滋腎育胎丸聯(lián)合二甲雙胍對腎虛型多囊卵巢綜合征大鼠的改善作用

何嘉侖 吳曉貞 張毅靖 甘劍峰 唐洪梅?

（1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院， 廣東 廣州510405； 2.廣州中醫(yī)藥大學， 廣東 廣州510405）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是以長期無排卵、高雄激素血癥、和／或胰島素抵抗為基本特征，具有發(fā)病多因性、生理病理和臨床表現(xiàn)多態(tài)性［1］，是導(dǎo)致育齡婦女月經(jīng)異常、不孕的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，而高雄激素血癥是育齡期女性最常見的內(nèi)分泌疾?。?］。PCOS 是婦科臨床疑難病證，影響約10% 育齡婦女［3］，屬中醫(yī)“閉經(jīng)”“不孕”“癥瘕”等范疇［4］。滋腎育胎丸是著名中醫(yī)學家羅元愷教授的經(jīng)驗方，對腎虛型PCOS 不孕患者具有改善中醫(yī)證候及激素水平，提高促排卵效果及妊娠率的作用［5］。滋腎育胎丸治療PCOS 常與二甲雙胍聯(lián)合用藥，而二甲雙胍作為PCOS 治療的輔助用藥可改善肥胖、多毛等癥狀，在改善高胰島素血癥的同時，降低女性體內(nèi)的高雄激素，促進優(yōu)勢卵泡發(fā)育及排出［6?7］。本研究通過探討滋腎育胎丸聯(lián)合二甲雙胍對腎虛型PCOS 大鼠模型的作用，及其對血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及高遷移率族蛋白1（HMGB1）信號通路的影響，以期為深入探討滋腎育胎丸治療腎虛型PCOS 不孕患者的機理提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 50 只SPF 級SD 雌性大鼠，6 周齡，體質(zhì)量120～140 g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（粵）2018?0002。

1.2 試劑與藥物 滋腎育胎丸（批號A01007），購自廣州白云山中一藥業(yè)有限公司。鹽酸二甲雙胍腸溶膠囊（批號20012021），購自北京圣永制藥有限公司；來曲唑片（批號191107 KG），購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；大鼠孕酮（P）、雌二醇（E2）、促黃體激素（LH）、睪酮（T）、血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）ELISA 試劑盒（批號GR2020?07），均購自武漢基因美生物科技有限公司；高遷移率族蛋白（HMGB1）抗體、晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）抗體（批號GR3216146?2、GR3274230?2），均購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。

1.3 儀器 5810R 型臺式離心機，德國Eppendorf 公司；DG5033A 型多功能酶標儀，南京華東電子集團有限公司；Nikon Eclipse Ti?SR 型倒置熒光顯微鏡，日本尼康公司；165?8001 型垂直板電泳槽，海門其林貝爾儀器制造有限公司。

2 方法

2.1 造模 50 只SD 大鼠按照隨機數(shù)字表法隨機分為空白組10只，造模組40只，造模組大鼠灌胃給予0.5 mg／kg 來曲唑建立PCOS 模型，空白組大鼠灌胃給予蒸餾水，連續(xù)21 d，并在光學顯微鏡下觀察大鼠一個動情周期的陰道涂片。

2.2 析因設(shè)計方案與分組處理 選取滋腎育胎丸（A）與二甲雙胍（B）2 個實驗因素，每個因素取2 個水平（1 不使用，2 使用），將2 個因素2 個水平進行組合，見表1。大鼠造模成功后，按照隨機數(shù)字表法分為模型組（A1B1）、二甲雙胍組（A1B2，150 mg／kg）、滋腎育胎丸組（A2B1，1.5 g／kg）、聯(lián)合用藥組（A2B2，150 mg／kg 二甲雙胍＋1.5 g／kg滋腎育胎丸），每組10只，灌胃給予相應(yīng)劑量藥物，每天1次，連續(xù)28 d。

表1 2×2 析因設(shè)計

2.3 檢測指標

2.3.1 卵巢形態(tài)學觀察 給藥結(jié)束后，各組大鼠禁食12 h，次日腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后腹主動脈取血，迅速摘取雙側(cè)卵巢及子宮，取卵巢固定于4%甲醛溶液中，常規(guī)石蠟切片，HE 染色，顯微鏡下觀察組織形態(tài)變化。

2.3.2 ELISA 法檢測血清性激素P、E2、LH、T 及子宮勻漿液VEGF 水平 血樣常溫放置30 min，4 ℃、3 000 r／min離心5 min，取上層血清保存待測，按照試劑盒說明書檢測血清性激素P、E2、LH、T 水平，以及一側(cè)子宮勻漿液VEGF 水平。

2.3.3 Western blot 法檢測子宮組織中HMGB1、RAGE 蛋白表達 子宮組織充分剪碎后加入裂解液，冰浴30 min，4 ℃、12 000 r／min 離心20 min，收集上清，BCA 法檢測蛋白濃度，取40 μg 蛋白上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST 洗脫，一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗脫，二抗室溫孵育2 h，化學發(fā)光法顯色，將膠片進行掃描存檔，用Image J 軟件分析目標條帶的光密度值。

2.4 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 26.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，如果服從正態(tài)分布且同時滿足方差齊的條件，則組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD 檢驗，而藥物之間的交互作用采用析因設(shè)計方差分析；如果不服從正態(tài)分布，或者服從正態(tài)分布但方差不齊，則組間比較采用非參數(shù)檢驗，進一步成對比較采用Kruskal?Wallis H檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 動情周期監(jiān)測 空白組存在規(guī)律的動情周期；模型組使用來曲唑誘導(dǎo)21 d后，大鼠動情周期失去規(guī)律性變化，均處于動情間期，細胞總數(shù)較為稀少，以白細胞為主，偶見一些有核上皮細胞，見圖1。

圖1 大鼠陰道涂片（×20）

3.2 滋腎育胎丸及二甲雙胍對PCOS 大鼠卵巢形態(tài)學的影響 空白組大鼠卵巢可見不同發(fā)育時期的初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡，卵泡內(nèi)顆粒細胞層較厚且致密；模型組大鼠卵巢閉鎖卵泡較空白組增多，囊狀擴張明顯增加，顆粒細胞層數(shù)減少（←處）；二甲雙胍組、滋腎育胎丸組和聯(lián)合用藥組大鼠卵巢囊性擴張卵泡的數(shù)目明顯減少，卵巢局部形態(tài)與空白組大致接近，見圖2。

3.3 滋腎育胎丸及二甲雙胍對PCOS 大鼠血清性激素及子宮勻漿液VEGF 水平的影響

3.3.1 單因素方差分析 與空白組比較，模型組血清P 水平降低（P＜0.05），血清LH、T 水平及子宮勻漿液VEGF水平升高（P＜0.05），E2水平無明顯變化（P＞0.05）；與模型組比較，二甲雙胍組、滋腎育胎丸組和聯(lián)合用藥組P水平均升高（P＜0.05），血清LH、T 水平及子宮勻漿液VEGF 水平均降低（P＜0.05），滋腎育胎丸組和聯(lián)合用藥組E2水平升高（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠血清性激素及子宮勻漿液VEGF 水平比較（，n＝10）

表2 各組大鼠血清性激素及子宮勻漿液VEGF 水平比較（，n＝10）

注：與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

3.3.2 主效應(yīng)與交互作用分析 根據(jù)析因設(shè)計方差分析的主體間效應(yīng)比較來判斷滋腎育胎丸與二甲雙胍對于血清性激素及子宮勻漿液VEGF 水平是否存在交互作用。兩藥均有升高血清P 水平、降低血清T 水平的作用，但沒有交互作用（P＞0.05）；滋腎育胎丸有升高血清E2水平的作用，而二甲雙胍作用不明顯，兩藥之間不存在交互作用（P＞0.05）；兩藥均有降低血清LH 水平、子宮勻漿液VEGF水平的作用，且兩藥之間存在交互作用（P＜0.05），見圖3。

圖3 各檢測指標輪廓圖

3.4 滋腎育胎丸及二甲雙胍對PCOS 大鼠子宮組織中HMGB1、RAGE 蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組大鼠子宮組織中HMGB1、RAGE 蛋白表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，二甲雙胍組、滋腎育胎丸組和聯(lián)合用藥組大鼠子宮組織中HMGB1、RAGE 蛋白表達降低（P＜0.05），見表3、圖4。

圖4 各組大鼠子宮組織HMGB1、RAGE 蛋白條帶圖

表3 各組大鼠子宮組織HMGB1、RAGE 蛋白表達比較（，n＝10）

表3 各組大鼠子宮組織HMGB1、RAGE 蛋白表達比較（，n＝10）

注：與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

4 討論

現(xiàn)代研究表明，PCOS 患者血清LH 水平的異常增高引起雄性激素卵巢T 反饋性增加，而E2水平相對不足，引起高雄激素血癥，抑制卵巢正常發(fā)育與排卵［8］。PCOS 患者下丘腦?垂體?卵巢功能軸的失調(diào)可致使E2和P 缺乏調(diào)控，ER、PR 表達異常導(dǎo)致VEGF 及其受體VEGFR2 的過度表達，促使Akt 磷酸化，從而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜形成過度增殖的狀態(tài)以及上皮?間質(zhì)異常轉(zhuǎn)化，干擾胚胎正常著床導(dǎo)致PCOS 患者的流產(chǎn)或不孕［9?12］。來曲唑與脫氫表雄酮這2 種藥物誘導(dǎo)造模的大鼠血清性激素均有改變，但脫氫表雄酮造模由于持續(xù)給予雄激素而難以區(qū)分內(nèi)源性和外源性因素［13］，為了避免實驗受到干擾，本研究采用來曲唑法［14］建立腎虛型PCOS 大鼠模型。目前認為PCOS 多起病于青春期，成年P(guān)COS 是青春期PCOS 的延續(xù)［15］，因此本研究選擇6 周齡大鼠。實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠處于動情間期且性激素紊亂，卵巢組織病理切片具有明顯多囊樣改變，表明該模型基本符合臨床腎虛型PCOS 不孕患者的病理改變。

中醫(yī)認為PCOS 發(fā)病主要與腎?天癸?沖任?胞宮軸功能紊亂有關(guān)，涉及腎、肝、脾三臟，其中腎虛為根本病機［16］，而通過辨證施治可改善內(nèi)源性激素分泌，達到調(diào)經(jīng)、促孕的效果［4］。滋腎育胎丸方中菟絲子安胎補腎，人參大補元氣；續(xù)斷、桑寄生、鹽巴戟天、杜仲可輔助菟絲子益腎氣、補腎陽；白術(shù)、黨參輔助人參健脾補氣；艾葉止血溫經(jīng)，砂仁調(diào)中理氣；枸杞子、熟地黃、阿膠、制何首烏養(yǎng)血滋陰；鹿角霜補元陽、生精髓，全方共奏健脾益腎、固元益氣之功［17］。本研究結(jié)果表明，滋腎育胎丸可升高E2、P 水平，降低LH、T 水平，抑制VEGF 過表達，對于腎虛型PCOS 大鼠，與二甲雙胍聯(lián)合用藥比單一用藥療效更佳。滋腎育胎丸治療后大鼠血清E2水平升高可能是來源于補足的氣血精微，以促進優(yōu)勢卵泡的發(fā)育。

滋腎育胎丸與二甲雙胍對降低LH 和VEGF 具有交互作用，可能與其作用的靶點相同有關(guān)。HMGB1 與VEGF 蛋白的過表達有密切關(guān)系，高表達HMGB1 可直接作用于血管內(nèi)皮細胞或間接作用于巨噬細胞上的受體，上調(diào)NF?κB，促進VEGF 生成［18］。本研究推測滋腎育胎丸聯(lián)合二甲雙胍對VEGF 過表達的治療作用可能與抑制HMGB1 信號通路活性有關(guān)，實驗結(jié)果顯示，滋腎育胎丸與二甲雙胍均可通過降低子宮組織HMGB1 及其配體RAGE 的表達，達到抑制VEGF 過表達的目的，這可能是滋腎育胎丸聯(lián)合二甲雙胍治療腎虛型PCOS 的作用機制之一。