基于Q-marker等多維度評價(jià)延胡索配方顆粒的質(zhì)量

張 純， 范曉良， 陳葉青， 李 雪， 金佩芬

(1.嘉興市食品藥品與產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測院中藥室，浙江 嘉興 314001；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬嘉興中醫(yī)院臨床藥學(xué)室，浙江 嘉興 314001；3.嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314001)

延胡索為罌粟科植物延胡索CorydalisyanhusuoW. T. Wang 的干燥塊莖，功效活血散瘀、利氣止痛[1]，其止痛的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)主要為生物堿[2]，并具有鎮(zhèn)靜催眠、抗藥物成癮、抗炎、抗缺血、抗?jié)儭⒖挂钟舻茸饔肹3-8]。延胡索配方顆粒是在原飲片基礎(chǔ)上直接發(fā)展而來的中藥配方顆粒，市場需求量巨大，但目前該制劑國家標(biāo)準(zhǔn)中的含量測定指標(biāo)僅為延胡索乙素[1]，故對其藥效關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)物質(zhì)成分群進(jìn)行質(zhì)量控制具有重要意義。

2016年，劉昌孝院士首次提出“中藥質(zhì)量標(biāo)志物”(Q-marker)的概念[9-10]，通過對延胡索系統(tǒng)研究，確定延胡索乙素、延胡索甲素、黃連堿、巴馬汀、去氫延胡索甲素、D-四氫藥根堿、原阿片堿作為其Q-marker[11]。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，結(jié)合水分、溶化性、浸出物、TLC鑒別、聚類分析、指紋圖譜等對延胡索配方顆粒進(jìn)行多維度評價(jià)，以期為該制劑質(zhì)量控制及標(biāo)準(zhǔn)提升提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695-2998高效液相色譜系統(tǒng)，配置DAD檢測器(美國Waters公司)；XS205DU電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；Mili-Q Reference超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；C300真空泵(美國圣斯特公司)；KQ-800KDE高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DGG-9053A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；暗箱式紫外透射儀(上海寶山顧村電光儀器廠)；薄層色譜板(德國默克公司)。

1.2 試劑與藥物D-四氫藥根堿(批號AF200527-07，純度98%)、黃連堿(批號112026-201802，純度94%)、延胡索甲素(批號AF200519-10，純度98%)、去氫延胡索甲素(批號AF200415-17，純度98%)對照品均購自湖南旭瑞中領(lǐng)生物科技有限公司；原阿片堿(批號110853-201805，純度99.6%)、延胡索乙素(批號110726-201819，純度99.8%)、鹽酸巴馬汀(批號110732-201309，純度95.1%)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。18批延胡索配方顆粒源于各廠家或醫(yī)療機(jī)構(gòu)，具體信息見表1。甲醇、乙腈、磷酸為色譜純；其他試劑均為分析純；水為自制超純水。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 水分、溶化性測定 按照2020年版《中國藥典》四部通則0832水分測定第二法(烘干法)及通則0104溶化性檢查相關(guān)規(guī)定進(jìn)行測定，測得18批樣品中水分為2.59%～6.24%，均符合藥典要求(水分不大于8.0%)，并且均無焦屑等異物。

2.2 浸出物測定 本品研細(xì)，取約2 g，精密稱定，精密加入100 mL乙醇，按照2020年版《中國藥典》四部通則2201醇溶性浸出物測定法項(xiàng)下的熱浸法進(jìn)行測定，測得18批樣品中浸出物為10.39%～27.70%，符合試點(diǎn)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)(浸出物不少于10.0%)。

2.3 TLC定性鑒別 取本品0.5 g，研細(xì)，加70%甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?0 mL水溶解，濃氨試液調(diào)pH至堿性，乙醚振搖提取3次，每次10 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液；取延胡索對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液；取延胡索乙素對照品適量，甲醇制成每1 mL含0.5 mg該成分的對照品溶液。以甲苯-丙酮(9∶1)為展開劑二次展開，取出晾干后碘蒸氣顯色，在365 nm紫外燈下檢視，結(jié)果見圖1。由此可知，主斑點(diǎn)清晰，分離度良好，與對照藥材、對照品在相同位置處顯示相同顏色的斑點(diǎn)。

注：D為延胡索，T為延胡索乙素對照品。

2.4 HPLC指紋圖譜建立

2.4.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.1%磷酸(含0.08%三乙胺)(B)，梯度洗脫(0～10 min，90%～87%B；10～65 min，87%～75%B；65～66 min，75%～15%B；66～80 min，15%B)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長280 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.4.2 供試品溶液制備 取本品適量，研細(xì)，精密稱取粉末0.2 g，置于150 mL錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，在30 ℃恒溫下超聲(250 W、40 kHz)處理25 min，放冷，70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.4.3 方法學(xué)考察 以6號峰(延胡索乙素)為參照(S)，取供試品溶液適量，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD<0.50%，相對峰面積RSD<2.5%，表明儀器精密度良好。取本品適量，按“2.4.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD<0.50%，相對峰面積RSD<3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。取供試品溶液適量，于0、3、6、12、24、36、48 h在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD<0.50%，相對峰面積RSD<2.0%，表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 圖譜生成 取18批樣品，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012版)”，以S1為參照圖譜，中位數(shù)法生成對照圖譜，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.5，采用多點(diǎn)校正，見圖2，發(fā)現(xiàn)有15個(gè)共有峰，相似度見表2，可知在0.981～1.000范圍內(nèi)，符合指紋圖譜要求。以6號峰(延胡索乙素)為參照(S)，測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD為0.12%～0.97%，相對峰面積RSD為23.3%～51.5%，表明不同廠家、批次樣品成分組成一致，但在含量上存在差異。

圖2 18批樣品HPLC指紋圖譜

表2 18批樣品相似度

2.4.5 聚類分析 以共有峰峰面積與稱樣量比值為變量，采用組間連接法，以平方歐式距離為測量度進(jìn)行聚類分析[12-14]，結(jié)果見圖3。由此可知，各批樣品聚為4類，其中S1～S2、S3～S4、S12～S17各自聚類，而其余廠家樣品較分散。

圖3 18批樣品聚類分析樹狀圖

2.5 含量測定

2.5.1 對照品溶液制備 取D-四氫藥根堿、原阿片堿、延胡索乙素、黃連堿、延胡索甲素、鹽酸巴馬汀、去氫延胡索甲素對照品適量，70%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.084 4、0.168 5、0.960 1、0.266 7、0.247 9、0.133 6、0.699 4 mg/mL的溶液，即得。

2.5.2 供試品、陰性樣品溶液制備 同“2.4.2”項(xiàng)。

2.5.3 色譜條件 同“2.4.1”項(xiàng)，色譜圖見圖4。

2.5.4 線性關(guān)系考察 將對照品溶液稀釋成系列質(zhì)量濃度，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，并以信噪比(S/N)10∶1為定量限，3∶1為檢測限，結(jié)果見表3，可知在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.D-四氫藥根堿 2.原阿片堿 3.延胡索乙素 4.黃連堿 5.延胡索甲素 6.鹽酸巴馬汀 7.去氫延胡索甲素1.D-tetrahydrojatrorrhizine 2.protopine 3.tetrahydropalmatine4.coptisine 5.corydaline 6.palmatine 7.dehydrocorydaline

表3 各成分線性關(guān)系

2.5.5 方法學(xué)考察

2.5.5.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液適量，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得D-四氫藥根堿、原阿片堿、延胡索乙素、黃連堿、延胡索甲素、鹽酸巴馬汀、去氫延胡索甲素峰面積RSD分別為1.89%、1.81%、1.62%、1.90%、1.63%、1.71%、1.87%，表明儀器精密度良好。

2.5.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品(批號1909001C)適量，按“2.4.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得D-四氫藥根堿、原阿片堿、延胡索乙素、黃連堿、延胡索甲素、鹽酸巴馬汀、去氫延胡索甲素含量RSD分別為0.84%、1.36%、1.08%、0.98%、0.99%、1.38%、1.83%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液(批號1909001C)適量，于0、3、6、12、24、36、48 h在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得D-四氫藥根堿、原阿片堿、延胡索乙素、黃連堿、延胡索甲素、鹽酸巴馬汀、去氫延胡索甲素峰面積RSD分別為1.14%、1.02%、0.79%、1.45%、1.68%、1.41%、1.10%，表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知的本品(批號1909001C)6份，每份0.1 g，置于150 mL錐形瓶中，精密加入對照品溶液1 mL，按 “2.4.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，D-四氫藥根堿、原阿片堿、延胡索乙素、黃連堿、延胡索甲素、鹽酸巴馬汀、去氫延胡索甲素平均加樣回收率分別為97.81%、101.53%、99.71%、102.33%、98.97%、101.63%、100.85%，RSD分別為1.59%、1.06%、0.83%、0.95%、1.38%、1.88%、0.89%。

2.5.6 樣品含量測定 取18批樣品，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算含量，結(jié)果見表4。

表4 各成分含量測定結(jié)果(mg/g)

3 討論

目前，雖然國家先后頒布了近200種中藥配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[15-16]，但其質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)問題仍是未來急需應(yīng)對的兩大挑戰(zhàn)[17]?！吨兴幣浞筋w粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》規(guī)定，中藥配方顆粒除符合2020年版《中國藥典》對顆粒劑的通則要求外，還應(yīng)具備湯劑基本屬性。Q-marker作為反映中藥安全性和有效性的標(biāo)識性物質(zhì)[18]，完全符合上述理念，可有效反映從湯劑到配方顆粒藥效物質(zhì)成分的傳遞，可用于中藥配方顆粒的質(zhì)量評價(jià)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，18批延胡索配方顆粒水分、溶化性、浸出物檢測結(jié)果均符合2020年版《中國藥典》及配方顆粒試點(diǎn)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定；TLC鑒別方法靈敏度高，分離度好；各批樣品相似度較好，在主要成分組成上具有較高的一致性，但其含量存在一定差異，特別是7個(gè)Q-marker，其中來源于廣東某公司生產(chǎn)的6批樣品較小，在聚類分析中也歸為一類，表明其質(zhì)量較穩(wěn)定，而部分廠家樣品聚類較分散，需引起關(guān)注。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對延胡索配方顆粒質(zhì)量進(jìn)行多維度全面評價(jià)，所建立的方法準(zhǔn)確可靠，簡便可行，可為該制劑質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。