靶向藥物聯(lián)合應(yīng)用對肝癌細胞SK-Hep-1增殖的影響及其機制

朱曉霞，賈瑜琦*，劉暢，弓韜，李高鵬，張宏偉，于保鋒

0 引言

對于單一驅(qū)動增殖的癌癥，通過靶向相應(yīng)的靶點，阻斷增殖驅(qū)動因子，能夠?qū)崿F(xiàn)精準有效的治療。例如，西妥昔單抗等藥物通過靶向表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）有效治療頭頸部鱗狀細胞癌[1-2]和非小細胞肺癌[3]；伊馬替尼通過靶向BCR-ABL酪氨酸激酶，能顯著提高慢性髓性白血病患者的長期生存[4]；曲妥珠單抗和帕妥珠單抗作用于HER2，可以顯著降低早期HER2陽性乳腺癌患者腦轉(zhuǎn)移的風(fēng)險[5]。

然而，大多數(shù)實體瘤具有多驅(qū)動增殖的特點，單獨阻斷某一增殖驅(qū)動因子并不能抑制實體瘤的發(fā)展。前期研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌發(fā)病風(fēng)險升高和12個基因的錯義突變或蛋白截斷變異密切相關(guān)[6]；KRAS、NRAS、PI3KCA、BRAF等基因的變異累積能促進結(jié)腸癌腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7-9]；黑色素瘤中攜帶至少10個驅(qū)動因子突變[10]。

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）與多基因突變密切相關(guān)，這些突變引起相關(guān)信號通路的激活或抑制能影響肝細胞的異常增殖與分化[11-12]。研究表明，BRAF和PIK3CA基因突變在體細胞水平上促進肝癌的發(fā)生[13]，肝癌細胞中RAS基因的低表達調(diào)節(jié)異常與腫瘤的異質(zhì)性有關(guān)[14]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）信號通路是BRAF和RAS基因發(fā)揮調(diào)控作用的基礎(chǔ)，MAPK通路的下游信號系統(tǒng)為Ras/Raf/MEK/ERK，當機體因應(yīng)激引起該信號通路激活時，這兩種基因（BRAF和RAS兩種突變在同一腫瘤細胞中同時表達的情況很少見，且即使在單細胞水平上同時表達，兩者發(fā)揮作用也是相互獨立的[15-16]）就會發(fā)揮MAPK激酶激酶（MAPKKK）作用，進一步激活ERK，從而調(diào)控細胞的周期及凋亡[17]。PIK3CA突變可提高下游激酶PI3Ks的活性，激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，減少細胞凋亡，并促進腫瘤浸潤[18]。因此肝癌的發(fā)生是多驅(qū)動且多步驟的，進一步了解相關(guān)發(fā)病機制是挖掘潛在抗癌藥物的基石。

本研究選用SK-Hep-1肝癌細胞株，從分子和細胞層面了解肝癌多驅(qū)動增殖的發(fā)病機制；通過建立更有效的數(shù)學(xué)模型，量化藥物對細胞的作用；采用不同的組合，發(fā)掘有效的協(xié)同藥物，為臨床研究開發(fā)潛在的用藥組合。

1 材料與方法

1.1 細胞株

SK-Hep-1肝癌細胞購于中科院上海細胞庫，細胞系STR（cell line authentication by STR profiling）鑒定正確，細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 藥物

本實驗所用藥物均為蛋白激酶抑制劑，見表1。

表1 本實驗所用藥物Table 1 All drugs used in this study

1.3 主要試劑及儀器

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購于美國Hyclone公司；0.25%胰蛋白酶（含EDTA）、青鏈霉素混合液（100×）、MTT、DMSO、SDS、Tris、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、PVDF膜均購于北京索萊寶生物有限公司；Tween-20、RIPA蛋白裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑、5×SDS-PAGE蛋白質(zhì)上樣緩沖液、BCA定量試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司；一抗Src/p-Src、一抗Mek/p-Mek、一抗Erk/p-Erk、一抗PDK1/p-PDK1、一抗AKT/p-AKT、一抗BRAF/p-BRAF、一抗MET/p-MET均購于美國CST公司；一抗GAPDH購于北京中杉金橋生物有限公司；彩虹180廣譜蛋白Marker（11～180 kD）購于北京Solarbio公司；辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗均購于上海Santa Cruz公司；熒光顯微鏡購于日本Olympus公司；細胞培養(yǎng)箱、凝膠成像儀均購于美國Bio-Rad公司；酶標儀購于美國BioTek公司；蛋白電泳儀、垂直電泳槽、半干轉(zhuǎn)膜儀均購于北京六一儀器廠。

1.4 MTT法測定細胞增殖能力

將SK-Hep-1細胞按1×103個/孔接種至96孔板，24 h后加藥處理，每種藥物設(shè)16個濃度（20 μmol/L倍比稀釋直至0.6 nmol/L）處理細胞，72 h后加入50 μl MTT溶液（5 mg/ml），避光孵育4 h。棄掉MTT，加入200 μl DMSO，使用BioTek酶標儀于490 nm和750 nm波長處檢測每孔吸光度（OD）值。每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，每個實驗重復(fù)3次，使用SPSS22.0軟件計算各種藥物的IC50值。

1.5 細胞經(jīng)藥物處理后的動力學(xué)分析

根據(jù)SK-Hep-1細胞對各種藥物的IC50值，制作單靶點動力學(xué)分析曲線，定量了解SK-Hep-1細胞對藥物的動態(tài)和復(fù)雜反應(yīng)。單靶點動力學(xué)分析曲線遵守如下公式：I=[D]/（[D]+IC50），I是相對抑制率，[D]是藥物濃度。雙相抑制曲線遵守如下公式：I=F1x[D]/（[D]+Kd1）+F2x[D]/（[D]+Kd2）。I是細胞經(jīng)藥物處理后的增殖抑制率，F(xiàn)1是細胞中對藥物敏感的部分，Kd是計算出來的最佳擬合參數(shù)，Kd1是敏感部分細胞的Kd，表示藥物對靶細胞的親和力，F(xiàn)2是細胞中對藥物不敏感的部分，Kd2是不敏感部分細胞的Kd，表示藥物對靶細胞的脫靶毒性。該雙相公式要求F1+F2=1。擬合曲線為三次獨立重復(fù)試驗的平均結(jié)果，并計算擬合曲線的殘差平方和（the sums of squared residues,SSR）。

1.6 Western blot實驗

SK-Hep-1細胞融合程度達到70%時，使用2.50 μmol/L crizotinib，2.50 μmol/L dasatinib，0.15 μmol/L HG6-64-1和12.00 μmol/L MK-2206處理SK-Hep-1細胞，2 h后提取細胞內(nèi)總蛋白，運用BCA法在酶標儀中于562 nm波長處檢測樣品蛋白濃度，配置12%SDS-PAGE凝膠，上樣、電泳，半干轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉，TBST洗滌3次，孵育一抗（Src、p-Src、Mek、p-Mek、Erk、p-Erk、PDK1、p-PDK1、AKT、p-AKT、BRAF、p-BRAF、Met、p-Met、GAPDH）。4℃慢搖過夜，TBST洗滌3次，孵育二抗，室溫慢搖孵育1 h，TBST洗滌3次，凝膠成像顯影，Image J軟件分析目的條帶蛋白表達水平。

1.7 藥物聯(lián)合曲線繪制

按1.3的方法對細胞進行藥物聯(lián)合處理后，計算IC50及IC70，并根據(jù)Chou-Talalay公式計算劑量減少指數(shù)（dose reduction index,DRI），評價藥物組合與單藥比較達到相同抑制水平減少藥物濃度的倍數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有實驗均獨立重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標準差顯示。兩個樣本均數(shù)之間采用獨立樣本t檢驗，多個樣本均數(shù)之間采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SK-Hep-1細胞敏感藥物確定

實驗結(jié)果顯示：SK-Hep-1細胞對HG6-64-1敏感，IC50為0.027±0.007 μmol/L，但單藥HG6-64-1對SK-Hep-1細胞的抑制率不能達到100%。dasatinib、crizotinib和sunitinib是能作用于不同信號通路靶點的蛋白激酶抑制劑，在本課題組先前的研究[19]中已經(jīng)證實這三種藥物能有效地抑制SKHep-1細胞的活力，且IC50分別為0.842±0.083、0.796±0.060和0.568±0.070 μmol/L，SK-Hep-1細胞對MK-2206不敏感，IC50為4.011±0.507 μmol/L，見表2。這些研究表示SK-Hep-1細胞對多種藥物敏感，提示其可能有多種獨立驅(qū)動因子。

表2 不同藥物對肝癌細胞SK-Hep-1增殖抑制的IC50和IC70值Table 2 IC50 and IC70 values of inhibition of the proliferation of SK-Hep-1 cells by different drugs

2.2 SK-Hep-1細胞對不同藥物的動力學(xué)分析

單靶點動力學(xué)分析結(jié)果顯示：HG6-64-1和dasatinib對SK-Hep-1細胞的實際抑制情況與最佳擬合結(jié)果相比，SSR為0.187和0.432，擬合效果不佳。在低濃度藥物范圍，最佳擬合結(jié)果比實際抑制率高很多，而在高濃度藥物范圍，最佳擬合結(jié)果比實際抑制率又低很多。Crizotinib、sunitinib和MK-2206這三種藥物處理的細胞中也發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象，但差異并不顯著，SSR值分別為0.027、0.042、0.125，見圖1（左側(cè)）。由此可見，單靶點動力學(xué)分析曲線不能準確反映 SK-Hep-1細胞對這五種靶向藥物的反應(yīng)。

于是，我們猜測細胞對藥物的反應(yīng)是雙相的。雙相分析曲線顯示：最佳擬合結(jié)果與實際抑制率擬合效果較好，SSR值分別為0.029、0.021、0.004、0.019、0.058，見圖1（右側(cè)）。提示雙相動力學(xué)曲線更能準確反映不同藥物對SK-Hep-1細胞的抑制情況。

進一步分析雙相變化，SK-Hep-1細胞經(jīng)HG6-64-1處理后分為兩部分：F1部分占（76.1±5.8）%，Kd1是10.8±6.7 nmol/L；F2部分占（23.9±5.8）%，Kd2是4.4±2.2 μmol/L。因F1是藥物發(fā)揮抑制作用最重要的部分，幾乎所有的抑制活動都在此處發(fā)生，可見76.8%的F1和10.4 nmol/L的Kd1比IC50=0.027 μmol/L更能準確反映藥物和靶點之間的關(guān)系，見圖1A。SK-Hep-1細胞對其他藥物的反應(yīng)也能夠類似地分解為這四個參數(shù)，見表3。可見藥物靶向特異性作用能阻斷具有高親和力的驅(qū)動因子使F1抑制，而藥物的非特異性脫靶作用能導(dǎo)致F2抑制，這一結(jié)果與我們的猜測一致。

圖1 SK-Hep-1細胞經(jīng)蛋白激酶抑制劑抑制的動力學(xué)分析Figure 1 Kinetic analysis of SK-HEP-1 cells inhibited by protein kinase inhibitors

表3 肝癌細胞SK-Hep-1經(jīng)蛋白激酶抑制劑處理后的單相和雙相動力學(xué)分析Table 3 Single-phase and two-phase kinetics analysis of SK-Hep-1 cells treated with protein kinase inhibitors

2.3 藥物作用的信號通路

為驗證HG6-64-1、dasatinib、MK-2206和crizotinib在SK-Hep-1細胞中阻斷的驅(qū)動因素，我們檢測了每種藥物作用的關(guān)鍵信號蛋白水平。Western blot結(jié)果顯示：crizotinib能強烈抑制Met磷酸化，也能較小程度抑制Akt磷酸化。HG6-64-1能完全抑制Akt磷酸化，部分抑制BRAF磷酸化和Mek磷酸化。dasatinib能完全抑制Y416位點和Y527位點Src磷酸化，也能較小程度抑制Mek和Erk磷酸化。MK-2206能完全抑制Akt磷酸化，也能夠輕微抑制Mek和Erk磷酸化，見圖2。上述結(jié)果證明HG6-64-1、dasatinib、MK-2206和crizotinib通過抑制不同信號通路的關(guān)鍵成員阻斷某一信號通路，對細胞增殖造成影響，并且也能交叉抑制相同通路，起到協(xié)同增強作用，也間接證明了SK-Hep-1細胞的多驅(qū)動增殖。

2.4 藥物聯(lián)合使用對SK-hep-1細胞增殖的影響

通過雙相分析得出，F(xiàn)1部分的數(shù)值越大，藥物對細胞的抑制作用越好。但僅單藥作用時，即使是SK-Hep-1細胞非常敏感的藥物HG6-64-1也不能達到100%抑制。我們猜想將F1部分靶點不重合的抑制劑進行組合，可能會產(chǎn)生強協(xié)同效應(yīng)。由表3可知，10.8 nmol/L的HG6-64-1能夠抑制約76%的SK-Hep-1細胞增殖，因此，我們試著尋找可以抑制剩余細胞增殖的藥物。SK-Hep-1細胞中約30%對dasatinib敏感，約6%對crizotinib敏感，約7%對sunitinib敏感，約15%對MK-2206敏感，見表3。將HG6-64-1分別與dasatinib、crizotinib和sunitinib聯(lián)用，結(jié)果顯示，從劑量-效應(yīng)曲線可見：在低濃度區(qū)間（6.104×10-4μmol/L～6.25×10-1μmol/L），HG6-64-1與dasatinib的協(xié)同作用要優(yōu)于HG6-64-1與crizotinib和HG6-64-1與MK-2206，HG6-64-1與sunitinib沒有協(xié)同作用（數(shù)據(jù)未顯示）；在高濃度（1.25 μmol/L～20 μmol/L）區(qū)間，HG6-64-1與crizotinib的協(xié)同作用更優(yōu)，見圖3。從劑量減量曲線可見：細胞存活率為10%時，DRI約為2；細胞存活率為70%時，DRI升高至6左右，可知細胞存活率為70%時，HG6-64-1和crizotinib兩藥聯(lián)合的效果約為單藥處理的6倍，見圖3A。細胞存活率為20%時，DRI約為5；細胞存活率為60%時，DRI升高至14左右，可知細胞存活率為60%時，HG6-64-1和dasatinib兩藥聯(lián)合的效果約為單藥處理的14倍，見圖3B。因此，我們可以證實HG6-64-1和dasatinib兩藥聯(lián)合對SK-Hep-1細胞增殖的抑制作用更佳，在0.6 μmol/L時抑制率能達到30%～40%。

進一步分析HG6-64-1與dasatinib聯(lián)用的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)：在低濃度區(qū)間，dasatinib能使SK-Hep-1細胞中對HG6-64-1敏感的部分變得更敏感；在高濃度區(qū)間對HG6-64-1不敏感的部分對dasatinib也不敏感，見圖3B。為了使高濃度區(qū)間藥物對細胞的抑制作用更顯著，我們需選用一種可以使HG6-64-1和dasatinib聯(lián)用也不敏感的部分變得敏感的藥物。而在高濃度區(qū)間，crizotinib顯示與HG6-64-1藥物聯(lián)合的協(xié)同作用更好，于是我們將crizotinib與dasatinib和HG6-64-1聯(lián)合處理SK-Hep-1細胞，但結(jié)果顯示協(xié)同作用不顯著（數(shù)據(jù)未顯示）。因此，我們從不同藥物作用靶點出發(fā)，根據(jù)圖2可知：crizotinib能夠完全抑制Met磷酸化；HG6-64-1能夠部分抑制BRAF磷酸化，完全抑制Akt磷酸化；dasatinib是一種Src抑制劑。于是我們篩選靶點是Akt但F1高于10%的藥物。MK-2206是Akt的特異性抑制劑，F(xiàn)1約為15%，將HG6-64-1與dasatinib和MK-2206聯(lián)用，觀察能否降低高濃度區(qū)域不敏感的細胞比例。結(jié)果顯示：MK-2206顯著降低了高濃度區(qū)間對HG6-64-1不敏感的細胞比例，見圖3C。HG6-64-1、dasatinib和MK-2206單藥的IC50分別為0.027±0.007、0.842±0.083和4.011±0.507 μmol/L，IC70分別為0.094±0.016、5.444±2.530和8.193±0.216 μmol/L，而三藥聯(lián)合的IC50僅為0.003±0.001 μmol/L，IC70僅為0.017±0.009 μmol/L，見圖3D、表2。以上結(jié)果表明，HG6-64-1、dasatinib和MK-2206三藥聯(lián)用能夠有效抑制SK-Hep-1細胞增殖。

圖2 SK-Hep-1細胞經(jīng)蛋白激酶抑制劑處理的信號通路分析Figure 2 Signaling pathway analysis of SK-HEP-1 cells treated with protein kinase inhibitors

圖3 靶向不同蛋白激酶藥物對SK-Hep-1細胞增殖的的協(xié)同抑制作用Figure 3 Synergistic inhibitory effect of different protein kinase drugs on SK-Hep-1 cell proliferation

3 討論

肝癌SK-Hep-1細胞株本身具有BRAFV600E突變[20-21]，BRAF是MAPK（Ras-Raf-MEK-ERK）通路的成員，并通過該通路介導(dǎo)細胞對生長信號的反應(yīng)，特別是激活BRAF能參與細胞周期進程的持續(xù)誘導(dǎo)[13]。HG6-64-1是有效選擇性的BRAF抑制劑[22]，能顯著抑制BRAF磷酸化激活。SK-Hep-1細胞對HG6-64-1非常敏感，IC50值僅為0.027±0.007 μmol/L。在高侵襲性癌細胞系中，受體酪氨酸激酶能夠促進腫瘤細胞的遷移和侵襲，且在肝癌SK-Hep-1細胞中也已被證實通過化學(xué)抑制或mRNA沉默受體酪氨酸激酶家族中的DDR1（discoidin domain receptorⅠ）能夠降低AKT和ERK磷酸化，從而減少癌細胞的增殖和遷移[23]。本課題組已從一組酪氨酸激酶抑制劑中篩選出三種對SK-Hep-1細胞敏感的抑制劑，分別為dasatinib、crizotinib和sunitinib[19]。因此，我們推測SK-Hep-1肝癌細胞有多種獨立驅(qū)動因子參與細胞增殖。

一般使用IC50值反映細胞對藥物的敏感度，并根據(jù)IC50值繪制單靶點抑制曲線。但由圖1可知，單靶點抑制曲線與每種藥物的實際抑制作用之間存在偏差，說明單靶點抑制曲線在本研究中并不能準確描述藥物作用情況。癌細胞一般由多個致癌因子獨立驅(qū)動，使用靶向某個靶點的激酶抑制劑只能部分抑制細胞增殖，使用某濃度的激酶抑制劑也可能同時影響成百上千個蛋白激酶。受影響的某些激酶可能與細胞增殖不直接相關(guān)，但抑制這些激酶可能會導(dǎo)致細胞毒性。因此可見，多驅(qū)動增殖細胞對某一激酶抑制劑的反應(yīng)是兩種作用的混合：當藥物抑制細胞敏感部分時，藥物對細胞存在靶點特異性；當藥物作用于細胞不敏感部分時，藥物對細胞存在脫靶毒性。靶點特異性抑制是靶向治療的基礎(chǔ)，但脫靶毒性可能會限制靶向治療的有效性。綜上，準確區(qū)分靶點特異性抑制和脫靶毒性有助于更好地開發(fā)針對多驅(qū)動增殖細胞的聯(lián)合靶向治療策略。

本文選用雙相數(shù)學(xué)模型，定量描述多驅(qū)動增殖SK-Hep-1肝癌細胞對靶向藥物治療的反應(yīng)。雙相動力學(xué)模型中F1、F2分別表示癌細胞中對某一激酶機制劑的敏感和抗性部分；Kd1表示藥物對靶細胞的親和力；Kd2表示藥物對靶細胞的脫靶毒性。如果一個靶細胞是單驅(qū)動增殖的，藥物反應(yīng)就變成了一種極端情況，F(xiàn)1變成了100%或接近100%，F(xiàn)2階段消失。在這種情況下增大F1的占比，藥物對細胞的抑制作用越明顯，脫靶毒性越小，治療效果越好。一種癌細胞有多個獨立驅(qū)動因素時，如果有一種完全可以與驅(qū)動因素單獨作用的理想靶向藥物，該藥也只能部分抑制細胞增殖。當一種以上具有明顯F1效應(yīng)的藥物對癌細胞有抑制作用時，將這些藥物聯(lián)合使用能更有效地阻斷細胞活力，實現(xiàn)藥物劑量顯著降低。因此，雙相分析不僅能有效評估多驅(qū)動增殖癌細胞對藥物的反應(yīng)，也能為靶向治療提供新的框架。

大多數(shù)癌癥依賴多驅(qū)動因素實現(xiàn)增殖，需要合理的藥物組合進行靶向治療。常規(guī)的藥物組合離不開經(jīng)驗篩選和不斷探索。本研究將HG6-64-1、dasatinib和MK-2206三藥聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)三藥聯(lián)合的IC50和IC70與單藥處理相比顯著降低，說明這三藥組合能夠有效抑制SK-Hep-1細胞增殖。通過機制研究發(fā)現(xiàn)，這三種藥物的作用靶點既有重合，也有不同，能夠顯著抑制Akt磷酸化和Src磷酸化，部分抑制BRAF磷酸化和Mek磷酸化。這些靶點與Ras/Raf/Mek/Erk和PI3K/Akt/mTOR信號通路有關(guān)，說明SK-Hep-1細胞增殖與這兩種通路密切相關(guān)，與之前的報道一致[24]。我們先前的研究也證實dasatinib對SK-Hep-1細胞最可能的靶點是Src家族激酶[18]，因此本次的藥物組合結(jié)果有效。相關(guān)研究也證實，HGF/Met/JNK信號通路在肝硬化向肝癌發(fā)展的過程中具有一定作用[25]。Crizotinib是有效的c-Met抑制劑[26]，單藥也能夠抑制SK-Hep-1細胞增殖（IC50=0.796±0.060 μmol/L,IC70=2.155±0.076 μmol/L），但抑制效果不明顯，說明Met并不是SK-Hep-1肝癌細胞增殖的主要靶點。Western blot結(jié)果表明，crizotinib與dasatinib和HG6-64-1聯(lián)合使用，多數(shù)作用靶點重疊，crizotinib能部分抑制Akt磷酸化，而HG6-64-1能完全抑制Akt磷酸化，說明這三種藥物的結(jié)合并不互補，協(xié)同作用不顯著。本實驗中HG6-64-1、dasatinib和MK-2206這三種藥物聯(lián)用僅在細胞和分子層面表明對SK-Hep-1細胞增殖的有效抑制，今后有望進一步通過在體實驗探討藥物聯(lián)用對肝癌的有效性。

綜上所述，對于多驅(qū)動肝癌細胞SK-Hep-1而言，雙相驅(qū)動分析能更好地反映藥物對細胞的抑制作用。HG6-64-1、dasatinib和MK-2206三藥聯(lián)合應(yīng)用能有效地抑制SK-Hep-1細胞增殖，可能是一種潛在治療肝癌的藥物組合。