鴉膽子中苦木素類成分及其生物活性

吳佳輝， 何 瀟， 熊紫微， 譚 婷， 馮育林,， 楊世林， 溫 泉*， 陳道峰,3

(1.江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌 330006；2.創(chuàng)新藥物與高效節(jié)能降耗制藥設備國家重點實驗室，江西 南昌 330006；3.復旦大學藥學院，上海 201203)

鴉膽子Bruceajavanica(L.)Merr.是鴉膽子屬苦木科常綠灌木或者小喬木，廣泛分布于我國廣東、廣西、云南及東南亞地區(qū)[1]，其干燥成熟果實鴉膽子是傳統(tǒng)中藥，其性苦味寒，有小毒[2]。已有240多種化合物從鴉膽子的種子和果實中分離得到，其中大約120 種為苦木素類化合物[3]，苦木素類化合物作為鴉膽子的主要成分，具有多種生物活性，如抗癌[4]、抗炎[5]、抗病毒[6]、抗原蟲[7]等。

補體是經(jīng)活化后具有生物活性，可介導免疫和炎癥反應的蛋白。中藥作用于傳染病通常是通過抑制炎癥和退熱，其機制可能與抑制體內(nèi)補體系統(tǒng)的過度激活有關(guān)[8-9]，因此補體系統(tǒng)在中藥抑制炎癥過程中起重要作用。鴉膽子苦木素具有抗炎[5]和體外抗補體活性[10]，并且補體系統(tǒng)還參與腫瘤細胞的殺傷和監(jiān)視作用[11]。因此，本實驗對具有抗補體活性的化合物3、8進行抗腫瘤活性篩選，結(jié)果顯示對HepG2細胞具有良好的殺傷作用。

1 材料

HP20大孔吸附樹脂(日本三菱公司)；Sephadex LH-20凝膠(美國GE公司)；100～200目硅膠柱、GF254型薄層色譜(青島海洋化工廠)；YMC-Pack ODS-A HPLC(250 mm×20 mm，5 μm；250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC公司)；Global Chromatography色譜柱(4.6 mm×250 mm，蘇州環(huán)球色譜有限責任公司)。

小鼠單核巨噬細胞株(RAW264.7)、小鼠肺泡巨噬細胞株(MH-S)、人肝癌細胞株(HepG2)均購于大連美侖生物技術(shù)有限公司；胎牛血清(FBS)、Cell Counting kit-8 細胞計數(shù)試劑(CCK-8)、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒均購自上海翌圣生物科技有限公司；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、EDTA-胰蛋白酶、DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基均購自北京索萊寶科技有限公司；脂多糖(LPS)購自美國Sigma-Aldrich公司；一氧化碳(NO)檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司。

鴉膽子于2018年采自廣西，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學鐘國躍教授鑒定為正品，憑證標本(YDZ20181107)保存于江西中醫(yī)藥大學本草標本館。

2 方法

2.1 提取分離 取鴉膽子20 kg，粉碎后石油醚脫脂3次，揮干石油醚后用95%乙醇提取3次，每次2 h，合并提取液，濾過，減壓濃縮至無醇味，得粗浸膏，浸膏加適量甲醇溶解，硅膠拌樣，上樣硅膠柱，以二氯甲烷-甲醇(100∶1、20∶1、2∶1、0∶1)洗脫，得到4個流分Fr.A～Fr.D。Fr.B(260 g)用適量水溶解，上樣HP-20大孔吸附樹脂，依次以30%、60%、95%甲醇洗脫，得30%甲醇洗脫部位浸膏(Fr.B-1，98 g)、60%甲醇洗脫部位浸膏(Fr.B-2，77 g)、95%甲醇洗脫部位浸膏(Fr.B-3，108 g)。Fr.B-1加適量甲醇溶解，拌樣，采用硅膠柱(100～200目)分離，以二氯甲烷-甲醇(50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、0∶1)梯度洗脫，合并相似成分，得到5個流分Fr.B-1-1～ Fr.B-1-5，F(xiàn)r.B-1-2經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱分離，甲醇洗脫，合并相似成分，得到6個流分Fr.B-1-2-1～ Fr.B-1-2-6，在254 nm波長處，F(xiàn)r.B-1-2-2經(jīng)半制備HPLC分離(乙腈-0.1%甲酸，22∶78)，得化合物7(24.1 mg)、3(41.6 mg)；Fr.B-1-2-4經(jīng)半制備HPLC分離(乙腈-0.1%甲酸，27∶73)，得化合物5(22.9 mg)、8(43.2 mg)。Fr.B-2加適量甲醇溶解，拌樣，采用硅膠柱(100～200目)分離，以二氯甲烷-甲醇(50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、0∶1)梯度洗脫，合并相似成分，得到6個流分Fr.B-2-1～Fr.B-2-6，F(xiàn)r.B-2-4后經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱分離，甲醇洗脫，合并相似成分，得到8個流分Fr.B-2-4-1～Fr.B-2-4-8，在254 nm波長處，F(xiàn)r.B-2-4-3經(jīng)半制備HPLC分離(乙腈-0.1%甲酸，35∶65)，得化合物10(66.8 mg)、2(63.2 mg)、1(13.2 mg)；Fr.B-2-4-6經(jīng)半制備HPLC分離(乙腈-0.1%甲酸，38∶62)，得化合物6(37.5 mg)、9(46.2 mg)、4(47.8 mg)。

2.2 細胞培養(yǎng) RAW264.7、HepG2細胞在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素(PS)、高糖DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，MH-S細胞在含10%FBS、1%PS的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，條件均為37 ℃、5%CO2。

2.3 細胞存活率檢測 在96孔板中接種對數(shù)生長的RAW264.7(每孔1×104/100 μL)、MH-S(每孔8×103/100 μL)、HepG2(每孔6×103/100 μL)細胞，培養(yǎng)24 h后，棄上清，加入化合物1～10(80、40、20、10、5 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄上清，每孔加入100 μL 10%CCK-8，孵育2 h至未處理對照組顏色變?yōu)槌壬?，?450 nm波長處測定吸光度。

2.4 NO水平檢測 取對數(shù)生長期RAW264.7細胞接種于96孔培養(yǎng)板中(每孔1×105/200 μL)，培養(yǎng)24 h，設置對照組(DMEM)、LPS組(2 μg/mL LPS)、不同濃度給藥組(40、20、10 μmol/L化合物1～10，預處理2 h，加入2 μg/mL LPS的培養(yǎng)基)，每組設置3個重復孔。培養(yǎng)48 h后，收集上清液，采用Griess法檢測NO水平。

2.5 補體經(jīng)典途徑實驗 將化合物1～10與肝素鈉(陽性對照)溶于二甲基亞砜(DMSO)中，PBS緩沖液稀釋成不同濃度，加入臨界濃度的補體(1∶10稀釋的豚鼠血清)、溶血素、2%SRBC，在37 ℃下水浴30 min，離心后取上清液，在405 nm波長處測定吸光度，設置對照組和全溶血組，測定溶血抑制率。

2.6 HepG2細胞凋亡檢測 采用Annexin V-FITC凋亡試劑盒，將對數(shù)生長期的HepG2細胞以每孔2×105個的密度接種于6孔板中，在37 ℃下孵育24 h，加入化合物3、8(20、10 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰酶消化后離心收集細胞，400 μL 1×buffer緩沖液重新混懸，加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL碘化丙啶，室溫避光孵育15 min，通過流式儀檢測，F(xiàn)lowJo 7.6軟件進行分析。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定 化合物1：無定型粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：705.2 [M+Na]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：3.33(1H，d，J=15.5 Hz，H-1α)，2.57(1H，d，J=15.5 Hz，H-1β)，3.01(1H，d，J=3.7 Hz，H-9)，4.91(1H，brs，H-11)，5.13(1H，brs，H-12)，4.01(1H，brd，J=11.0 Hz，H-14)，6.48(1H，brs，H-15)，2.50(3H，s，H-18)，1.80(3H，s，H-19)，5.03(1H，d，J=7.5 Hz，H-20a)，3.87(1H，d，J=7.5 Hz，H-20b)，3.64(3H，s，OCH3)，5.68(1H，s，H-2′)，1.59(3H，s，H-4′)，2.11(3H，s，H-5′)，5.43(1H，d，J=7.7 Hz，H-1″)，4.20(1H，dd，J=8.7，7.7 Hz，H-2″)，4.30(1H，dd，J=9.2，8.7 Hz，H-3″)，4.37(1H，t，J=9.2 Hz，H-4″)，4.18(1H，m，H-5″)，4.46(1H，dd，J=11.7，4.0 Hz，H-6″α)，4.57(1H，dd，J=11.7，2.7 Hz，H-6″β)，6.62(1H，brs，11-OH)，8.25(1H，brs，12-OH)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：51.0(C-1)，193.8(C-2)，146.8(C-3)，147.7(C-4)，48.1(C-5)，27.6(C-6)，83.8(C-7)，46.2(C-8)，31.9(C-9)，39.7(C-10)，73.3(C-11)，76.3(C-12)，82.7(C-13)，48.8(C-14)，68.4(C-15)，167.0(C-16)，16.7(C-18)，26.5(C-19)，73.5(C-20)，170.5(C-21)，52.3(-OCH3)，165.5(C-1′)，116.4(C-2′)，158.8(C-3′)，26.5(C-4′)，20.5(C-5′)，104.9(C-1″)，75.6(C-2″)，78.1(C-3″)，71.1(C-4″)，77.9(C-5″)，62.4(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道基本一致，鑒定為javanicoside A。

化合物2：無色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：685.2 [M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：6.55(1H，s，H-1)，2.48(1H，m，H-4)，2.12(1H，d，J=7.1 Hz，H-5)，1.92(1H，m，H-6α)，1.74(1H，d，J=4.0 Hz，H-6β)，4.92(1H，d，J=4.0 Hz，H-7)，4.30(1H，brs，H-11)，4.16(1H，brs，H-12)，1.04(3H，d，J=6.7 Hz，H-18)，1.48(3H，s，H-19)，4.52(1H，d，J=7.2 Hz，H-20α)，3.64(1H，d，J=7.2 Hz，H-20β)，3.70(3H，s，-OCH3)，2.17(2H，d，J=7.1 Hz，H-2′)，1.98(1H，m，H-3′)，0.91(6H，m，H-4′，5′)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：132.3(C-1)，150.3(C-2)，198.1(C-3)，41.9(C-4)，44.9(C-5)，30.6(C-6)，84.6(C-7)，47.4(C-8)，41.1(C-9)，40.2(C-10)，72.9(C-11)，76.9(C-12)，83.3(C-13)，50.5(C-14)，68.3(C-15)，170.2(C-16)，12.8(C-18)，17.8(C-19)，73.6(C-20)，177.0(C-21)，53.1(-OCH3)，172.0(C-1′)，43.9(C-2′)，26.7(C-3′)，22.8(C-4′)，22.7(C-5′)，102.9(C-1″)，74.9(C-2″)，78.4(C-3″)，71.5(C-4″)，77.6(C-5″)，62.7(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道基本一致，鑒定為yadanzioside A。

化合物3：白色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：769.3 [M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：6.54(1H，s，H-1)，2.48(1H，m，H-4)，2.01(1H，brd，J=5.0 Hz，H-5)，1.93(1H，m，H-6α)，1.77(1H，m，H-6β)，4.30(1H，s，H-11)，4.16(1H，s，H-12)，6.81(1H，d，J=13.0 Hz，H-15)，1.17(3H，d，J=6.0 Hz，H-18)，1.64(1H，s，H-19)，4.53(1H，d，J=7.3 Hz，H-20a)，3.68(1H，d，J=7.3 Hz，H-20b)，3.64(3H，s，-OCH3)，6.06(1H，s，H-2′)，2.26(3H，s，H-5′)，1.42(3H，s，H-6′)，1.46(3H，s，H-7′)1.95(3H，s，H-9′)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：130.3(C-1)，149.3(C-2)，198.1(C-3)，41.9(C-4)，44.9(C-5)，30.6(C-6)，84.6(C-7)，47.4(C-8)，41.1(C-9)，40.2(C-10)，72.9(C-11)，76.9(C-12)，83.3(C-13)，49.5(C-14)，71.3(C-15)，167.2(C-16)，12.8(C-18)，17.8(C-19)，74.6(C-20)，172.0(C-21)，53.1(-OCH3)，166.0(C-1′)，113.5(C-2′)，169.4(C-3′)，82.8(C-4′)，14.5(C-5′)，26.6(C-6′)，26.5(C-7′)，162.0(C-8′)，21.6(C-9′)，102.9(C-1″)，74.9(C-2″)，78.4(C-3″)，71.5(C-4″)，77.6(C-5″)，62.7(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道基本一致，鑒定為yadanzioside G。

化合物4：白色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：701.4 [M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：7.27(1H，s，H-1)，2.01(1H，brd，J=15.0 Hz，H-5)，5.18(1H，brs，H-7)，2.52(1H，d，J=5.1 Hz，H-9)，4.94(1H，brs，H-11)，5.13(1H，brs，H-12)，1.16(3H，d，J=6.6 Hz，H-18)，1.64(3H，s，H-19)，3.90(1H，d，J=7.7 Hz，H-20α)，5.07(1H，d，J=7.8 Hz，H-20β)，3.80(3H，s，-OCH3)，2.88(1H，d，J=13.7 Hz，H-2′a)，2.94(1H，d，J=13.7 Hz，H-2′b)，1.61(6H，s，H-4′，5′)，5.35(1H，d，J=7.3 Hz，H-1″)，4.48(1H，brd，J=10.3 Hz，H-6″)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：130.3(C-1)，148.3(C-2)，195.1(C-3)，43.9(C-4)，40.9(C-5)，30.6(C-6)，83.6(C-7)，46.4(C-8)，41.1(C-9)，40.2(C-10)，73.9(C-11)，76.3(C-12)，82.3(C-13)，50.5(C-14)，68.3(C-15)，168.2(C-16)，12.8(C-18)，17.8(C-19)，73.6(C-20)，171.2(C-21)，52.1(-OCH3)，170.3(C-1′)，48.5(C-2′)，69.4(C-3′)，29.8(C-4′)，29.5(C-5′)，102.9(C-1″)，74.9(C-2″)，78.4(C-3″)，71.5(C-4″)，78.6(C-5″)，62.7(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道基本一致，鑒定為yadanzioside J。

化合物5：白色無定型粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：434.5 [M+Na]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：4.20(1H，s，H-1)，6.15(1H，s，H-3)，3.15(1H，brd，H-5)，2.16(1H，d，H-6a)，1.54(1H，d，H-6b)，2.75(1H，brs，H-9)，6.01(1H，brs，H-11)，4.43(1H，brs，H-12)，6.13(1H，brs，H-15)，1.75(3H，s，H-18)，1.57(3H，s，H-19)，2.09(3H，s，H-20)，2.06(3H，s，H-21)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：85.3(C-1)，199.3(C-2)，125.1(C-3)，164.9(C-4)，42.9(C-5)，25.6(C-6)，79.6(C-7)，43.4(C-8)，44.7(C-9)，49.2(C-10)，75.9(C-11)，78.9(C-12)，78.3(C-13)，78.5(C-14)，68.9(C-15)，174.2(C-16)，22.8(C-18)，11.8(C-19)，20.6(C-20)，25.8(C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道基本一致，鑒定為yadanziolide S。

化合物6：白色粉末狀固體(甲醇)，ESI-MSm/z：529.2 [M+Na]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：2.53(1H，d，J=16.0 Hz，H-1α)，2.84(1H，d，J=16.0 Hz，H-1β)，2.99 (1H，d，J=13.0 Hz，H-5)，2.30(1H，dt，J=14.5，2.0 Hz，H-6α)，1.88(1H，J=14.5，13.5，2.0 Hz，H-6β)，4.91(1H，s，H-7)，2.21(1H，s，H-9)，4.17(1H，d，J=4.0 Hz，H-11)，4.14(1H，s，H-12)，3.24(1H，m，H-14)，6.17(1H，brs，H-15)，1.84(3H，d，J=1.5 Hz，H-18)，1.37(3H，s，H-19)，4.70(1H，d，J=7.5 Hz，H-20a)，3.74(1H，brs，H-20b)，5.68(1H，s，H-2′)，1.92(3H，s，H-4′)，2.15(3H，s，H-5′)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：51.4(C-1)，194.4(C-2)，145.8(C-3)，130.4(C-4)，43.1(C-5)，30.1(C-6)，84.8(C-7)，46.2(C-8)，42.7(C-9)，42.2(C-10)，70.9(C-11)，78.6(C-12)，83.4(C-13)，49.8(C-14)，66.9(C-15)，169.7(C-16)，13.4(C-18)，16.0(C-19)，71.5(C-20)，174.5(C-21)，166.5(C-1′)，116.4(C-2′)，159.8(C-3′)，27.5(C-4′)，20.5(C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道基本一致，鑒定為desmethyl-brusatol。

化合物7：白色無定型粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：643.2 [M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：7.24(1H，s，H-1)，2.40(1H，m，H-4)，2.01(1H，brd，H-6α)，1.63(1H，m，H-6β)，2.49(1H，d，J=4.0 Hz，H-9)，5.16(1H，m，H-11)，6.53(1H，brs，H-15)，1.15(3H，d，J=6.5 Hz，H-18)，1.59(3H，s，H-19)，5.02(1H，d，J=7.5 Hz，H-20a)，3.87(1H，d，J=7.5 Hz，H-20b)，3.73(3H，s，-OCH3)，2.06(3H，s，H-2′)，5.31(1H，d，J=7.5 Hz，H-1″)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：129.3(C-1)，148.9(C-2)，194.5(C-3)，43.8(C-4)，40.5(C-5)，30.0(C-6)，83.6(C-7)，46.4(C-8)，41.7(C-9)，39.2(C-10)，72.9(C-11)，76.9(C-12)，82.3(C-13)，50.5(C-14)，68.9(C-15)，168.2(C-16)，18.8(C-18)，12.8(C-19)，73.6(C-20)，171.8(C-21)，52.9(-OCH3)，169.6(C-1′)，20.6(C-2′)，102.0(C-1″)，74.9(C-2″)，78.4(C-3″)，71.5(C-4″)，78.6(C-5″)，62.7(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道基本一致，鑒定為yadanzioside F。

化合物8：無色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：685.3 [M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：4.42(1H，m，H-2)，5.69(1H，brs，H-3)，6.76(1H，d，J=13.0 Hz，H-15)，1.43(3H，brs，H-18)，1.45(3H，s，H-19)，3.72(3H，s，-OCH3)，5.82(1H，brs，H-2′)，1.67(3H，s，H-4′)，2.14(3H，s，H-5′)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：84.8(C-1)，84.3(C-2)，124.1(C-3)，135.9(C-4)，43.2(C-5)，28.6(C-6)，81.6(C-7)，46.4(C-8)，42.9(C-9)，44.4(C-10)，75.9(C-11)，75.9(C-12)，82.3(C-13)，50.5(C-14)，68.3(C-15)，168.2(C-16)，20.8(C-18)，12.1(C-19)，73.6(C-20)，171.4(C-21)，52.1(-OCH3)，165.3(C-1′)，116.3(C-2′)，158.7(C-3′)，27.8(C-4′)，20.7(C-5′)，106.9(C-1″)，75.9(C-2″)，78.4(C-3″)，71.5(C-4″)，78.6(C-5″)，62.7(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道基本一致，鑒定為yadanzioside E。

化合物9：無色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：705.3 [M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：2.51(1H，d，J=16.2 Hz，H-1a)，3.27(1H，d，J=16.2 Hz，H-1b)，3.06(1H，brd，J=12.0 Hz，H-5)，2.28(1H，d，J=14.6 Hz，H-6α)，1.74(1H，ddd，J=14.6，12.8，2.1 Hz，H-6β)，5.11(1H，brs，H-7)，2.62(1H，d，J=4.2 Hz，H-9)，4.78(1H，brs，H-11)，5.06(1H，brs，H-12)，4.10(1H，brd，J=12.8 Hz，H-14)，2.08(1H，s，H-18)，1.75(1H，s，H-19)，5.13(1H，d，J=7.5 Hz，H-20a)，3.97(1H，d，J=7.5 Hz，H-20b)，3.54(3H，s，-OCH3)，8.23(1H，d，J=7.5 Hz，H-3′，7′)，7.50(1H，d，J=7.7 Hz，H-4′，6′)，7.37(1H，d，J=7.7 Hz，H-5′)，5.46(1H，d，J=7.0 Hz，H-1″)，3.89(1H，m，H-5″)，4.46(1H，d，J=10.2 Hz，H-6″a)，4.34(1H，m，H-6″b)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：51.0(C-1)，193.6(C-2)，146.6(C-3)，147.9(C-4)，43.3(C-5)，29.3(C-6)，83.8(C-7)，46.2(C-8)，42.2(C-9)，40.8(C-10)，73.0(C-11)，75.7(C-12)，82.7(C-13)，50.8(C-14)，69.4(C-15)，168.0(C-16)，15.3(C-18)，15.8(C-19)，73.5(C-20)，171.5(C-21)，52.3(-OCH3)，165.5(C-1′)，130.4(C-2′)，130.1(C-3′)，128.8(C-4′)，133.6(C-5′)，128.8(C-6′)，130.1(C-7′)，104.9(C-1″)，76.1(C-2″)，78.9(C-3″)，71.1(C-4″)，78.4(C-5″)，62.4(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道基本一致，鑒定為javanicoside J。

化合物10：非晶形粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：707.4 [M+Na]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：6.08(1H，d，J=2.2 Hz，H-3)，2.02(1H，dd，J=11.9，3.0 Hz，H-6α)，1.54(1H，t，J=12.8 Hz，H-6β)，4.84(1H，s，H-7)，2.91(1H，d，J=4.2 Hz，H-9)，6.16(1H，d，J=5.0 Hz，H-11)，6.92(1H，brs，H-15)，0.86(1H，d，J=6.8 Hz，H-18)，1.83(1H，s，H-19)，5.08(1H，d，J=7.4 Hz，H-20a)，3.87(1H，d，J=7.4 Hz，H-20b)，3.84(3H，s，-OCH3)，2.36(1H，d，J=6.6 Hz，H-2′)，0.99(3H，s，H-4′)，0.96(3H，s，H-5′)，5.44(1H，d，J=7.2 Hz，H-1″)，3.98(1H，m，H-5″)，4.54(2H，d，J=12.0 Hz，H-6″)，6.32(1H，d，J=5.6 Hz，11-OH)，7.88(1H，brs，12-OH)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：199.7(C-1)，146.3(C-2)，124.8(C-3)，31.4(C-4)，44.0(C-5)，28.6(C-6)，82.8(C-7)，46.6(C-8)，36.9(C-9)，48.7(C-10)，75.3(C-11)，76.3(C-12)，82.7(C-13)，50.8(C-14)，68.4(C-15)，168.0(C-16)，18.7(C-18)，14.5(C-19)，73.5(C-20)，171.5(C-21)，52.3(-OCH3)，171.9(C-1′)，43.4(C-2′)，25.9(C-3′)，22.5(C-4′)，22.4(C-5′)，100.9(C-1″)，74.6(C-2″)，78.9(C-3″)，71.1(C-4″)，78.9(C-5″)，62.4(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道基本一致，鑒定為javanicoside B。

3.2 細胞毒性 由表1 可知，化合物1～10濃度在 50 μmol/L 時對RAW264.7、MH-S細胞的毒性較小，存活率高，但化合物3、8對HepG2細胞毒性較大。

3.3 抗炎活性 由圖1可知，化合物3、8～10對NO生成有抑制作用，其他化合物活性較弱。

表1 化合物1～10 對RAW264.7、MH-S、HepG2細胞的

注：與對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 抗補體活性 由圖2可知，化合物3、8對補體激活具有抑制作用，其他化合物無抑制作用。

圖2 化合物3、8抗補體活性

3.5 細胞凋亡 如圖3所示，隨著化合物3、8濃度增加，HepG2細胞凋亡率升高。

圖3 化合物3、8對HepG2細胞凋亡的影響

4 討論

中藥鴉膽子化學成分的藥理活性引起了國內(nèi)外學者的普遍關(guān)注[19]。補體因子C5a 能激活ERK1/2、MEK1/2、p38MAPK和JNK使其磷酸化[20]，并且補體系統(tǒng)激活會產(chǎn)生過量的TNF-α 、IL-1β、IL-6等炎癥因子，造成局部增生損害[21]，因此補體系統(tǒng)可能是炎癥反應的上游路徑，有抗補體活性的化合物具有抗炎活性。因此有文獻導向分離鑒定具有抗補體活性的主要成分進行抗炎活性研究[22]。本研究通過對化合物1～10進行抗炎活性的篩選，用具有抗炎活性的化合物進行補體經(jīng)典途徑實驗，證明化合物3和8具有良好的抗補體活性。鴉膽子苦木素廣泛應用于多種癌癥的治療，但都通過細胞凋亡途徑進行研究[23]。本研究初步證明具有良好抗補體活性的化合物3和8對人肝癌細胞具有殺傷作用，為鴉膽子苦木素抗腫瘤活性研究提供參考。