大孔吸附樹(shù)脂分離純化羊肚菌多糖過(guò)氧化氫改性物

張雪松， 謝春芹， 凡軍民， 曹 正， 舒 瑾， 苗 雪

(江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院茶與食品科技學(xué)院，江蘇 句容 212400)

糖尿病是因胰島素分泌不足或胰島素作用障礙而導(dǎo)致的內(nèi)分泌類代謝性疾病，糖苷酶抑制劑因其效果持久、毒副作用小、作用溫和等優(yōu)點(diǎn)廣泛運(yùn)用于2型糖尿病的治療[1]。近年來(lái)，對(duì)天然植物來(lái)源的糖苷酶抑制劑展開(kāi)的研究成為熱點(diǎn)[2]。很多中藥包括食藥用菌提取物有降糖作用，多糖成分在其中起著重要作用[3-4]。羊肚菌屬珍稀食藥用菌，羊肚菌多糖具有降血脂、降血糖、抗腫瘤等作用[5-7]。

抑制α-淀粉酶活性的試劑可用于抑制腸道內(nèi)的淀粉酶活性，阻礙碳水化合物的水解，對(duì)高血糖、肥胖癥以及高血脂等具有較好的防治作用[8]。糖苷酶抑制劑中，食用菌多糖來(lái)源廣泛，但其生物活性很難與藥物相提并論，限制其應(yīng)用前景。研究表明，食用菌多糖的糖苷鍵類型、分子量大小等因素均能影響其生物活性，通過(guò)改變分子量、空間結(jié)構(gòu)等可以改變食用菌生物活性的有效途徑[9]。課題組前期采用過(guò)氧化氫氧化降解羊肚菌多糖組分，提高其對(duì)α-淀粉酶的抑制活性[10]。本實(shí)驗(yàn)以α-淀粉酶抑制率為指標(biāo)，利用大孔樹(shù)脂分離純化羊肚菌多糖過(guò)氧化氫改性物，通過(guò)篩選D101、AB-8、S-8、NKA-9、LX-17大孔樹(shù)脂，考察羊肚菌多糖的分離純化影響因素和工藝條件，以期為后續(xù)天然來(lái)源的糖苷酶抑制劑的工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 試劑與藥物 六妹羊肚菌由江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院食用菌教學(xué)基地種植，經(jīng)專家鑒定為正品。20 000 U/mL α-淀粉酶購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；氯仿、淀粉、3, 5-二硝基水楊酸(DNS)、過(guò)氧化氫為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器 GZLYZ-1型真空冷凍干燥機(jī)(諸城市博匯機(jī)械有限公司)；Thermo Nicolet 5700型傅里葉紅外光譜儀(美國(guó)Thermo公司)；T6型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；SY-5000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

2 方法

2.1 多糖制備 新鮮羊肚菌滅菌烘干后粉碎過(guò)40目篩，參考文獻(xiàn)[10]報(bào)道制備多糖，經(jīng)真空冷凍后為黃色粉末，提取率為10.32%。

2.2 多糖改性物制備 參考文獻(xiàn)[10]報(bào)道，稱取多糖1 g，按最佳條件用30%過(guò)氧化氫氧化降解羊肚菌多糖，反應(yīng)液經(jīng)濃縮、真空冷凍干燥得白色粉末狀改性物0.854 2 g，得率為85.42%。

2.3 α-淀粉酶抑制活性研究 參考文獻(xiàn)[11]報(bào)道，取抑制對(duì)照管和抑制管，分別加入0.5 mL 2%淀粉溶液和40 mg/L 1.0 mL羊肚菌多糖改性物溶液，取空白對(duì)照管和空白管，分別加入蒸餾水1.0 mL，再在抑制對(duì)照管加入蒸餾水0.5 mL，抑制劑管和空白管各加入α-淀粉酶(20 U/mL)0.5 mL，37 ℃水浴10 min，再加入DNS試劑1.0 mL，沸水浴加熱5 min后加入蒸餾水10.0 mL。冷卻至室溫后在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)，計(jì)算抑制率(InR)，公式為InR=[1-(A3-A4)/(A1-A2)]×100%。

2.4 分離純化研究

2.4.1 預(yù)處理 選用AB-8、LX-17、D101、NKA-9、S-8樹(shù)脂，分別用95%乙醇浸泡24 h后淋洗，最后用蒸餾水沖洗。

2.4.2 樹(shù)脂篩選 取上述5種樹(shù)脂各5 g，置于于錐形瓶中，加入40 mg/L多糖改性物溶液100 mL，在30 ℃、100 r/min下吸附24 h，計(jì)算吸附率，公式為吸附率=[(初始溶液抑制率-吸附后溶液抑制率)/初始溶液抑制率]×100%。

2.4.3 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[12]報(bào)道。

2.4.3.1 吸附時(shí)間 稱取預(yù)處理好的D101樹(shù)脂5 g，加入40 mg/L多糖改性物溶液100 mL，在30 ℃ 100 r/min下吸附12 h，每隔1 h測(cè)定溶液對(duì)α-淀粉酶的抑制率。

2.4.3.2 吸附溫度 稱取預(yù)處理好的D101樹(shù)脂5 g，加入40 mg/L多糖改性物溶液100 mL，分別在20、25、30、35、40 ℃下吸附3 h，測(cè)定溶液對(duì)α-淀粉酶的抑制率。

2.4.3.3 樹(shù)脂用量 分別稱取預(yù)處理好的D101樹(shù)脂1、2、3、4、5 g，加入40 mg/L多糖改性物溶液100 mL，在35 ℃下吸附3 h，測(cè)定溶液對(duì)α-淀粉酶的抑制率。

2.4.4 動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[13]報(bào)道。

2.4.4.1 pH值 稱取預(yù)處理好的D101樹(shù)脂10 g裝柱，用5% NaOH或5%HCl調(diào)節(jié)多糖改性物溶液至pH值為4、5、6、7、8，倒入100 mL溶液上樣，控制體積流量為2 BV/h，通過(guò)2 BV 95%乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫液旋蒸后定容到100 mL，測(cè)定其對(duì)α-淀粉酶的抑制率。

2.4.4.2 洗脫劑體積分?jǐn)?shù) 稱取預(yù)處理好的D101樹(shù)脂10 g裝柱，倒入100 mL pH值為7的多糖改性物溶液上樣，控制體積流量為2 BV/h分別通過(guò)2 BV 20%、40%、60%、80%、100%乙醇洗脫，洗脫液旋蒸后定容到100 mL，測(cè)定其對(duì)α-淀粉酶的抑制率。

2.4.4.3 洗脫劑用量 稱取預(yù)處理好的D101樹(shù)脂10 g裝柱，倒入100 mL pH值為7的多糖改性物溶液上樣，控制體積流量為2 BV/h，通過(guò)100 mL 80%乙醇洗脫，每1 BV(25 mL)收集1次洗脫液，旋蒸后定容至100 mL，測(cè)定其對(duì)α-淀粉酶的抑制率。

2.4.4.4 上樣質(zhì)量濃度 稱取預(yù)處理好的D101樹(shù)脂10 g裝柱，倒入100 mL pH值為7的多糖改性物溶液上樣，質(zhì)量濃度分別為20、30、40、50、60 mg/L，控制體積流量為2 BV/h，通過(guò)80%乙醇2 BV洗脫，洗脫液旋蒸后定容到100 mL，測(cè)定其對(duì)α-淀粉酶的抑制率。

2.4.4.5 上樣體積流量 稱取預(yù)處理好的D101樹(shù)脂10 g裝柱，倒入100 mL、pH值為7、質(zhì)量濃度為30 mg/L的多糖改性物溶液上樣，控制體積流量為1、2、3、4、5 BV/h，通過(guò)用80%乙醇2 BV洗脫，洗脫液旋蒸后定容到100 mL，測(cè)定其對(duì)α-淀粉酶的抑制率。

2.5 紅外光譜掃描分析 多糖改性物及D101樹(shù)脂洗脫產(chǎn)物冷凍干燥樣品磨成粉末后與溴化鉀混合，壓片，在4 000～5 00 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描分析。

3 結(jié)果

3.1 樹(shù)脂篩選 由表1可知，多糖改性物溶液被樹(shù)脂吸附后，對(duì)α-淀粉酶的抑制活性均有所降低，并且差異較大，其中D101吸附后最低，相對(duì)吸附率為61.96%，即吸附效果最好。

表1 5種樹(shù)脂吸附作用比較

3.2 靜態(tài)吸附分析

3.2.1 吸附時(shí)間 由圖1可知，前3 h內(nèi)α-淀粉酶抑制率下降最快，當(dāng)吸附時(shí)間超過(guò)3 h后變化不大，說(shuō)明吸附在3 h后已達(dá)到飽和。Ho等[14]發(fā)現(xiàn)，大孔吸附樹(shù)脂的吸附分為4個(gè)過(guò)程，在吸附的前3 h，樹(shù)脂對(duì)多糖改性物中α-淀粉酶抑制成分的吸附主要是在位于表面的活性中心上，主要是通過(guò)在溶液以及液膜中的擴(kuò)散，在樹(shù)脂表面即被吸附，而吸附時(shí)間超過(guò)3 h以后，樹(shù)脂表面α-淀粉酶抑制成分吸附量逐漸飽和，多糖改性可通過(guò)樹(shù)脂的內(nèi)部孔道擴(kuò)散到樹(shù)脂的內(nèi)表面上，由于樹(shù)脂內(nèi)部擴(kuò)散阻力較大，吸附過(guò)程趨于平緩直至飽和。

圖1 吸附時(shí)間對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響

3.2.2 吸附溫度 由圖2可知，隨著吸附溫度從20 ℃上升到40 ℃，多糖改性物溶液對(duì)α-淀粉酶的抑制率先降低再升高；當(dāng)吸附溫度為35 ℃時(shí)，溶液對(duì)α-淀粉酶的抑制活性最低，為5.51%。溫度升高會(huì)加快分子運(yùn)動(dòng)，有效的降低溶液黏度，減小外擴(kuò)散和內(nèi)擴(kuò)散的阻力，有利于吸附和擴(kuò)散過(guò)程的進(jìn)行。

圖2 吸附溫度對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響

3.2.3 樹(shù)脂用量 由圖3可知，隨著樹(shù)脂用量上升，α-淀粉酶抑制率逐漸下降，為4 g時(shí)最低，此時(shí)吸附趨于飽和，超過(guò)4 g后基本不變。

圖3 樹(shù)脂用量對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響

3.3 動(dòng)態(tài)吸附分析

3.3.1 pH值 由圖4可知，隨著pH值增大，α-淀粉酶抑制率先升高后降低，為7時(shí)最高，達(dá)24.36%，這可能是由于多糖改性產(chǎn)物分子中存在羥基，在酸性條件下容易質(zhì)子化，從而削弱和水分子之間的作用力，樹(shù)脂吸附力下降，洗脫液對(duì)α-淀粉酶的抑制活性下降；但pH過(guò)大，大孔樹(shù)脂也容易結(jié)成塊狀物，不利于對(duì)樣品進(jìn)行吸附[15]。

圖4 pH值對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響

3.3.2 洗脫劑體積分?jǐn)?shù) 由圖5可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)不斷增加，洗脫液對(duì)α-淀粉酶的抑制率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，為80%時(shí)最高，達(dá)27.87%，說(shuō)明在該體積分?jǐn)?shù)下洗脫得到的目標(biāo)成分最多。使用非極性D101大孔樹(shù)脂時(shí)，洗脫劑的極性越小，洗脫能力越強(qiáng)[16]，同時(shí)，經(jīng)過(guò)氧化氫氧化降解后羊肚菌多糖改性物分子量相對(duì)較小，在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇中的溶解度也存在較大差異。

圖5 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響

3.3.3 洗脫劑用量 由圖6可知，經(jīng)2 BV乙醇洗脫后，洗脫液對(duì)α-淀粉酶的抑制率最高，達(dá)36.21%，即洗脫的目標(biāo)成分最多。洗脫劑用量過(guò)少，則洗脫不完全；洗脫劑用量過(guò)多，洗脫液中α-淀粉酶抑制物質(zhì)濃度將會(huì)下降，會(huì)降低其抑制效果。

圖6 洗脫劑用量對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響

3.3.4 上樣質(zhì)量濃度 由圖7可知，隨著上樣質(zhì)量濃度的增大，洗脫液對(duì)α-淀粉酶的抑制率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，其原因可能是上樣質(zhì)量濃度較低時(shí)，多糖改性物溶液中的α-淀粉酶抑制物質(zhì)與樹(shù)脂內(nèi)表面接觸機(jī)會(huì)減少，擴(kuò)散到樹(shù)脂表面以及孔道內(nèi)的速度較慢，影響吸附的效果；隨著上樣質(zhì)量濃度的增加，多糖改性物溶液中α-淀粉酶抑制物質(zhì)與樹(shù)脂內(nèi)表面接觸機(jī)會(huì)逐漸增加，更多前者被樹(shù)脂吸附并洗脫，洗脫液抑制活性提高，但若上樣質(zhì)量濃度過(guò)高，多糖改性物溶液中其他物質(zhì)可能會(huì)與α-淀粉酶抑制物質(zhì)形成吸附競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，甚至形成沉淀而造成孔道堵塞，降低擴(kuò)散速率，影響吸附效果，同時(shí)當(dāng)樹(shù)脂吸附達(dá)到飽和以后，單純地增加上樣質(zhì)量濃度對(duì)提高洗脫液的α-淀粉酶抑制率影響不大。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上樣質(zhì)量濃度為30 mg/L時(shí)，對(duì)α-淀粉酶的抑制率達(dá)到最高，為40.33%。

圖7 上樣質(zhì)量濃度對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響

3.3.5 上樣體積流量 由圖8可知，隨著上樣體積流量的上升，洗脫液對(duì)α-淀粉酶的抑制率先升高后降低，為1～3 BV/h時(shí)較高，為2 BV/h時(shí)最高，為40.33%。上樣體積流量過(guò)大，多糖改性物溶液中α-淀粉酶抑制物質(zhì)在樹(shù)脂層停留的時(shí)間就會(huì)短，與樹(shù)脂的接觸時(shí)間減少，吸附效果降低，洗脫液對(duì)α-淀粉酶的抑制率就會(huì)隨著體積流量的增加而減??；上樣體積流量過(guò)小，則會(huì)延長(zhǎng)試驗(yàn)和生產(chǎn)時(shí)間，不利于經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)。

圖8 上樣體積流量對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響

3.4 分離純化前后樣品表征 由圖9可知，羊肚菌多糖改性物及其D101樹(shù)脂洗脫物均在1 150 cm-1左右處出現(xiàn)環(huán)上C-O吸收峰，1 630 cm-1左右處出現(xiàn)-OH彎曲振動(dòng)吸收峰、2 920 cm-1左右處出現(xiàn)C-H伸縮振動(dòng)吸收峰，3 420 cm-1左右處出現(xiàn)-OH伸縮振動(dòng)吸收峰等多糖的典型吸收特征，說(shuō)明采用D101大孔樹(shù)脂分離純化多糖過(guò)氧化氫降解改性產(chǎn)物所得洗脫物仍然具有典型的多糖結(jié)構(gòu)。

圖9 分離純化前后傅里葉紅外光譜圖

4 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)篩選D101、AB-8、S-8、NKA-9、LX-17大孔吸附樹(shù)脂對(duì)羊肚菌多糖改性物中α-淀粉酶抑制組分的吸附效果，確定D101大孔樹(shù)脂為目標(biāo)樹(shù)脂。結(jié)果，最佳純化條件為上樣質(zhì)量濃度30 mg/L，pH值7，吸附溫度35 ℃，樹(shù)脂用量4 g，上樣體積流量2 BV/h，2 BV 80%乙醇洗脫，洗脫產(chǎn)物對(duì)α-淀粉酶抑制率為40.33%，相較純化前提高了2.45倍。紅外圖譜表明，純化后的洗脫物仍具有多糖的吸收特征。本實(shí)驗(yàn)用5倍上樣量及樹(shù)脂用量進(jìn)行放大驗(yàn)證，重復(fù)3次測(cè)得洗脫產(chǎn)物的平均收率為50.17%，對(duì)α-淀粉酶的抑制率為40.95%，基本與放大前相當(dāng)。

目前，分離純化常用的方法有超臨界CO2法、色譜法等，但工藝相對(duì)較為復(fù)雜，成本較高[17]。大孔樹(shù)脂比表面積較大，并且具有優(yōu)良網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在萜類、黃酮類以及苷類等各種天然產(chǎn)物活性成分分離純化領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[18]。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)羊肚菌多糖改性物溶液中α-淀粉酶抑制物質(zhì)所建立的大孔樹(shù)脂分離純化工藝合理、簡(jiǎn)單可行，并且分離純化效果較好，為進(jìn)一步研究羊肚菌多糖及其改性物組分降糖能力提供依據(jù)。結(jié)果，分離純化羊肚菌多糖過(guò)氧化氫改性產(chǎn)物所得洗脫物仍然具有典型的多糖結(jié)構(gòu)，利用D101大孔樹(shù)脂進(jìn)行了初步的分離提純。下一步，將結(jié)合凝膠層析技術(shù)，獲取具有較高α-淀粉酶抑制活性且組分較為單一的多糖成分，為后續(xù)羊肚菌多糖及其改性產(chǎn)物的組成、結(jié)構(gòu)以及活性分析提供基礎(chǔ)。