不同產(chǎn)地黑豆質(zhì)量評(píng)價(jià)

李佳榮， 劉 美， 鄧 莎， 葛珈銘， 李夢(mèng)園， 韓翠婷， 張 堅(jiān)， 馬 琳，李先寬*

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.神木市醫(yī)院藥劑科，陜西 榆林 719300)

黑豆是豆科植物大豆Glycinemax(L.) Merr.的干燥成熟種子，全國(guó)各地均有生產(chǎn)[1]，《本草綱目》[2]記載“大豆有黑、白、黃、褐、青、斑數(shù)色，黑者名烏豆，可入藥及充食”。黑豆具有益精明目、養(yǎng)血祛風(fēng)、利水、解毒之功效[3]，其煎煮取汁用于炮制何首烏、川烏、草烏、附子等多種藥材，可使藥物毒性降低，補(bǔ)益療效增強(qiáng)[4-5]。由于黑豆質(zhì)量對(duì)黑豆汁制中藥飲片的質(zhì)量、療效、用藥安全等具有重要意義[6]，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同產(chǎn)地該藥材質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料

LC-20AT型液相色譜儀、Labsolution色譜數(shù)據(jù)工作站(日本島津公司)；SB25-12DTDN型超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；H1650-w型高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；FA2104型電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)。

大豆苷、大豆苷元對(duì)照品(批號(hào)111738-201603、111502-200402，中國(guó)食品藥品檢定研究院)。黑豆共51批，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)馬琳教授鑒定為豆科植物大豆Glycinemax(L.)Merr.的干燥成熟種子。甲醇、磷酸為色譜純；水為純蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相甲醇(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫，程序見(jiàn)表1；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量20 μL，色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 梯度洗脫程序

1.大豆苷 2.大豆苷元1.daidzin 2.daidzein

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取大豆苷、大豆苷元對(duì)照品適量，置于5 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別制成質(zhì)量濃度為513、21 μg/mL的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱(chēng)取藥材粉末(過(guò)65目篩)l.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇20 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出，放至室溫，60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，稀釋至不同質(zhì)量濃度，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣20 μL測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得方程分別為大豆苷Y=69.69X+0.075 6(r=0.999 7)，線(xiàn)性范圍0.75～300 μg/mL；大豆苷元Y=0.072 7X+0.01(r=0.999 9)，線(xiàn)性范圍0.062 5～25 μg/mL。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得大豆苷、大豆苷元峰面積RSD分別為0.24%、0.63%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，室溫下于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得大豆苷、大豆苷元峰面積RSD分別為1.96%、1.47%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得大豆苷、大豆苷元峰面積RSD分別為1.98%、2.08%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批各成分含量已知的樣品6份，每份0.5 g，加入大豆苷、大豆苷元對(duì)照品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，大豆苷、大豆苷元平均加樣回收率分別為100.38%、99.70%，RSD分別為2.50%、2.33%。

2.3.6 樣品含量測(cè)定 取51批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣測(cè)定3次，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

由此可知，大豆苷含量最高的前10批樣品依次為S12>S41>S11>S27>S24>S18>S20>S13>S19>S42；大豆苷、大豆苷元總含量最高的前10批樣品依次為S41>S12>S11>S27>S20>S24>S18>S19>S42>S13，而最低的4批樣品為S8、S15、S36、S49，并且浸出物含量均低于12.0%。

2.4 聚類(lèi)分析 將表2數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 21.0軟件，采用組間聯(lián)接法，以平方Euclidean距離為測(cè)度進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。由此可知，各批樣品聚為6類(lèi)，S11～S13、S18～S20、S24、S27、S41～S42為第Ⅰ類(lèi)，大豆苷含量及大豆苷、大豆苷元總含量最高，產(chǎn)自陜西、山西、河北、江蘇、廣東；S2、S6、S9、S16、S39為第Ⅱ類(lèi)；S3、S10、S17、S22、S37為第Ⅲ類(lèi)；S1、S4～S5、S7～S8、S14～S15、S21、S26、S29～S32、S35～S36、S38、S43～S49為第Ⅳ類(lèi)；S25、S34為第Ⅴ類(lèi)；S23、S28、S33、S40、S50～S51為第Ⅵ類(lèi)。

圖2 51批樣品聚類(lèi)樹(shù)狀圖

2.5 指紋圖譜建立

2.5.1 圖譜生成 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，指紋圖譜(圖3)以AIA格式導(dǎo)出，并導(dǎo)入“2012版中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件。采用平均數(shù)法，設(shè)置S41作為參照?qǐng)D譜，進(jìn)行多點(diǎn)校正，Mark峰匹配，生成對(duì)照指紋圖譜R。結(jié)果，共標(biāo)定了23個(gè)共有峰，其中峰12為大豆苷，峰22為大豆苷元。

2.5.2 相似度評(píng)價(jià) 指紋圖譜中非共有峰峰面積占比為10.79%～74.9%，共有峰峰面積RSD為24.26%～99.26%，表明51批樣品中成分相似，但各共有成分之間的差異較大；除S15、S36、S49外，其他批次樣品指紋圖譜相似度均在0.90以上。

表2 各成分含量測(cè)定結(jié)果

圖3 51批樣品HPLC指紋圖譜

3 討論

中藥炮制輔料的標(biāo)準(zhǔn)體系不夠健全，黑豆尚缺炮制用輔料標(biāo)準(zhǔn)[7]。黑豆集“藥輔同源”“藥食同源”[8]于一身。原料來(lái)源廣，各地炮制用輔料質(zhì)量高低不一；成分復(fù)雜，缺乏統(tǒng)一指標(biāo)成分標(biāo)準(zhǔn)，均為目前黑豆汁炮制藥材待解決的問(wèn)題[9]。近年來(lái)，科研工作者研究了黑豆汁炮制品及其生品的有效成分、毒性成分和功效變化，但針對(duì)黑豆的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究較少，本研究從輔料源頭探討，以期完善黑豆汁輔料標(biāo)準(zhǔn)。

清代《本草述鉤元》釋義[10]記載：“烏豆，緊小者為雄，入藥尤良”?，F(xiàn)代研究與黑豆傳統(tǒng)用法一致表明小粒黑豆炮制何首烏效佳[11]?！八幒诙?，外黑內(nèi)綠者真”，清代提及藥用黑豆子葉為綠色[1]。依據(jù)孟德?tīng)栃誀罘蛛x定律，子葉黃色相對(duì)綠色為顯性性狀[12]，優(yōu)質(zhì)黑豆的生態(tài)性狀是自然選擇的結(jié)果。大豆異黃酮是黑豆的生物活性成分，多以糖苷的形式存在，被腸道菌群分解為苷元型被人體吸收，從而發(fā)揮較高生物活性[13-15]。大豆苷和大豆苷元作為黑豆有效成分指標(biāo)，大豆苷元含量越高，其炮制品藥效越好[16-17]。由于大豆苷元含量在黑豆中較低，炮制過(guò)程導(dǎo)致部分流失[18]，初步說(shuō)明黑豆中大豆苷與大豆苷元總含量越高，相應(yīng)黑豆汁炮制品質(zhì)量越好[19]。黑豆汁炮制藥材的作用機(jī)理有待進(jìn)一步探究。

通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定51批樣品中的大豆苷和大豆苷元含量，建立HPLC指紋圖譜，并結(jié)合聚類(lèi)分析方法較好地實(shí)現(xiàn)對(duì)不同來(lái)源黑豆的區(qū)分。優(yōu)質(zhì)黑豆皮緊粒小，黑皮黃仁，表面光滑，具光澤，一側(cè)有淡黃白色長(zhǎng)橢圓形種臍，質(zhì)堅(jiān)硬，種皮薄而脆，子葉2，肥厚，淡黃色，氣微，味淡，嚼之有豆腥味，可作為黑豆質(zhì)量的性狀鑒別標(biāo)準(zhǔn)。優(yōu)質(zhì)黑豆中大豆苷含量≥0.09%，大豆苷元含量≥0.003%，浸出物含量≥17%，出粉率≥89%，主要分布在廣東、陜西、河北、山西、江蘇等地[11]。

綜上所述，本研究建立的黑豆質(zhì)量評(píng)價(jià)方法操作簡(jiǎn)便，所建立HPLC指紋圖譜的色譜峰重疊率、相似度較好，可用于綜合評(píng)價(jià)該藥材的整體質(zhì)量，并為篩選優(yōu)質(zhì)品提供參考依據(jù)，便于科學(xué)、合理地開(kāi)發(fā)利用炮制輔料。