ITGAV 在非小細胞肺癌中的表達及其與放射抵抗的關(guān)系

唐園惠，朱圣明，柴晶晶，韓佳慧，田超，鄧鑫州，段奇文

0 引言

肺癌是世界范圍內(nèi)死亡率最高的惡性腫瘤[1]，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌最常見的病理類型[2]。放療是肺癌治療的重要手段之一，但放射抵抗的存在往往限制了非小細胞肺癌治療效果，因此探尋肺癌放療抵抗的新靶標及其潛在分子機制有著重要意義。

整合素是一種跨膜黏附受體，由α和β兩個亞基組成。細胞與細胞外基質(zhì)的黏附主要通過整合素家族實現(xiàn)[3]。整合素可以與多種胞質(zhì)蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，將信號從胞內(nèi)區(qū)傳遞到胞外區(qū)，介導信號轉(zhuǎn)導，在細胞遷移、侵襲、分化、增殖和凋亡相關(guān)基因的表達中發(fā)揮重要作用[4]。整合素信號增強了癌細胞抵抗化學療法和放射療法有害作用的能力[5]。Integrin αV（ITGAV）屬于整合素家族一員，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及不良預(yù)后密切相關(guān)，但其與NSCLC放射抵抗的關(guān)系尚未見報道。

本研究通過公共數(shù)據(jù)庫分析ITGAV在NSCLC中的表達及與患者生存之間的關(guān)系，并在細胞水平上驗證了ITGAV對NSCLC細胞放射敏感度的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人肺腺癌細胞株H1299、A549購自中科院上海細胞庫。ITGAV-siRNA-2913、ITGAV-siRNA-1951、ITGAV-siRNA-1312和陰性對照Negative control FAM均由上海吉瑪公司合成?？贵w均購自美國BOSTER公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司。蛋白裂解液RIPA、5×蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒等均購自碧云天生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析 進入GEPIA數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/），輸入基因名稱ITGAV后，在Datasets Selection窗口選擇“LUAD”、“LUSC”；設(shè)置臨界值設(shè)定條件（｜Log2FC｜Cutoff：0.5，Pvalue Cutoff：0.05），點擊“plot”獲取基因表達差異圖譜。

1.2.2 HPA數(shù)據(jù)庫分析 進入HPA數(shù)據(jù)庫（https://www.proteinatlas.org/），輸入基因ITGAV后，點擊search，點擊“tissue”進入組織圖譜，點擊“l(fā)ung”，獲取相應(yīng)的免疫組織化學切片。

1.2.3 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫進行在線生存分析 進入Kaplan-Meier Plotter [Lung Cancer]欄目（http:/kmplot.com/analysis/index.php?p=service&ca ncer=lung），輸入基因ITGAV后，在Survival窗口選擇總生存期（OS）和無復(fù)發(fā)生存期（RFS），在Radiotherapy窗口選擇yes，點擊Draw Kaplan Meier-plotter，獲取生存曲線。

1.2.4 細胞培養(yǎng) 利用FBS濃度為10%的DMEM培養(yǎng)基，于5%CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)A549、A549R、H1299和H1299R細胞。

1.2.5 非小細胞肺癌放射抵抗株A549R和H1299R細胞的構(gòu)建 將處在對數(shù)生長期的A549和H1299細胞（5×106個/瓶）接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)瓶內(nèi)均加入4 ml含PFS為10%的DMEM培養(yǎng)液，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，2 Gy劑量X射線累計照射28次，總劑量達到56 Gy（照射能量6 MV，照射距離100 cm，照射野15 cm×15 cm，劑量率2 Gy/min，放療設(shè)備Varian Unique），每次照射完畢后繼續(xù)恒溫箱中培養(yǎng)。照射完畢，對培養(yǎng)瓶中的細胞進行單克隆，穩(wěn)定傳代，得到肺癌放射抵抗株A549R和H1299R。

1.2.6 細胞轉(zhuǎn)染 實驗分為ITGAV干擾組和陰性對照組。培養(yǎng)A549R和H1299R細胞使其融合度達50%～70%時，ITGAV siRNA轉(zhuǎn)染：siITGAV的三條干擾序列為：ITGAV-siRNA-2913（F: 5′-CCAC AUUGGUUACCACUAATT-3′，R: 5′-UUAGUGG UAACCAAUGUGGTT-3′）；ITGAV-siRNA-1951（F: 5′-CCCUCUGACAUUGAUUGUUTT-3′，R: 5′-AACAAUCAAUGUCAGAGGGTT-3′）；ITGAV-siRNA-1312（F: 5′-GCAGGUCUCAGUGU CUCUATT-3′，R: 5′-UAGAGACACUGAGACCUG CTT-3′）。陰性對照（negative control,NC）序列為：F: 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，R:5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。收集處于對數(shù)生長期的A549R和H1299R細胞，將細胞密度調(diào)整為2×105個/毫升，接種在6孔板上，按照siRNA mate說明書轉(zhuǎn)染siITGAV和NC組細胞，收集轉(zhuǎn)染48和72 h后的細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.7 qRT-PCR實驗 qRT-PCR實驗收集處對數(shù)生長期的A549R和H1299R細胞，裂解后依據(jù)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟提取RNA，并進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，40個循環(huán)。ITGAV引物序列：F: 5'-ATCTGTGAGGTCGAAACAGGA-3'，R：5'-TGGAGCATACTCAACAGTCTTTG-3'；GAPDH引物序列：F：5'-GGAGCGAGATCCCTC CAAAAT-3'，R：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCA TGG-3'。GAPDH為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt法計算ITGAV相對表達量。

1.2.8 蛋白提取及Western blot檢測 收集約1×106個細胞，提取蛋白，使用BCA法進行定量，取10 μl蛋白，10%SDS-PAGE膠進行電泳，轉(zhuǎn)膜后室溫下于5%的脫脂奶粉中封閉2 h。4℃條件下一抗孵育8 h，室溫條件下二抗孵育2 h，ECL試劑盒顯影。ImagePro Plus 6.0 軟件統(tǒng)計目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值，兩者之比即為目的蛋白表達量。

1.2.9 克隆形成實驗 ITGAV siRNA和NC轉(zhuǎn)染A549R和H1299R細胞后，經(jīng)0、2、4、6、8 Gy照射，將生長狀態(tài)良好的細胞以1×103個/孔密度傳代培養(yǎng)于6孔板中，37℃、5%CO2恒定培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～10天，直到細胞長出新的集落，固定，結(jié)晶紫染色后顯微鏡下計數(shù)克隆數(shù)。

1.2.10 細胞凋亡檢測 A549R和H1299R細胞經(jīng)ITGAV siRNA、NC轉(zhuǎn)染后，采用6 Gy X射線照射細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后離心，收集細胞，PBS預(yù)冷，洗3遍。依照凋亡試劑盒說明書步驟操作，依次進行Annexin V和PI雙染色，流式細胞儀統(tǒng)計細胞凋亡率。

1.2.11 細胞周期檢測 A549R和H1299R細胞經(jīng)ITGAV siRNA、NC轉(zhuǎn)染，采用6 Gy X線照射后，收集細胞，預(yù)冷的PBS洗3遍。4℃冰箱70%冷乙醇固定過夜，根據(jù)細胞周期試劑盒說明書的操作步驟，按順序進行染色，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 7.04軟件對數(shù)據(jù)進行分析,計量數(shù)據(jù)以（）表示。多組間比較使用單因素方差分析,兩組間比較使用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織中ITGAV高表達

對TCGA的肺腺癌（共594例，包括59例正常組織和535例肺腺癌組織）及肺鱗癌（共551例，包括49例正常組織和502例肺鱗癌組織）數(shù)據(jù)的查詢顯示，ITGAV在肺腺癌（圖1A）和肺鱗癌（圖1B）中過表達（P<0.001）。從HPA數(shù)據(jù)庫檢索的免疫組織化學染色數(shù)據(jù)顯示，ITGAV蛋白在非小細胞肺癌組織中的表達高于正常組織（圖1C）。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫(A,B)和HPA數(shù)據(jù)庫(C)分析ITGAV在肺腺癌和肺鱗癌組織中的表達Figure 1 Expression of ITGAV in lung adenocarcinoma(LUAD) and lung squamous cell carcinoma (LUSC) analyzed using TCGA database(A,B) and HPA database(C)

2.2 NSCLC組織中ITGAV高表達與預(yù)后的關(guān)系

ITGAV高表達與肺腺癌患者的OS（HR=1.47,P=0.0091）和RFS（HR=1.78,P=0.0076）不良密切相關(guān)，見圖2A～B。但ITGAV的表達與肺鱗癌患者的OS（HR=1.22,P=0.21）和RFS（HR=1.64,P=0.082）無明顯相關(guān)性，見圖2C～D。提示ITGAV在肺腺癌組織中高表達并與不良預(yù)后相關(guān)。

圖2 利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析ITGAV表達水平與肺腺癌(A,B)、肺鱗癌(C,D)患者預(yù)后關(guān)系Figure 2 Relationship between ITGAV expression and prognosis of patients with LUAD(A,B) or LUSC(C,D)analyzed using Kaplan-Meier Plotter database

2.3 A549R和H1299R細胞放射敏感度檢測

與親本細胞相比，A549R和H1299R細胞經(jīng)過X射線照射后其放療抵抗能力增加，見圖3。

圖3 A549、A549R(A)和H1299、H1299R(B)照射后細胞存活曲線Figure 3 Survival curves of A549,A549R(A),H1299,and H1299R cells(B) after irradiation

2.4 ITGAV在A549R和H1299R細胞中的表達

Western blot結(jié)果顯示ITGAV在A549R細胞中的表達高于A549細胞（P=0.0003），在H1299R細胞中的表達高于H1299細胞（P<0.0001），見圖4。

圖4 Western blot檢測A549、A549R、H1299和H1299R細胞ITGAV的表達水平Figure 4 Expression of ITGAV in A549,A549R,H1299,and H1299R cells detected by Western blot analysis

2.5 si-RNA轉(zhuǎn)染效率驗證

為了研究ITGAV在非小細胞肺癌細胞輻射抗性中的生物學功能，我們用對照（NC）或si-RNA載體（siITGAV-2913、siITGAV-1951、siITGAV-1312）轉(zhuǎn)染A549R和H1299R細胞。通過qRT-PCR和Western blot驗證轉(zhuǎn)染效率。qRTPCR檢測結(jié)果顯示：與NC組（0.96±0.030）相比、siITGAV-2913組（0.32±0.017）、siITGAV-1951組（0.18±0.011）、siITGAV-1312組（0.2367±0.012）mRNA在A549R中相對表達量差異有統(tǒng)計學意義（均P<0.0001），見圖5A；Western blot檢測結(jié)果顯示：A549R和H1299R細胞中，siITGAV-1951、siITGAV-1312、si-ITGAV-2913均顯著抑制了ITGAV蛋白水平的表達，而siITGAV-1951無論是在A549R還是H1299R細胞中，沉默效果最佳（P<0.0001），見圖5B～E。因此，我們選擇siITGAV-1951進行后續(xù)功能實驗。

圖5 qRT-PCR(A)和Western blot(B～E)檢測siITGAV的干擾效果Figure 5 Interference effects of siITGAV detected by qRTPCR(A) and Western blot(B-E) analyses

2.6 抑制ITGAV對肺腺癌細胞克隆形成能力的影響

克隆形成實驗結(jié)果顯示，經(jīng)0、2、4、6、8 Gy X線照射，ITGAV干擾組細胞的克隆形成能力明顯低于陰性對照組（P均<0.05），見圖6。

圖6 克隆形成實驗檢測不同劑量照射下ITGAV對肺腺癌細胞H1299R(A)和A549R(B)克隆形成能力的影響Figure 6 Survival of H1299R(A) and A549R(B) cells in each group detected by cloning formation assay after irradiation

2.7 抑制ITGAV對肺腺癌細胞凋亡和細胞周期的影響

流式細胞儀凋亡分析顯示，ITGAV在無照射條件下對NSCLC細胞凋亡無明顯影響。然而，6 Gy X線照射48 h后，A549R-siITGAV和H1299RsiITGAV 組的凋亡細胞比例明顯高于對照組（PH1299R<0.0001,PA549R=0.0002），見圖7A～B。經(jīng)6 Gy X線照射后，A549R-siITGAV和H1299RsiITGAV細胞的G2/M期細胞比例高于陰性對照組（PH1299R<0.0001,PA549R=0.0007），見圖7C～D。這些結(jié)果表明，ITGAV干擾后肺腺癌細胞凋亡率增加、阻滯于G2/M期的細胞增加。

圖7 流式細胞術(shù)檢測ITGAV干擾對肺腺癌細胞凋亡(A,B)、周期(C,D)的影響Figure 7 Cell apoptosis(A,B) and cycle(C,D) in each group detected by flow cytometry

3 討論

腫瘤放射抵抗是一個多基因共同調(diào)控的復(fù)雜生物學過程。文獻證實放療抵抗的發(fā)生與DNA損傷修復(fù)、細胞周期阻滯、乏氧、逃避凋亡、線粒體能量改變、腫瘤干細胞增殖、亞克隆形成等多種因素相關(guān)[6]。因此，研究非小細胞肺癌放射抵抗的分子生物學機制，尋找放療抵抗新靶點對提高放射敏感度尤為重要。整合素是一種跨膜糖蛋白，其在腫瘤細胞黏附、改變腫瘤細胞周期、抑制腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤血管內(nèi)皮細胞生成、介導腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用[7]。ITGAV作為整合素家族一員，目前已被證實與前列腺癌[8]、胰腺癌[9]和肝癌[10]的侵襲、擴散或不良預(yù)后有關(guān)。Cheuk等[11]研究顯示整合素ITGAV的沉默通過改變BCL2和PXN的表達來抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲和自我更新。但ITGAV在非小細胞肺癌放射抵抗中的作用尚不清楚。

本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析表明，與正常肺組織相比，整合素ITGAV在肺腺癌和肺鱗癌組織中表達明顯增加，HPA數(shù)據(jù)庫檢索的免疫組織化學染色數(shù)據(jù)也表明ITGAV蛋白在非小細胞肺癌組織中的表達高于正常組織，并且通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)ITGAV高表達與肺腺癌患者較短OS和RFS有關(guān)。這些結(jié)果與Loeser等[12]研究結(jié)果一致。

為進一步研究ITGAV與NSCLC放射抵抗關(guān)系，本研究干擾了ITGAV在A549R和H1299R細胞中的表達，經(jīng)不同劑量照射后，發(fā)現(xiàn)隨著照射劑量增加，干擾組及對照組克隆存活率均顯著降低，但與NC組相比，si-ITGAV組克隆形成率下降更為明顯。這與Lee等[13]研究結(jié)果相似。他們發(fā)現(xiàn)沉默ITGAV后，STAT5的磷酸化下降，NSCLC克隆形成率明顯減低。本研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)6 Gy X線照射后，si-ITGAV組凋亡率、G2/M期阻滯增加，證明ITGAV的沉默與NSCLC較低克隆存活率、對輻射誘導的凋亡抵抗力下降以及G2/M期阻滯有關(guān)。Li等[14]研究ITGB1與NSCLC放射抵抗關(guān)系時也有相似的結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)沉默ITGB1后，A549R和H460R細胞的克隆形成存活率下降，并且與照射后的野生型細胞相比，細胞凋亡率及G2/M期阻滯增加。

綜上所述，本研究初步證實了ITGAV在非小細胞肺癌放射抵抗中的作用，但ITGAV介導非小細胞肺癌放射抵抗的具體分子機制尚未闡明，今后，我們將在本研究的基礎(chǔ)上，進一步探究整合素ITGAV及其他成員在肺癌細胞中的表達情況及發(fā)生、發(fā)展的機制，為解決臨床NSCLC放療抵抗問題提供有利線索和可靠依據(jù)。