陽方，與溫腎填精復方分別干預模型小鼠，觀察其對生殖功能的影響，并從線粒體動力學及能量代謝角度闡述其效用機制。

表7 各組小鼠線粒體動力學相關(guān)基因mRNA表達

現(xiàn)代醫(yī)學研究將環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)作為輔助判斷陰虛、陽虛的客觀指標[6-8]。本研究中模型組小鼠cAMP/cGMP比值降低，代表腎陽虛模型建立成功；中藥干預后，cAMP/cGMP比值趨向正常，說明溫腎填精方通過填腎精化腎氣、溫腎陽助溫煦的功效，調(diào)節(jié)機體陰陽狀態(tài)。

線粒體是卵母細胞重要細胞器，其產(chǎn)出ATP供應卵母細胞成熟過程中所需能量，ATP的合成受阻，導致卵子發(fā)育異常[9-10]。NO易過氧化干擾線粒體電子轉(zhuǎn)移，削弱線粒體呼吸水平，降低ATP產(chǎn)生。此外，ATP合成同樣受到線粒體內(nèi)膜與外膜之間電位差(ΔΨm)的驅(qū)動[11-12]。國內(nèi)外均有學者認為ΔΨm下降，標志著卵母細胞凋亡早期的信號[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，腎陽虛狀態(tài)下NO水平過高，ΔΨm呈低水平狀態(tài)，影響線粒體功能，ATP合成降低，導致卵細胞成熟率低，異常卵多，卵巢儲備功能下降，小鼠不孕。溫腎補陽顆粒組通過增強機體陽氣促進ATP合成，加強能量代謝，改善卵母細胞質(zhì)量；資沖顆粒組通過滋腎填精，固護先天之本，提高機體免疫功能，減少NO水平，解除體內(nèi)能量代謝抑制，降低卵泡閉鎖發(fā)生；溫腎填精復方取長避短，有效恢復卵巢儲備。

1914年Lewis等[15]首次提出線粒體動力學基本概念，其在女性生殖方面的調(diào)控中扮演重要角色。Carvalho等[16]將小鼠Mfn1基因敲除，發(fā)現(xiàn)Mfn1缺乏影響卵泡-顆粒細胞間通訊，阻滯卵泡發(fā)育，小鼠出現(xiàn)不育，且卵母細胞中線粒體結(jié)構(gòu)存在明顯缺陷，氧化磷酸化水平及ATP合成明顯降低，成為阻止卵母細胞生長和排卵的主要原因。Udagawa等[17]同樣發(fā)現(xiàn)Mfn基因敲除小鼠卵巢出現(xiàn)了低水平ATP、mtDNA拷貝數(shù)下降，ROS升高，線粒體腫脹、嵴缺失或破裂等表現(xiàn)，使小鼠出現(xiàn)不育。說明線粒體動力學調(diào)控分子紊亂，導致線粒體在卵母細胞細胞質(zhì)內(nèi)分布異常、線粒體功能下降，是卵母細胞無法發(fā)育成熟、卵巢功能下降的原因之一。本研究發(fā)現(xiàn)模型小鼠線粒體動力學相關(guān)因子表達失衡，影響卵母細胞線粒體能量供應，無法支撐卵母細胞減數(shù)分裂，卵母細胞發(fā)育受到抑制；另一方面，線粒體分裂增加，融合下降，啟動細胞凋亡控制系統(tǒng)，卵巢內(nèi)卵母細胞閉鎖加速。溫腎填精顆粒組線粒體動力蛋白趨衡，且優(yōu)于拆方組，表明該方通過改善線粒體動力水平，提高線粒體功能，增強能量代謝水平，使卵母細胞數(shù)量、質(zhì)量得到提升，卵巢儲備功能得以改善，恢復小鼠生殖功能。

本實驗結(jié)果顯示，腎陽虛小鼠卵子功能減退、卵巢儲備功能降低，生殖能力低下，溫腎填精復方及拆方對其生殖功能均有正向調(diào)節(jié)作用，溫腎助陽方擅于提高能量代謝緩解陽虛表征，資沖顆粒方長于降低卵泡閉鎖發(fā)生，溫腎填精復方通過藥物間相互配伍，酌盈劑虛，改變?nèi)焉锝Y(jié)局，可能與以下幾項機制有關(guān)：①抑制NO異常高水平表達，使線粒體內(nèi)氧化磷酸化趨近正常，增加ΔΨm，增強線粒體呼吸水平，加強ATP合成，保護卵母細胞減數(shù)分裂，改善卵子功能，增強卵巢儲備；②平衡線粒體動力學蛋白水平，改善線粒體功能及分布，加強線粒體能量代謝，并抑制細胞過度凋亡，減少異常卵子及閉鎖卵泡發(fā)生。而本實驗中各治療組未涉及量效關(guān)系研究，將在后續(xù)進一步開展研究。

綜上所述，溫腎填精復方在改善腎陽虛不孕小鼠生殖功能上存在一定療效，可為日后臨床中腎陽虛不孕癥中卵巢儲備功能下降患者，提高其卵巢功能，改善受孕結(jié)局提供參考依據(jù)。