藍(lán)盆花提取物化學(xué)成分及其抗氧化活性研究

包黎明， 李淑艷， 包曉華， 拉喜那木吉拉， 奧烏力吉

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

藍(lán)盆花為蒙醫(yī)習(xí)用藥材，習(xí)稱蒙古山蘿卜，蒙藥名陶森-陶日木[1]?！吨腥A人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定，川續(xù)斷科植物窄葉藍(lán)盆花ScabiosacomosaFisch.和華北藍(lán)盆花ScabiosatschilliensisGurn.的干燥頭狀花序均為正品蒙藥材藍(lán)盆花[2-3]，主要產(chǎn)于內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林、遼寧等地的沙質(zhì)草原，秋季開花時(shí)采摘，除去雜質(zhì)，陰干，味甘、澀、性涼，具有清熱、止痛作用，主要用于肺熱、肝熱、血熱及咽喉熱等[1-2]。據(jù)報(bào)道本屬植物的化學(xué)成分包括黃酮類、三萜類和香豆素類等[4]。

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF-MSE技術(shù)對(duì)藍(lán)盆花提取物進(jìn)行了化學(xué)成分分析，采用電噴霧離子源，在負(fù)離子模式下，根據(jù)各主要色譜峰的母離子及相關(guān)碎片離子，結(jié)合對(duì)照品、文獻(xiàn)及相關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行鑒定。同時(shí)對(duì)比了藍(lán)盆花不同溶劑提取物的體外抗氧化活性作用。

1 材料

1.1 儀器 Waters Acquity UPLC液相系統(tǒng)、Waters Xevo G2S TOF質(zhì)譜檢測(cè)器(美國Waters公司)；Varioskan LUX多功能化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；電子天平(上海光正醫(yī)療儀器有限公司)；KQ-100型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑 亮氨酸腦啡肽(美國Waters公司)；Folin-Ciocalteu酚試劑(北京索萊寶科技有限公司)；碳酸鈉(Na2CO3)、過硫酸鉀(K2S2O8)(汕頭市西隴化工廠股份有限公司)；1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)、熒光素、水溶性維生素E(Trolox)、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(AAPH)、沒食子酸、咖啡酸、綠原酸、金絲桃苷、芹菜素、蘆丁(上海源葉生物科技有限公司)；奎寧酸(美國Sigma公司)。甲醇、乙腈、甲酸(質(zhì)譜純，純度≥99.99%，美國Thermo Fisher Scientific公司)；氫氧化鈉(ACS級(jí)，純度≥97%，美國Sigma公司)；甲醇(分析純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司)；乙醇(分析純，遼寧泉瑞試劑有限公司)；蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

1.3 藥材 藍(lán)盆花花序于2020年7月采自內(nèi)蒙古通遼，經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學(xué)包桂花教授鑒定為川斷續(xù)科藍(lán)盆花屬窄葉藍(lán)盆花ScabiosacomosaFisch.。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液 取干燥藥材20 g，粉碎后過40目篩，加適量溶劑(150 mL)在室溫下超聲(100 W、40 kHz)提取3次，每次30 min，提取液合并，濾紙過濾，濾液在40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮干燥。精密稱取1 g，甲醇溶解后置于50 mL量瓶中，甲醇定容，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2 UPLC-Q-TOF-MSE分析條件

2.2.1 色譜 Waters Acquity BEH-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～10 min，15%B；10～25 min，15%～25%B；25～30 min，25%～40%B；30～45 min，40%～50%B；45～50 min，50%B)；體積流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

2.2.2 質(zhì)譜 ESI離子源，MSE掃描負(fù)離子模式檢測(cè)；質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 200；霧化氣高純度氮?dú)?，體積流量50 L/h；碰撞氣氮?dú)?；脫溶劑氣體積流量650 L/h，溫度450 ℃；離子源溫度100 ℃；錐孔電壓50 V；毛細(xì)管電壓2.0 kV；在MSE模式下，低碰撞能6 eV，高碰撞能15～45 eV。采用亮氨酸腦啡肽對(duì)質(zhì)量進(jìn)行實(shí)時(shí)校正，MassLynx V 4.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及分析。

2.3 總酚含量測(cè)定 采用福林酚法[5]，在100 μL樣品溶液中加入750 μL 0.1 mol/L福林酚試劑混勻，混合物平衡5 min，加入750 μL 0.6 mol/L Na2CO3溶液混勻，靜置90 min，在725 nm波長處測(cè)定吸光度。總酚含量以每1 g干燥樣品提取物中的沒食子酸當(dāng)量表示。

2.4 抗氧化活性研究

2.4.1 對(duì)DPPH自由基的清除率 參照文獻(xiàn)[6]報(bào)道，以抗壞血酸為對(duì)照品，將100 μL 0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液與100 μL樣品溶液(1～1 000 μg/mL) 混勻后，在黑暗中放置30 min，反應(yīng)完全后采用酶標(biāo)儀在517 nm波長處測(cè)定吸光度。

2.4.2 對(duì)ABTS自由基的清除率 參照文獻(xiàn)[7]報(bào)道，取等體積ABTS溶液(7 mmol/L)與過硫酸鉀水溶液(2.45 mmol/L)混合，在室溫下避光反應(yīng)12～16 h，甲醇稀釋至在734 nm波長處吸光度為0.70±0.05，取150 μL加到96孔板中，向各孔中加入50 μL樣品溶液，避光反應(yīng)6 min，反應(yīng)完全后用酶標(biāo)儀在734 nm波長處測(cè)定吸光度。

2.4.3 氧自由基吸收能力(ORAC) 參考Huang等[8]報(bào)道的方法，以水溶性維生素E(Trolox)為對(duì)照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以每1 g藥材干重的Trolox當(dāng)量表示。

3 結(jié)果

3.1 成分分析 在負(fù)離子模式下，根據(jù)母離子及碎片離子，結(jié)合對(duì)照品、相關(guān)文獻(xiàn)及chemspider、metlin等數(shù)據(jù)庫，在藍(lán)盆花提取物中鑒定出38個(gè)化合物，基峰離子色譜圖見圖1，各化合物具體信息見表1。

圖1 藍(lán)盆花提取物基峰離子色譜圖

3.1.1 酚酸類成分結(jié)構(gòu)鑒定 化合物1、2、3的質(zhì)譜裂解信息與相應(yīng)對(duì)照品一致，分別鑒定為奎寧酸、綠原酸、咖啡酸。

化合物4、5、16、24在MSE掃描中均出現(xiàn)了m/z191的特征峰，說明它們是奎寧酸的衍生物。其中，16、24的分子離子峰分別為[M-H]-m/z515.120 6、515.121 2，MSE掃描得到碎片離子峰m/z353、191，表明結(jié)構(gòu)中存在兩分子咖啡?；?，為二咖啡酰喹酸異構(gòu)體，再根據(jù)C18反相柱上的保留時(shí)間，分別鑒定為3，4-O-二咖啡酰基奎寧酸、4，5-O-二咖啡?；鼘幩醄9]；4、5的分子離子峰[M-H]-分別為m/z529.156 8、367.102 0，碎片離子均出現(xiàn)在m/z191，根據(jù)MSE碎裂結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，分別鑒定為灰氈毛忍冬F(xiàn)、阿魏酰奎寧酸[10]。

3.1.2 黃酮類成分結(jié)構(gòu)鑒定 通過與對(duì)照品比對(duì)，化合物11、12、17、32分別鑒定為金絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁、芹菜素。

化合物6、7、9、10、28的MSE掃描圖譜中出現(xiàn)了[M-18]-、[M-90]-、[M-120]-碎片離子信息，提示結(jié)構(gòu)里有C-糖苷鍵[11]，可認(rèn)為是黃酮-C-糖苷類化合物。其中，6的分子離子峰[M-H]-m/z593.151 5，其碎片離子m/z473 [M-120]-、383 [M-90]-，鑒定為新西蘭牡荊苷[11]；9的分子離子峰[M-H]-m/z447.093 0，碎片離子m/z429[M-18]-、357 [M-90]-、327 [M-120]-，鑒定為異葒草素[12]；7、10、28的分子離子峰分別為[M-H]-m/z461.108 6、461.107 9、461.107 0。碎片離子峰m/z371 [M-90]-、341 [M-120]-，根據(jù)MSE圖譜、C18柱洗脫順序結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，分別鑒定為香葉木素8-C-葡萄糖苷、金雀花素、日當(dāng)藥黃素[13]。

表1 藍(lán)盆花提取物化學(xué)成分

化合物19的分子離子峰為[M-H]-m/z463.088 3，與11、12相同，在MSE圖譜中m/z301處出現(xiàn)了很強(qiáng)的碎片離子峰，但在m/z301處出現(xiàn)的碎片離子峰與黃酮醇-3-O-糖苷碎裂規(guī)律不一致[14]，具有不同的取代模式，可能涉及4′位置，鑒定為繡線菊苷。

化合物8、13、14、15、21、23、27、29、35、36、38在m/z285處檢測(cè)到來自山柰酚(或木犀草素)苷元的碎片離子，鑒定為山柰酚(或木犀草素)衍生物，MSE掃描圖譜中山柰酚、木犀草素苷元的裂解規(guī)律不同，前者碎片離子為m/z199、175、151、133，后者為m/z255、227。其中，13、15、27的分子離子峰[M-H]-分別為m/z447.092 8、447.092 7、447.093 7，由于葡萄糖部分的丟失，在m/z285處均表現(xiàn)出很強(qiáng)的碎片離子，分別鑒定為木犀草素-4"-O-葡萄糖苷、木犀草苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷；8、14、29的分子離子峰[M-H]-分別為m/z593.150 9、593.150 0、593.131 2，碎片離子m/z285[M-H-308]-，根據(jù)MSE碎裂結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，分別鑒定為山柰酚-3-O-蕓香糖苷、木犀草素-7-O-蕓香糖苷、山柰酚-7-O-新橘皮糖苷[15]；21分子離子峰[M-H]-m/z579.136 7，碎片離子m/z285，是母離子丟失1分子阿拉伯糖、1分子葡萄糖形成的，MSE掃描圖譜中苷元的碎片離子與木犀草素一致，鑒定為木犀草素-7-O-阿拉伯糖葡萄糖苷[16]；23分子離子峰[M-H]-m/z593.152 7，碎片離子m/z447 [M-146]-、285 [M-162]-，MSE掃描圖譜中苷元的碎片離子信息與山柰酚一致，鑒定為山柰酚3-O-6-p-羥基肉桂?；?葡萄糖苷[17]；38分子離子峰[M-H]-m/z739.167 0，碎片離子m/z593 [M-146]-、285 [M-308]-，鑒定為刺槐素。

化合物18、20、22、31在MSE高能量掃描中均出現(xiàn)了m/z269的碎片離子峰，鑒定為芹菜素衍生物。其中，18的分子離子峰m/z563.141 3，碎片離子m/z269，提示丟失了1分子阿拉伯糖和1分子葡萄糖，根據(jù)MSE碎裂結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，鑒定為芹菜素-7-阿拉伯糖葡萄糖苷[17]；20分子離子峰m/z431.099 2 [M-H]-，碎片離子m/z895 [2M-H]-、268 [M-162]-，鑒定為大波斯菊苷[17]。

化合物33的分子離子峰[M-H]-m/z299.054 8，碎片離子m/z284，鑒定為香葉木素[17]。

化合物37的分子離子峰m/z287.222 3，碎片離子m/z269、216、174，根據(jù)MSE碎裂結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，鑒定為黃顏木素[16]。

3.2 總酚含量測(cè)定 表2顯示，不同溶劑提取物總酚含量有顯著差異，最高為70%丙酮溶劑提取物，其次為70%乙醇提取物，水提物最低。

表2 藍(lán)盆花提取物抗氧化作用及總酚含量測(cè)定結(jié)果

3.3 抗氧化活性 表2顯示，70%丙酮溶劑提取物清除DPPH能力最強(qiáng)，其次為70%乙醇提取物，分別為抗壞血酸(IC50值4.7 μg/mL)的51.6%、33.8%；70%丙酮提取物清除ABTS能力最強(qiáng)，是抗壞血酸(IC50值16.2 μg/mL)的19.9%；70%丙酮提取物ORAC最高，水提物最低。

在ORAC測(cè)定中，熒光素被AAPH產(chǎn)生的自由基攻擊時(shí)熒光會(huì)衰退，而具有抗氧化作用的樣品能延遲其衰退，故抗氧化能力與能延緩熒光衰退曲線的部分面積(Net AUC)直接相關(guān)，后者即抗氧化保護(hù)面積，是指有抗氧化劑和無抗氧化劑時(shí)的熒光衰減曲線下面積之差，面積越大，抗氧化作用越強(qiáng)。圖2顯示，不同溶劑提取物均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化能力，高于100 μmol/L水溶性維生素E，以70%丙酮提取物最強(qiáng)，水提物最弱。

圖2 不同溶劑提取物熒光相對(duì)強(qiáng)度

4 討論

藍(lán)盆花屬植物屬于川斷續(xù)科，我國有9種2變種。其中窄葉藍(lán)盆花ScabiosacomosaFisch.和華北藍(lán)盆花ScabiosatschilliensisGurn.為蒙古族習(xí)用藥材，在《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》(蒙藥分冊(cè))中規(guī)定兩者均屬于蒙藥材藍(lán)盆花的正品，具有清熱的功能，臨床多為配方應(yīng)用。本研究采用UPLC-Q-TOF-MSE技術(shù)對(duì)藍(lán)盆花花序的化學(xué)成分進(jìn)行了分析，從中鑒定出38種化合物，主要成分為酚酸類及黃酮類成分。

植物中酚酸類和黃酮類化合物是主要的多酚類物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎等生理活性，而這些作用能降低肥胖、衰老、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病的風(fēng)險(xiǎn)[18]。

對(duì)藍(lán)盆花不同溶劑提取物進(jìn)一步用DPPH、ABTS和ORAC等方法進(jìn)行體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，藍(lán)盆花不同溶劑提取物均顯示不同程度的抗氧化活性，其中，70%丙酮提取物在3種方法測(cè)定中均顯示很強(qiáng)的抗氧化活性。同時(shí)，總酚含量也顯著高于其它溶劑提取物。綜合以上結(jié)果顯示，藍(lán)盆花具有很好的抗氧化活性，其活性與總酚含量密切相關(guān)。總酚含量受萃取溶劑的影響很大，70%丙酮是提取藍(lán)盆花酚類物質(zhì)的最佳溶劑。本研究為藍(lán)盆花的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量控制及對(duì)潛在藥理作用開發(fā)具有重要意義。