大孔吸附樹脂分離純化益心泰總黃酮工藝的優(yōu)化

鄒蘇蘭， 李 雅， 李姿銳， 柳 蘭， 陸慧玲， 郭志華

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

心血管疾病已經(jīng)發(fā)展成為嚴(yán)重威脅人類健康的第一殺手，近年來(lái)心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和死亡率高居不下[1]。研究表明心臟功能與代謝有著密不可分的聯(lián)系，代謝衰竭被認(rèn)為在心力衰竭的發(fā)病機(jī)理中起著核心作用[2]，這與中醫(yī)治療心力衰竭的理念不謀而合。

益心泰復(fù)方是湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床科研方，具有益氣活血、利水消腫之功效，對(duì)心氣虧虛、血瘀水停型心衰患者療效確切。益心泰復(fù)方由黃芪、丹參、紅花等7味中藥組成，方中以黃芪為君藥，補(bǔ)氣升氣，利水消腫；丹參和紅花共為臣藥，輔助黃芪活血通經(jīng)、祛瘀止痛[3]，全方共奏益氣活血、利水消腫之功效，臨床用于治療心氣虧虛、血瘀水停型心衰患者。毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷、羥基紅花黃色素A為益心泰總黃酮中主要藥效成分，具有保護(hù)心血管、抗氧化、降血脂、抗腫瘤等藥理作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，益心泰總黃酮有效組分可以明顯改善心肌梗死后心力衰竭癥狀、心功能、超微結(jié)構(gòu)[4]。

本實(shí)驗(yàn)采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)[5-6]和Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)[7-8]，確定大孔吸附樹脂分離純化益心泰總黃酮的關(guān)鍵工藝參數(shù)并建立數(shù)學(xué)模型，最后通過(guò)Monte Carlo法計(jì)算獲得基于概率的設(shè)計(jì)空間[9-10]，以期為益心泰總黃酮的分離純化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

黃芪(批號(hào)19082607)、丹參(批號(hào)19050806)、紅花(批號(hào)19092004)、澤瀉(批號(hào)19080202)、茯苓(批號(hào)19091009)、豬苓(批號(hào)19071209)、葶藶子(批號(hào)18112505)均購(gòu)于湖南新匯制藥股份有限公司，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室龔力民副教授鑒定為正品，均符合2020年版《中國(guó)藥典》一部附錄規(guī)定。UV755B紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司)；CP114電子天平(上海奧豪斯儀器有限公司)；H1850R高速離心機(jī)(湘潭湘儀儀器有限公司)。蘆丁對(duì)照品(批號(hào)100080-201811，上海源葉生物科技有限公司)。色譜純甲醇(美國(guó)Tedia公司)；優(yōu)級(jí)純甲酸；分析純甲醇；Al(NO3)3、NaNO2、NaOH等其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 取蘆丁對(duì)照品10.50 mg，置于10 mL量瓶中，70%乙醇溶解定容至1.05 mg/mL，即得。

2.1.2 供試品溶液制備

2.1.2.1 上樣液 取處方量藥材(黃芪30 g、丹參15 g、紅花5 g、澤瀉10 g、豬苓15 g、葶藶子15 g、茯苓15 g)，第1次以10倍量70%乙醇80 ℃水浴回流提取60 min，第2次加8倍量70%乙醇80 ℃水浴回流提取30 min，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮后冷凍干燥，得到凍干粉。取適量至10 mL量瓶中，70%乙醇溶解定容，即得。

2.1.2.2 洗脫液 乙醇洗脫液減壓濃縮后，冷凍干燥得到凍干粉，取適量至10 mL量瓶中，70%乙醇溶解定容，即得。

2.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)確定 取對(duì)照品溶液1.0 mL、供試品溶液2.0 mL，置于10 mL量瓶中，加入0.5 mL 5%NaNO2搖勻，靜置6 min，加入0.5 mL 10%Al(NO3)3，靜置6 min，加入4 mL 4%NaOH溶液搖勻，70%乙醇定容，靜置10 min，在200～700 nm波長(zhǎng)處掃描。結(jié)果，對(duì)照品、供試品溶液最大吸收波長(zhǎng)分別為505、500 nm，故選擇505 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.4 線性關(guān)系考察 取對(duì)照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL至10 mL量瓶中，加入0.5 mL 5%NaNO2，搖勻，靜置6 min，加入0.5 mL 10%Al(NO3)3，靜置6 min，加入4 mL 4%NaOH搖勻，70%乙醇定容，靜置10 min，在505 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(A)進(jìn)行回歸，得方程為A=12.59X-0.029 6(r=0.999 1)，在0.010 0～0.060 0 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液0.5 mL，置于10 mL量瓶中，按“2.1.4”項(xiàng)下方法顯色，在505 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度6次，測(cè)得其RSD為0.15%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 平行制備6份供試品溶液，按“2.1.4”項(xiàng)下方法顯色，在505 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度6次，測(cè)得其RSD為1.56%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液適量，按“2.1.4”項(xiàng)下方法顯色，于0、0.5、1、1.5、3、6、12、24 h在505 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，測(cè)得其RSD為2.35%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的供試品溶液9份，每份1 mL，精密加入80%、100%、120%對(duì)照品溶液，按“2.1.4”項(xiàng)下方法顯色，在505 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率。結(jié)果，蘆丁平均加樣回收率分別為99.63%、98.89%、99.45%，RSD分別為2.01%、1.03%、1.13%。

2.2 上樣液制備 取凍干粉5.00 g至500 mL量瓶中，70%乙醇溶解定容，制得10 mg/mL供試品溶液，取0.5 mL，加入0.5 mL 5%NaNO2，搖勻，靜置6 min，加入0.5 mL 10%Al(NO3)3，靜置6 min，加入4 mL 4%NaOH搖勻，70%乙醇定容，靜置10 min，在505 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，測(cè)得總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.08%。

2.3 樹脂篩選 MAR吸附分離技術(shù)是在中藥有效成分的精制分離和復(fù)方中藥制劑的純化中常用的提取純化工藝，它是通過(guò)靜態(tài)吸附作用從中藥及其復(fù)方提取液中有選擇性地吸附其中的有效部分，去除無(wú)效部分[11-12]，在理化性質(zhì)、選擇性、吸附能力等方面有著無(wú)可取代的優(yōu)勢(shì)，并且易洗脫、可循環(huán)使用[13-14]，同時(shí)其種類多，在結(jié)構(gòu)、極性、孔徑等性能指標(biāo)上均有所差異。D-101型大孔吸附樹脂是一種非極性吸附劑，比表面積為400 m2/g，適合極性或弱極性化合物(皂苷類、黃酮類)分離純化[15]；AB-8型為一種弱極性的大孔吸附樹脂，比表面積為480～520 m2/g，王春民等[16]報(bào)道，它對(duì)黃芩總黃酮的效果最好；HPD-100型大孔吸附樹脂是苯乙烯型非極性共聚體，適用范圍廣，可用于皂苷、黃酮、萜類等天然產(chǎn)物及植物的提取分離；易海燕等[17]發(fā)現(xiàn)，它對(duì)藤茶總黃酮的吸附效果最佳。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)黃酮吸附性強(qiáng)、解吸性好的AB-8、D-101、HPD-100大孔吸附樹脂，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

2.3.1 樹脂預(yù)處理與再生

2.3.1.1 預(yù)處理 將AB-8、D101、HPD-100大孔吸附樹脂用無(wú)水乙醇浸泡24 h以充分溶脹后，95%乙醇沖洗，至洗出液加5倍量蒸餾水時(shí)無(wú)白色渾濁，蒸餾水洗至無(wú)醇味，密封保存，備用。

2.3.1.2 再生 將使用過(guò)的樹脂用無(wú)水乙醇洗脫至無(wú)色后，5%鹽酸浸泡3～4 h，水洗至中性，5%NaOH浸泡3～4 h，水洗至中性。

2.3.2 靜態(tài)吸附性能考察 準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理好的3種樹脂(相當(dāng)于干樹脂2.00 g)，置于100 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入質(zhì)量濃度為0.911 2 mg/mL上樣液30 mL，室溫振搖吸附，于1、2、4、6、10、24 h吸取上清液，測(cè)定吸光度，計(jì)算靜態(tài)吸附量和吸附率，公式分別為吸附量=(上樣液中總黃酮質(zhì)量濃度×樣液體積-水洗液中總黃酮質(zhì)量濃度×水洗液體積)/樹脂質(zhì)量、吸附率=[(上樣液中總黃酮質(zhì)量濃度×樣液體積-水洗液中總黃酮質(zhì)量濃度×水洗液體積)/上樣液中總黃酮質(zhì)量濃度×樣液體積]×100%，結(jié)果見(jiàn)表1～2。由此可知，3種樹脂靜態(tài)吸附10 h后均基本達(dá)到飽和，其中HPD-100吸附量最大，吸附率最高。

表1 樹脂靜態(tài)吸附量測(cè)定結(jié)果

表2 樹脂靜態(tài)吸附率測(cè)定結(jié)果

2.3.3 靜態(tài)解吸性能考察 準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理好的3種樹脂(相當(dāng)于干樹脂2.00 g)，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入0.911 2 mg/mL上樣液30 mL，室溫振搖吸附24 h，精密加入50%、70%、90%乙醇各40 mL，充分振搖6 h后靜置24 h，收集乙醇洗脫液，按“2.1.4”項(xiàng)下方法顯色，測(cè)定吸光度，計(jì)算解吸量和解吸率，公式分別為解吸量=醇洗液中總黃酮質(zhì)量濃度×醇洗液體積/樹脂質(zhì)量、解吸率=[醇洗液中總黃酮質(zhì)量濃度×醇洗液體積/(上樣液中總黃酮質(zhì)量濃度×樣液體積-水洗液中總黃酮質(zhì)量濃度×水洗液體積)]×100%，結(jié)果見(jiàn)表3。由此可知，HPD-100樹脂靜態(tài)吸附能力最強(qiáng)。

表3 樹脂靜態(tài)解吸量及解吸率測(cè)定結(jié)果

2.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)確定 本實(shí)驗(yàn)選擇總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)和總黃酮洗脫率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，公式分別為總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)=洗脫液中黃酮質(zhì)量/洗脫液干物質(zhì)質(zhì)量、總黃酮洗脫率=(洗脫液中黃酮質(zhì)量/上柱液黃酮質(zhì)量)×100%。

2.5 Plackett-Burman設(shè)計(jì) 總黃酮分離純化工藝魚骨圖見(jiàn)圖1，可知主要涉及藥材、環(huán)境、樹脂、吸附、解吸、除雜。由于本實(shí)驗(yàn)處于同一實(shí)驗(yàn)環(huán)境，采用同一批藥材提取，故不考慮環(huán)境和藥材因素，另外樹脂因素在單因素試驗(yàn)中已進(jìn)行考察，最終選擇上樣液體積(A)、水洗體積流量(B)、上樣液體積流量(C)、乙醇洗脫量(D)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(E)、乙醇洗脫流量(F)、水洗體積(G)進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)，確定關(guān)鍵工藝參數(shù)(CPPs)，共12組實(shí)驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表4，通過(guò)Minitab軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果見(jiàn)表5，方差分析見(jiàn)表6～7。

圖1 總黃酮分離純化工藝魚骨圖

表4 Plackett-Burman設(shè)計(jì)因素水平

由表6可知，上樣液體積流量(C)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(E)、水洗體積(G)對(duì)總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)有顯著影響(P<0.05)；由表7可知，上樣液體積(A)、水洗體積(G)對(duì)總黃酮洗脫率有顯著影響。因此，選擇因素A、C、E、G作Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

2.6 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì) 在Plackett-Burman設(shè)計(jì)結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇上樣液體積(A)、上樣液體積流量(B)、水洗體積(C)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(D)作為影響因素，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)(Y1)、洗脫率(Y2)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化分離純化工藝，因素水平見(jiàn)表8，結(jié)果見(jiàn)表9。

表5 Plackett-Burman設(shè)計(jì)結(jié)果

表6 Plackett-Burman設(shè)計(jì)總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)方差分析

表7 Plackett-Burman設(shè)計(jì)總黃酮洗脫率方差分析

表8 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平

表9 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果

總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)方差分析見(jiàn)表10，可知模型P<0.000 1，達(dá)到極顯著水平；失擬項(xiàng)P>0.05，表示方程擬合度良好；因素A、B、AB、BC、BD有顯著影響(P<0.05)。響應(yīng)面分析見(jiàn)圖2。

圖2 總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)各因素響應(yīng)面圖

總黃酮洗脫率方差分析見(jiàn)表11，可知模型P<0.05，達(dá)到極顯著水平；失擬項(xiàng)P>0.05，表明方程擬合度良好；因素A、B、C、AD、BC、C2、D2有顯著影響(P<0.05)，響應(yīng)面分析見(jiàn)圖3。

圖3 總黃酮洗脫率各因素響應(yīng)面圖

2.7 設(shè)計(jì)空間建立 根據(jù)Design-Expert 10.0軟件得到的2個(gè)數(shù)學(xué)模型開發(fā)設(shè)計(jì)空間，通過(guò)查閱文獻(xiàn)和近年來(lái)相關(guān)管理辦法，希望大孔吸附樹脂分離純化的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)、洗脫率均大于50%，故設(shè)置兩者優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)為50%，目標(biāo)范圍為大于50%。采用Monte Carlo法獲取基于達(dá)標(biāo)概率的設(shè)計(jì)空間，首先進(jìn)行仿真模擬實(shí)驗(yàn)，獲得實(shí)驗(yàn)測(cè)定誤差來(lái)計(jì)算達(dá)標(biāo)概率，以總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)、洗脫率同時(shí)滿足優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)為其達(dá)標(biāo)，模擬次數(shù)設(shè)置為5 000次，假定所有的檢測(cè)量服從正態(tài)分布，均值取單組實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)量，目標(biāo)正態(tài)分布的標(biāo)準(zhǔn)差取相同條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)所得檢測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)差，再采用實(shí)驗(yàn)窮舉法對(duì)每個(gè)工藝參數(shù)進(jìn)行窮舉，步長(zhǎng)取0.05得到的設(shè)計(jì)空間見(jiàn)圖4。最終確定，最優(yōu)操作空間為上樣液體積3 BV，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，水洗體積3.0～4.8 BV，上樣液體積流量1.3～2.0 BV/h。

表10 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)方差分析

表11 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)總黃酮洗脫率方差分析

對(duì)設(shè)計(jì)空間進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表12。由此可知，當(dāng)相關(guān)參數(shù)落在設(shè)計(jì)空間內(nèi)時(shí)，可保證總黃酮分離純化工藝的穩(wěn)定性，對(duì)指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程具有重大參考意義，符合質(zhì)量源于設(shè)計(jì)(QbD)理念。

表12 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

相較于傳統(tǒng)的單因素實(shí)驗(yàn)，Plackett-Burman設(shè)計(jì)是一種兩水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，它可以用最少試驗(yàn)次數(shù)篩選并確定對(duì)結(jié)果影響比較顯著的因素，對(duì)于受多種因素影響的實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，它可以科學(xué)客觀地篩選出顯著性的因素，可以避免不必要的資源浪費(fèi)[18]。Box-Behnken響應(yīng)面分析法能夠在因素和響應(yīng)值之間建立模型，不僅僅可以通過(guò)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，篩選出最佳工藝，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)的預(yù)測(cè)性較好，信息量大，精確度高[19]。人用藥品注冊(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)Q8是將QbD定義為一套系統(tǒng)的基于充分的科學(xué)知識(shí)和質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)管理的研究方法，從預(yù)先確定的目標(biāo)出發(fā)，強(qiáng)調(diào)對(duì)產(chǎn)品工藝的理解以及工藝控制。

注：圖中數(shù)字為工藝參數(shù)落在相應(yīng)區(qū)域時(shí)關(guān)鍵評(píng)價(jià)指標(biāo)未能達(dá)標(biāo)的概率，數(shù)字越大，不達(dá)標(biāo)可能性越大；綠色區(qū)域?yàn)樵O(shè)計(jì)空間，顏色由綠到紅表示在相應(yīng)工藝條件下，響應(yīng)值不符合要求的概率逐漸增大。

本研究采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選出樣液體積、上樣液體積流量、水洗體積及乙醇體積分?jǐn)?shù)為大孔吸附樹脂分離純化益心泰總黃酮工藝中的CPPs；結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)建立了大孔吸附樹脂分離純化益心泰總黃酮的CPPs與關(guān)鍵評(píng)價(jià)指標(biāo)的數(shù)學(xué)模型，最后通過(guò)Monte Carlo法計(jì)算獲得基于概率的設(shè)計(jì)空間，最終得到的推薦的工藝參數(shù)的操作空間為上樣液體積3.5～4.0 BV，水洗體積3～3.2 BV，上樣液體積流量1.8～2.0 BV/h?；赒bD理念的總黃酮分離純化的設(shè)計(jì)空間，是通過(guò)了解和控制關(guān)鍵工藝參數(shù)，確保產(chǎn)品質(zhì)量，使分離純化工藝在研發(fā)階段獲得了充分的工藝知識(shí)，質(zhì)量屬性和工藝參數(shù)可靠，分離純化工藝流程始終能在保證益心泰總黃酮質(zhì)量的范圍內(nèi)運(yùn)行，可以最大限度減少失敗的成本，保證總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)及總黃酮洗脫率都能達(dá)到有效分離純化的條件。