金鐵鎖提取物對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠滑膜組織自噬與凋亡的研究

韋迎春 錢子剛 普元柱崔萌 周興悅 郭榮伶 陳海豐

（云南中醫(yī)藥大學(xué)， 云南 昆明650500）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種慢性自身免疫性疾病，主要病理特征為炎癥反應(yīng)、滑膜增生、關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞等［1］，全球發(fā)病率達(dá)1%［2］。研究表明，自噬在機(jī)體中的失衡與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎息息相關(guān)［3］。一般情況下，自噬作為機(jī)體的保護(hù)機(jī)制可減輕抗原微生物、異常蛋白等產(chǎn)生的危害，但有研究發(fā)現(xiàn)，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜細(xì)胞中存在高水平自噬，從而導(dǎo)致滑膜細(xì)胞抗凋亡，異常增殖的滑膜細(xì)胞侵襲軟骨及骨組織導(dǎo)致持續(xù)炎癥和關(guān)節(jié)損傷［4］。因此，降低滑膜細(xì)胞的自噬水平將是研究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療機(jī)制的重要方向。

中醫(yī)根據(jù)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病因病機(jī)將其歸屬于“痹癥”范疇，治療原則為祛風(fēng)除濕，散寒止痛［5］。石竹科植物金鐵鎖首載于《滇南本草》，具有祛風(fēng)除濕、散瘀止痛、解毒消腫之功，作用于風(fēng)濕痹痛，跌打損傷等病癥［6］，臨床上金鐵鎖在許多具有消炎止痛功效的中成藥中發(fā)揮重要作用［7］?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，金鐵鎖治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制可能與其抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫的作用有關(guān)［8］。本研究將通過探究金鐵鎖提取物對(duì)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠滑膜組織中細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡的影響，為金鐵鎖治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 100 只清潔級(jí)雄性C57BL／6 小鼠，7～8 周齡，體質(zhì)量15～18 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2019?0004。小鼠飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（滇）2017?0005，小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后開始實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)審查合格（編號(hào)R?06202043）。

1.2 試劑與藥物 金鐵鎖，購自云南綠生中草藥開發(fā)有限公司，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)楊竹雅副教授鑒定為石竹科植物金鐵鎖Psammosilene tunicoidesW.C.Wu et C.Y.Wu 的干燥根。硫酸羥氯喹片（自噬抑制劑，批號(hào)191070）購自上海上藥中西制藥有限公司；雞Ⅱ型膠原（批號(hào)190463）、弗氏完全佐劑（批號(hào)200262）均購自美國Chondrex 公司；caspase?3 多克隆抗體（批號(hào)20657?1?AP）、LC3 多克隆抗體（批號(hào)14600?1?AP）、Beclin?1 多克隆抗體（批號(hào)11306?1?AP）、P62／SQSTM1 多克隆抗體（批號(hào)18420?1?AP）、β?actin 單克隆抗體（批號(hào)66009?1?lg）、GAPDH 單克隆抗體（批號(hào)66004?1?lg）、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)SA00001?2）、辣根過氧化物 酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 二抗（批號(hào)SA00001?1）均購自美國Proteintech 公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)P0010）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 Axio Vert.A1 型倒置顯微鏡購自德國蔡司公司；DYY?6D 型電泳儀購自北京六一生物科技有限公司；Chemstud 型多功能分子凝膠成像系統(tǒng)購自德國耶拿公司；組織高速冷凍勻漿機(jī)購自武漢賽維爾生物科技有限公司；Spark10M 型酶標(biāo)儀購自帝肯（上海）貿(mào)易有限公司；SW?CJ?1D 型超凈工作臺(tái)購自上海昕儀儀器儀表有限公司；Neofuge 15R 型高速冷凍離心機(jī)購自力康生物醫(yī)療科技控股有限公司。

2 方法

2.1 金鐵鎖提取物制備 稱取適量金鐵鎖干燥粉末，加5倍量75%乙醇回流提取3次，濾過，合并濾液，濃縮，回收乙醇，即得金鐵鎖提取物，出膏率為0.387 9%。給藥前用生理鹽水稀釋至低、高劑量（75.65、302.60 mg／kg），相當(dāng)于臨床等效劑量、4 倍劑量。

2.2 造模、分組及給藥 每只小鼠尾根部皮下注射0.1 mL雞Ⅱ型膠原與完全弗氏佐劑等比混合乳劑（每0.1 mL 含100 μg 膠原），記為首次免疫，首次免疫第21天，以相同方法進(jìn)行二次加強(qiáng)免疫［9?10］。二次免疫后第16天，將造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型組、羥氯喹組（52 mg／kg）及金鐵鎖低、高劑量組（75.65、302.60 mg／kg），每組10只，另取未造模的10 只小鼠作為正常組。分組后當(dāng)天開始給藥，給藥組灌胃給予相應(yīng)劑量藥物，正常組和模型組灌胃給予等量生理鹽水，連續(xù)21 d。

2.3 小鼠關(guān)節(jié)炎損傷程度評(píng)價(jià)

2.3.1 關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分 致炎后，每隔3 d 對(duì)小鼠后肢進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評(píng)分，記錄關(guān)節(jié)炎病變程度。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［11］為0分，無明顯紅腫；1分，踝、腕關(guān)節(jié)或單個(gè)足趾輕度紅腫；2分，踝或腕關(guān)節(jié)中度紅腫；3分，整個(gè)足包括足趾嚴(yán)重紅腫；4分，四肢嚴(yán)重發(fā)炎，多關(guān)節(jié)受累病變。

2.3.2 足腫脹度檢測(cè) 使用排水容積法測(cè)量各組小鼠左右后足足跖容積，以小鼠造模前后足跖容積差度指示小鼠足跖的炎癥程度。足腫脹率＝［（致炎后足跖平均容積?致炎前足跖平均容積）／致炎前足跖平均容積］ ×100%。

2.3.3 關(guān)節(jié)病理組織學(xué)檢查 將右后肢標(biāo)本在10%中性福爾馬林中固定24 h，經(jīng)EDTA 脫鈣后包埋在石蠟中，切成5 μm厚的組織切片，進(jìn)行HE 及番紅O?固綠染色，在100倍光學(xué)顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)組織病理變化。

2.4 TUNEL 法檢測(cè)小鼠關(guān)節(jié)組織細(xì)胞凋亡情況 組織切片轉(zhuǎn)移至二甲苯中脫蠟，并在乙醇中水化，然后用50 μL蛋白酶?K 溶液覆蓋樣品，室溫下培養(yǎng)15～30 min，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行TUNEL 染色，于在高倍鏡下（×400）對(duì)至少有100 個(gè)細(xì)胞的3 個(gè)隨機(jī)視野進(jìn)行觀察，計(jì)算TUNEL陽性細(xì)胞的百分比。

2.5 Western blot 法檢測(cè)小鼠滑膜組織中自噬和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 稱取適量小鼠滑膜組織，加RIPA 裂解液進(jìn)行勻漿，提取總蛋白，蛋白定量后加樣，恒壓電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉2 h，TBST 洗滌，加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌，加入二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記）室溫孵育2 h，TBST 洗滌，加入ECL 化學(xué)發(fā)光顯影液顯色，暗室曝光，拍照，使用Image J 軟件對(duì)圖像的灰度值進(jìn)行分析。

2.6 免疫熒光共聚焦檢測(cè)LC3、p62 蛋白表達(dá) 制備小鼠關(guān)節(jié)切片，待切片干燥，滴加破膜工作液，室溫放置20 min，PBS 洗滌，滴加3%牛血清蛋白封閉液，室溫封閉30 min，甩掉封閉液，滴加PBST 稀釋的一抗，于濕盒中4 ℃孵育過夜，PBST 洗滌，滴加熒光標(biāo)記二抗，室溫避光孵育60 min，PBST 洗滌，滴加DAPI 染液復(fù)染核，室溫避光孵育15 min，PBST 洗滌，稍甩干玻片，滴加抗熒光淬滅封片液封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察LC3、p62 蛋白熒光強(qiáng)度。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過GraphPad Prism 8.0.2 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 金鐵鎖提取物對(duì)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分的影響 二次免疫后，小鼠的踝關(guān)節(jié)、足跖多關(guān)節(jié)逐漸出現(xiàn)明顯紅腫，16 d 時(shí)模型組小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分均大于4分，表明造模成功［12］，且正常組小鼠均無關(guān)節(jié)炎癥狀。如表1 所示，除正常組外，各組小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分逐漸升高，在21 d 達(dá)到峰值后開始降低。與模型組比較，29 d后羥氯喹組關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分降低（P＜0.01），33 d 后金鐵鎖各劑量組和羥氯喹組關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分均降低（P＜0.01）。

表1 金鐵鎖提取物對(duì)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分的影響（分，，n＝10）

表1 金鐵鎖提取物對(duì)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分的影響（分，，n＝10）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01。

3.2 金鐵鎖提取物對(duì)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠足腫脹的影響 二次免疫當(dāng)日測(cè)量小鼠左右后足足跖容積作為致炎前足跖容積，致炎前各組小鼠足跖容積比較無差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)期間正常組小鼠足跖容積未發(fā)生明顯變化（P＞0.05），提示正常組小鼠未出現(xiàn)足腫脹病變。與正常組比較，16 d 后模型組小鼠足腫脹度升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，金鐵鎖高劑量組給予藥物干預(yù)21 d 后抑制了小鼠足腫脹度（P＜0.05，P＜0.01），33 d 后金鐵鎖各劑量組和羥氯喹組小鼠足腫脹度降低（P＜0.01），見表2。

表2 金鐵鎖提取物對(duì)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠左右后足足腫脹度的影響（%，，n＝10）

3.3 金鐵鎖提取物對(duì)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)病理組織學(xué)損傷程度的影響 如圖1 所示，正常組小鼠關(guān)節(jié)面平滑，軟骨及骨組織無明顯損傷，無明顯炎性細(xì)胞浸潤；模型組小鼠關(guān)節(jié)組織滑膜成纖維細(xì)胞增生，滑膜組織增厚，炎性細(xì)胞浸潤較為嚴(yán)重，關(guān)節(jié)面出現(xiàn)明顯損傷導(dǎo)致關(guān)節(jié)面不平滑，軟骨細(xì)胞（紅色）明顯增加，符合類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的基本病理學(xué)特征，表明膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型造模成功；金鐵鎖各劑量組小鼠關(guān)節(jié)組織炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，正常組增加但較模型組減少。提示，金鐵鎖提取物對(duì)小鼠關(guān)節(jié)及軟骨有一定的保護(hù)作用，可有效緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病癥。

圖1 各組小鼠關(guān)節(jié)組織切片病理變化（×100）

3.4 金鐵鎖提取物對(duì)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)滑膜組織細(xì)胞凋亡的影響 如圖2 所示，與正常組比較，模型組小鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中滑膜細(xì)胞陽性染色（棕色）細(xì)胞減少；與模型組比較，羥氯喹組小鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞凋亡陽性率增加（P＜0.05），金鐵鎖各劑量組小鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞凋亡陽性率增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示，模型小鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞凋亡受到抑制，而藥物干預(yù)后細(xì)胞凋亡增加。

圖2 金鐵鎖提取物對(duì)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠滑膜組織細(xì)胞凋亡的影響（，n＝10）

3.5 金鐵鎖提取物對(duì)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠滑膜組織中自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組小鼠滑膜組織Beclin?1、Bcl?2 蛋白表達(dá)和LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比值升高（P＜0.05，P＜0.01），p62、caspase?3 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與模型組比較，羥氯喹組和金鐵鎖高劑量組小鼠滑膜組織Beclin?1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），caspase?3 蛋白表達(dá)升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），金鐵鎖各劑量組p62 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），金鐵鎖高劑量組Bcl?2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見圖3。

圖3 金鐵鎖對(duì)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠滑膜組織中自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（，n＝10）

3.6 金鐵鎖提取物對(duì)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠滑膜組織中LC3、p62 蛋白表達(dá)的影響 如圖4 所示，與正常組比較，模型組小鼠滑膜組織LC3 蛋白表達(dá)增加（P＜0.05），而p62蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）；與模型組比較，羥氯喹組和金鐵鎖各劑量組小鼠滑膜組織LC3、p62 熒光強(qiáng)度均增強(qiáng)（P＜0.05），提示小鼠滑膜組織中LC3 與p62 蛋白表達(dá)增加。

圖4 金鐵鎖提取物對(duì)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠滑膜組織中LC3、p62 蛋白表達(dá)的影響（，n＝10）

4 討論

在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中，滑膜細(xì)胞的持續(xù)異常增殖與滑膜組織增厚、持續(xù)炎癥等密切相關(guān)。因此，促進(jìn)滑膜細(xì)胞凋亡成為研究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療機(jī)制的關(guān)鍵途徑之一［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，金鐵鎖提取物干預(yù)后小鼠滑膜組織細(xì)胞凋亡增加，滑膜增生、軟骨損傷與炎性細(xì)胞浸潤等情況得到改善。

越來越多研究表明，自噬在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中不僅參與了炎癥反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞凋亡也具有一定的調(diào)控作用，是重要的作用靶點(diǎn)之一［14?16］。當(dāng)自噬被激活，上游信號(hào)啟動(dòng)，磷酸化自噬標(biāo)志蛋白Beclin?1 誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生［17］。Beclin?1 激活后，從Beclin?1／Bcl?2復(fù)合物中分離，重新形成Beclin?1／VPS34 復(fù)合物促進(jìn)自噬體的形成［18?19］。本研究發(fā)現(xiàn)，金鐵鎖提取物有效抑制了小鼠滑膜組織中Beclin?1 和Bcl?2 蛋白表達(dá)，上調(diào)了caspase?3 蛋白表達(dá)。提示，金鐵鎖提取物可能通過靶向Beclin?1／Bcl?2 復(fù)合物，干擾Beclin?1 與Bcl?2 的相互作用，抑制自噬體的形成，對(duì)自噬和凋亡起到調(diào)控作用。

在自噬體形成后期，LC3 被Atg4 切割，LC3Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3Ⅱ后定位到自噬體膜上。LC3Ⅱ可以穩(wěn)定標(biāo)示自噬小體的形成，是最常用的自噬特異性標(biāo)志物，自噬體成熟后與溶酶體結(jié)合，進(jìn)一步降解其內(nèi)容物，因此，常以LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比值與自噬底物p62 表達(dá)共同指示自噬通量［20］。通常LC3Ⅱ／LC3Ⅰ上調(diào)提示自噬小體形成增加，自噬的降解伴隨著p62 表達(dá)的下降。如果自噬溶酶體降解受到抑制，也會(huì)導(dǎo)致p62 的積累［21?22］，自噬抑制劑羥氯喹正是通過阻斷自噬體的降解抑制自噬［23］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，金鐵鎖提取物可能發(fā)揮著類似于羥氯喹的作用，通過抑制自噬體的降解，降低自噬水平，從而改善小鼠關(guān)節(jié)炎癥。有研究表明，自噬?溶酶體途徑和泛素?蛋白酶體途徑共同擔(dān)負(fù)著細(xì)胞內(nèi)降解錯(cuò)誤折疊蛋白的職責(zé)，當(dāng)其中一條途徑受到抑制，另一條途徑活性會(huì)代償性增加，以維持機(jī)體內(nèi)平衡［24?25］。因此，金鐵鎖提取物對(duì)自噬?溶酶體途徑的影響是否也影響著泛素?蛋白酶體途徑，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)金鐵鎖提取物治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥效機(jī)制可能是通過抑制自噬體的形成，抑制自噬體降解，下調(diào)自噬水平，同時(shí)促進(jìn)滑膜組織中細(xì)胞凋亡，從而改善滑膜異常增生及滑膜增生引起的炎癥及軟骨損傷。