白蝕丸中7種潛在肝毒性成分含量測定及用藥安全分析

賈夏麗， 熊 芬， 熊愛珍,2 *， 楊 莉,2， 王崢濤,2

(1.上海中醫(yī)藥大學中藥研究所，中藥標準化教育部重點實驗室，上海市復(fù)方中藥重點實驗室，上海 201203；2.上海中藥標準化研究中心，上海 201203)

白蝕丸收錄于2020年版《中國藥典》，由鹽補骨脂、制何首烏、靈芝等14味中藥組成, 是治療白癜風的常用藥物。近年來，由白蝕丸導致的不良反應(yīng)甚至肝臟衰竭時有發(fā)生，國家藥品監(jiān)督管理局在第9期《藥品不良反應(yīng)信息通報》中明確指出白蝕丸可致肝損害，其用藥安全性備受關(guān)注。白蝕丸組方中的制何首烏、補骨脂、黃藥子、紫草均具潛在肝毒性。何首烏中二苯乙烯苷長期大量使用會造成肝損傷[1]；大黃素對人正常肝細胞具有明顯損傷作用[2]；大黃素甲醚代謝產(chǎn)物可抑制尿苷二磷酸葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶誘導肝毒性[3]；補骨脂中的補骨脂素和異補骨脂素可影響膽汁酸代謝誘導膽汁淤積[4]；黃獨素B可下調(diào)多藥耐藥相關(guān)蛋白2[5]，并引起活性氧的積累誘導線粒體依賴性凋亡[6]；紫草中含多種吡咯里西啶生物堿, 該生物堿是毒性最強的植物性肝毒物質(zhì)之一，可導致肝竇阻塞綜合征等臨床疾病[7]。2020年版《中國藥典》以補骨脂素和異補骨脂素作為白蝕丸的含量測定指標[8]；有文獻對白蝕丸中二苯乙烯苷和丹皮酚進行含量測定[9]，但對其他成分尚未有研究。因此，本研究利用UPLC-MS、HPLC等技術(shù)對白蝕丸中具潛在肝毒性的化學成分進行定性、定量檢測，為其臨床用藥安全提供參考。

1 材料

1260 Infinity高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，配備紫外檢測器；超高效液相-Micromass ZQ2000單四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀，配備電噴霧離子源，單四級桿質(zhì)譜檢測器及超高效液相-Xevo G2-XS高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀(美國沃特世公司)，配備電噴霧離子源，Q-TOF四級桿-飛行時間質(zhì)譜檢測器; BSA124S萬分之一天平、BT25S十萬分之一天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；KQ-250DB超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);AdvantageA10超純水儀 (美國Millipore公司)。

二苯乙烯苷(批號N1103AS)、大黃素(批號J0610AS)、大黃素甲醚(批號MB6587)、黃獨素B(批號M0305AS)、補骨脂素(批號O0927AS)和異補骨脂素(批號O1002AS)對照品購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，純度大于98%；千里光堿對照品(批號PRF10071724)購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，純度均大于98%。甲酸銨購自美國Sigma-Aldrich公司；甲醇和乙腈購自美國Fisher公司；磷酸、無水乙醇、甲酸購自國藥集團化學試劑有限公司。水為超純水，由Milli-Q超純水儀制備。不同批次的白蝕丸購自廣東和陜西，190201和190202購自廣東，Y00003和Z00002購自陜西。

2 方法

2.1 白蝕丸中二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚的含量測定 參考《中國藥典》制何首烏含量測定項下方法進行[8]。Agilent ZQRBAX SB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；柱溫30 ℃；體積流量1 mL/min；進樣量10 μL。二苯乙烯苷以乙腈-水(25∶75)為流動相，檢測波長為320 nm。大黃素和大黃素甲醚以甲醇-0.1%磷酸(80∶20)為流動相，檢測波長為254 nm。

2.2 白蝕丸中補骨脂素、異補骨脂素、黃獨素B的含量測定 參考文獻[10-11]進行。色譜條件為Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)；流動相含2 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸(A)和乙腈(B)，梯度洗脫(0～2 min, 5%～15% B；2～3 min, 15%～25% B; 3～6 min, 25%～50% B; 6～10.5 min, 50%～95% B；12～14 min, 5% B)；柱溫45 ℃；體積流量0.4 mL/min；進樣量2 μL。質(zhì)譜條件為正離子模式下進行選擇離子監(jiān)測；離子監(jiān)控通道m(xù)/z187.1(補骨脂素和異補骨脂素),m/z362.1(黃獨素B)；毛細管電壓3.0 kV；錐孔電壓40 V；離子源溫度120 ℃；脫溶劑溫度400 ℃；錐孔氣(N2)體積流量50 L/h；脫溶劑氣(N2)體積流量800 L/h。

2.3 白蝕丸中吡咯里西啶生物堿的分析 參考課題組前期報道方法[12-13]，利用超高效液相-Xevo G2-XS高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀對不同類型吡咯里西啶生物堿的特征離子進行全掃，對白蝕丸中的吡咯里西啶生物堿進行快速篩選和鑒定。色譜條件為Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)；流動相含10 mmol/L甲酸銨的0.1%氨水(A)和乙腈(B)，梯度洗脫(0～5 min, 5%～20% B; 5～7 min, 20%～40% B; 7～8.5 min, 40%～90% B; 10～12 min, 5% B)；柱溫45 ℃；體積流量0.4 mL/min；進樣量10 μL。質(zhì)譜條件為正離子掃描模式下全掃；離子掃描范圍m/z50～800；碰撞能范圍30～35 V；毛細管電壓3.0 kV；錐孔電壓40 V；離子源溫度120 ℃；脫溶劑溫度350 ℃；錐孔氣(N2)50 L/h；脫溶劑氣(N2)800 L/h。

參考文獻方法[13]，利用超高效液相-Micromass ZQ2000單四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀進行選擇離子監(jiān)測，以千里光堿為對照品建立標準曲線對白蝕丸中吡咯里西啶生物堿進行半定量分析。選擇離子為m/z336.2(千里光堿)、m/z398.2(hydroxymyoscoripine)，其余色譜及質(zhì)譜條件與吡咯里西啶生物堿快速篩選條件相同。

2.4 對照品溶液的制備 分別精密稱定補骨脂素、異補骨脂素、黃獨素B、大黃素、大黃素甲醚對照品2.25、1.49、2.50、5.00、5.00 mg于5 mL量瓶中，加甲醇至刻度配制成質(zhì)量濃度分別為450、298、500、1 000、1 000 μg/mL對照品儲備液。加甲醇分別稀釋成一系列梯度的對照品工作液。

精密稱定二苯乙烯苷對照品2.50 mg于2.5 mL量瓶中，用稀乙醇配成質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的對照品儲備液。加稀乙醇稀釋成一系列梯度的對照品工作液。

精密稱定千里光堿對照品1.00 mg于10 mL量瓶中，加0.1%甲酸至刻度配置成質(zhì)量濃度為100 μg/mL對照品貯備液。加0.1%甲酸稀釋成一系列梯度的對照品工作液。

2.5 供試品溶液的制備 白蝕丸中二苯乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚含量測定為取白蝕丸50 g，打粉，過四號篩。取本品粉末約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，取出，放冷，再稱定質(zhì)量；加甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置濾過。取續(xù)濾液，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

白蝕丸中補骨脂素、異補骨脂素、黃獨素B含量測定為取本品粉末約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入100 mL 75%甲醇，稱定質(zhì)量；超聲處理40 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用75%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置濾過。取續(xù)濾液，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

白蝕丸中吡咯里西啶生物堿檢測為取本品粉末約10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加30 mL 0.5%甲酸超聲40 min，離心取上清，藥渣再加30 mL 0.5%甲酸超聲處理40 min，離心取上清，合并2次提取液，加氨水堿化至pH為10左右，加入二氯甲烷萃取5次，每次50 mL，室溫靜置分層后分離二氯甲烷層，合并二氯甲烷層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，稱定提取物質(zhì)量，加 0.1%甲酸適量制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL溶液，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

3 結(jié)果

3.1 白蝕丸中吡咯里西啶生物堿的快速篩選 不同類型吡咯里西啶生物堿在二級質(zhì)譜裂解時可產(chǎn)生不同的特征離子, 如retronecine型吡咯里西啶生物堿可產(chǎn)生m/z120和m/z138的特征碎片。千里光堿為retronecine型吡咯里西啶生物堿，其對照品保留時間為6.3 min (圖1A), 分子離子峰為m/z336.179 4(C18H26NO5+)(圖1B)且二級譜圖中可見明顯m/z120和m/z138特征碎片(圖1C)，與文獻報道[12-13]相符。在白蝕丸樣本中，檢測到一個可產(chǎn)生這兩個特征離子的化合物,其保留時間為6.7 min(圖1D)，分子離子峰為m/z398.217 6(圖1E)，二級譜圖中可見明顯m/z120和m/z138特征碎片(圖1F)，初步判定其為retronecine型吡咯里西啶生物堿。進一步根據(jù)高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析其分子離子峰和二級碎片的元素組成，推斷其質(zhì)譜裂解途徑(圖2), 并與文獻[14]比對，鑒定其為hydroxymyoscoripine。

圖1 白蝕丸樣本中吡咯里西啶生物堿質(zhì)譜圖

圖2 Hydroxymyoscoripine的二級質(zhì)譜裂解途徑

3.2 白蝕丸中潛在毒性成分的含量分析 白蝕丸樣本中hydroxymyoscoripine含量測定根據(jù)課題組前期建立方法利用UPLC-MS進行(圖1), 大黃素、大黃素甲醚和二苯乙烯苷含量測定參照藥典方法利用HPLC進行(圖3)，補骨脂素、異補骨脂素、黃獨素B含量測定參考文獻方法利用UPLC-MS進行(圖4)。對于方法的線性、靈敏度、穩(wěn)定性、重復(fù)性等進行考察，均符合含量測定要求。各化合物在白蝕丸樣本中的含量見表1。所有化合物中含量最高的是二苯乙烯苷，最高為10.1 mg/g，其次為異補骨脂素、補骨脂素。同一個廠家的樣品各化合物的含量差異較小，但不同廠家的各化合物的含量差異較大。

1.二苯乙烯苷 2.大黃素 3.大黃素甲醚注：A為二苯乙烯苷對照品色譜圖(320 nm)，B為大黃素對照品色譜圖(254 nm)，C為 大黃素甲醚對照品色譜圖(254 nm)，D為白蝕丸樣品中的二苯乙烯苷色譜圖(320 nm)，E為白蝕丸樣品中的大黃素色譜圖(254 nm)，F(xiàn)為白蝕丸樣品中的大黃素甲醚色譜圖 (254 nm)。

1.補骨脂素 2.異補骨脂素 3.黃獨素B注：A為補骨脂素、異補骨脂素對照品色譜圖(m/z 187.1)，B為黃獨素B對照品色譜圖(m/z 362.1)，C為白蝕丸樣品中的補骨脂素、異補骨脂素色譜圖(m/z 187.1)，D為白蝕丸樣品的黃獨素B色譜圖(m/z 362.1)。

3.3 白蝕丸致臨床肝損傷事件回顧與分析 回顧白蝕丸致肝損傷的臨床報道(表2), 患者服用白蝕丸均用于治療白癜風，無其他病史。患者每日服用白蝕丸的劑量和頻次都遵循說明書，即3次/日，2.5 g/次，但服用時間較長，最短20 d，最長時間達108 d。中毒癥狀包括肝功能障礙、瘙癢、乏力、納差、神志不清等；住院后停止服用白蝕丸，并經(jīng)治療1周至1月后病狀消失恢復(fù)正常。

4 討論

2020年版《中國藥典》以補骨脂素和異補骨脂素作為白蝕丸的含量測定指標成分，規(guī)定二者的含量之和不少于2.5 mg/g[8]。本研究首次對白蝕丸中7種潛在肝毒性成分進行分析。檢測本實驗中不同批次白蝕丸，補骨脂素和異補骨脂素的含量之和為3.4～4.0 mg/g, 符合藥典規(guī)定。不同批次白蝕丸樣本中各化合物的含量差異較大(RSD為10%～58%)。根據(jù)結(jié)果，計算服用白蝕丸復(fù)方時攝入毒性成分的含量, 見表3。

含吡咯里西啶生物堿的植物及制品的安全性問題已引起國際性相關(guān)部門的廣泛注意，許多國家或組織都制定了相應(yīng)的法規(guī)。其中以德國衛(wèi)生部門的標準最為嚴格，規(guī)定每日攝入草藥制品中吡咯里西啶生物堿的量不得超過1 mg，長期服用(超過6個月)時則不得超過0.1 mg，外用不得超過10 mg，孕婦及哺乳期婦女不得使用[15]。盡管沒有關(guān)于hydroxymyoscoripine的毒性數(shù)據(jù)，但其為retronecine型吡咯里西啶生物堿，屬于肝毒性最強的類型[16]；每日服用白蝕丸攝入hydroxymyoscoripine的量為3 mg，為德國衛(wèi)生部門規(guī)定的3倍,存在著一定的用藥風險。此外，白蝕丸含多種潛在毒性成分，結(jié)合白蝕丸致臨床肝損傷病例報道，白蝕丸致肝損傷可能的原因有患者長期服用白蝕丸攝入多種毒性成分，通過影響藥物代謝酶增加人體對毒性成分的易感性；患者長期服用白蝕丸，造成相關(guān)毒性成分在體內(nèi)蓄積致毒；多種毒性成分共同作用于機體多條信號通路，產(chǎn)生了類似協(xié)同增毒的效果，使得毒性增強。因此，在今后的研究中，應(yīng)加強對白蝕丸中潛在毒性成分的研究，采用基于整體動物模型的毒效與毒代動力學相結(jié)合的研究模式，明確其安全窗口，建立更加科學合理的質(zhì)量標準，以全面系統(tǒng)地評價其安全性，指導臨床合理用藥。

表1 白蝕丸中7種潛在肝毒性成分的含量(μg/g, n=3)

表2 白蝕丸致肝毒性病例回顧

表3 白蝕丸中潛在毒性成分致毒劑量及臨床患者攝入量