蘇木4種提取物對(duì)脫礦牙釉質(zhì)的再礦化作用

李茹芳， 崔 霞， 王麗梅， 李秋艷， 藍(lán) 海*

(1.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理 671000；2.云南省大理州人民醫(yī)院口腔科，云南 大理 671000)

蘇木為豆科云實(shí)屬植物蘇木CaesalpiniasappanL.的干燥心材，最早記載于《唐本草》中，味甘、咸，性溫，具有松弛筋絡(luò)、活血散結(jié)、鎮(zhèn)靜止痛等功效[1]，主要分布在廣東、廣西、云南等地，其中廣西是主要的生產(chǎn)及栽培區(qū)。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從蘇木中分離出近100個(gè)化合物，主要包括蘇木素類、原蘇木素類、高異黃酮類等[2-3]。近年來(lái)，對(duì)蘇木提取物活性的研究主要集中在抗腫瘤[4-5]和免疫抑制[6]。課題組前期研究證實(shí)，蘇木乙醇、乙酸乙酯、正丁醇以及水提取物可以抑制變形鏈球菌和粘性放線菌的生長(zhǎng)，但還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道蘇木是否有再礦化的作用。本實(shí)驗(yàn)建立體外齲齒模型，通過(guò)給予前期實(shí)驗(yàn)所得最低抑菌濃度(MIC)，研究蘇木4種提取物對(duì)牛切牙脫礦牙釉質(zhì)再礦化的影響，初探蘇木的防齲機(jī)制。

1 材料

1.1 試劑與藥物 新鮮牛切牙(大理泰興市場(chǎng))。氟化鈉(分析純，上海申博化工有限公司)；磷酸二氫鉀(分析純，天津市化學(xué)試劑研究所)；冰乙酸、氯化鉀(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；HEPES緩沖液(美國(guó)Sigma公司)。

1.2 儀器 Leica TCS SP8型激光掃描共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；BK-POLR-透反射偏光顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器有限公司)；CP224C型電子天平[奧豪斯儀器(上海)有限公司]；YMP-2B型金相試樣磨拋機(jī)(蘇州歐卡精密光學(xué)儀器有限公司)；78HW-1型恒溫磁力攪拌器(江蘇金壇市億通電子有限公司)；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；SB-25-12DT型超聲清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

2 方法

2.1 釉質(zhì)樣品制備

2.1.1 牙釉質(zhì)制備 參考文獻(xiàn)[7]報(bào)道，取新鮮牛牙，去除軟組織，用硬組織切片機(jī)分離牙冠和牙根，采用磨拋機(jī)將牙冠表面拋光成光滑平面(開(kāi)窗區(qū)為5 mm×5 mm)，超聲清洗30 min，去離子水洗凈，置于0.9% 氯化鈉溶液中，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 分組 在顯微鏡下觀察牙釉質(zhì)樣品，選取無(wú)裂痕、齲損、氟斑的完好牙釉質(zhì)，用去離子水洗凈晾干，隨機(jī)分為脫礦組、陰性組、陽(yáng)性組(20 mg/mL 氟化鈉)及蘇木乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、水提取物組，每組6顆(實(shí)驗(yàn)組用藥濃度為課題組前期實(shí)驗(yàn)所得的變形鏈球菌MIC值2.5 mg/mL)。

2.2 脫礦和再礦化實(shí)驗(yàn) 將釉質(zhì)樣品全部浸入脫礦液[8](50 mmol/L乙酸、2.2 mmol/L磷酸二氫鉀溶液、2.2 mmol/L二水合氯化鈣溶液、0.5 mol/L碳酸氫鈉溶液，pH 4.5)中，置于37 ℃搖床中100 r/min脫礦72 h，用去離子水沖洗，形成人工齲齒。將人工脫礦后的釉質(zhì)樣品在各實(shí)驗(yàn)組溶液中浸泡5 min，去離子水沖洗干凈，濾紙吸干水分，放入酸性緩沖液[8](50 mmol/L乙酸、2.25 mmol/L二水合氯化鈣溶液、0.5 mol/L碳酸氫鈉溶液、1.5 mmol/L磷酸二氫鉀溶液、130 mmol/L氯化鉀溶液，pH 5.0)中浸泡30 min，去離子水沖洗干凈，濾紙吸干水分，最后放入中性緩沖液[8](20 mmol/L HEPES緩沖液、2.25 mmol/L二水合氯化鈣、1.5 mmol/L磷酸二氫鉀溶液、130 mmol/L 氯化鈉溶液，pH 7.0)中浸泡10 min，去離子水沖洗干凈，濾紙吸干水分。每天重復(fù)6次，持續(xù)10 d，進(jìn)行再礦化，其余時(shí)間在中性緩沖液中過(guò)夜，試劑每天更換[9]。

2.3 偏光顯微鏡觀察 參考文獻(xiàn)[10]報(bào)道，將經(jīng)過(guò)脫礦和再礦化之后的牙釉質(zhì)樣品進(jìn)行包埋處理，在穩(wěn)定的水流下，沿著釉質(zhì)樣品開(kāi)窗區(qū)的中央用硬組織切割機(jī)將其縱向切割成薄片，為完整的平面，切片為110 μm，每組取6片，樣品用甘油封片后在偏光顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察 按照“2.3”項(xiàng)下方法將牙釉質(zhì)切割成110 μm薄片，每組6片，用0.1 mmol/L羅丹明B熒光染料染色1 h，蒸餾水沖洗多余染料，干燥后用甘油密封，并將其置于激光掃描共聚焦顯微鏡下，在529 nm激發(fā)波長(zhǎng)下掃描，10倍鏡下觀察羅丹明B的滲入量[11]。用Image J v1.8.0軟件將掃描的圖像進(jìn)行處理分析，并以熒光面積(單位為μm2)、總熒光量、平均熒光量3個(gè)參數(shù)表示[12]。

3 結(jié)果

3.1 偏光顯微鏡觀察 脫礦組和陰性組釉質(zhì)樣品表面有許多病理?yè)p傷區(qū)域，形成不規(guī)則的表面缺陷，釉質(zhì)層黑色區(qū)域明顯，存在以脫礦為主的正性雙折射區(qū)(紅色箭頭所示)。進(jìn)行pH循環(huán)后，陽(yáng)性組和蘇木4種提取物組釉質(zhì)層相對(duì)完整，表面輕度脫鈣，脫礦區(qū)病變深度變淺(紅色箭頭所示)，并且齲損部位出現(xiàn)負(fù)性雙折射的再礦化帶(白色箭頭所示)，見(jiàn)圖1。

圖1 偏光顯微鏡觀察各組釉質(zhì)齲再礦化作用

3.2 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察 脫礦后紅色熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，紅色條帶熒光面積較大；進(jìn)行pH循環(huán)后，陽(yáng)性組和蘇木4種提取物處理后的牙釉質(zhì)熒光強(qiáng)度較弱，紅色條帶較細(xì)、短，紅色條帶熒光面積較小，見(jiàn)圖2。

圖2 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察各組釉質(zhì)齲再礦化作用

3.3 蘇木4種提取物對(duì)牙釉質(zhì)再礦化后激光掃描共聚焦顯微鏡參數(shù)的影響 如表1所示，與脫礦組比較，蘇木4種提取物組總熒光量、平均熒光量均減弱(P<0.05)。與陰性組比較，蘇木乙酸乙酯、正丁醇、水提取物總熒光量均降低(P<0.05)，蘇木正丁醇、水提取物組平均熒光量均降低(P<0.05)。蘇木各提取物再礦化作用生成的晶體使熒光染料進(jìn)入牙組織脫礦釉質(zhì)微孔中的量減少，齲損程度降低，具有再礦化作用。

4 討論

由于口腔環(huán)境結(jié)構(gòu)的復(fù)雜多變，牙齒硬組織脫礦受多種因素影響。早期齲的自然形成時(shí)間一般為0.5～1.5年，因此無(wú)法直接在口腔內(nèi)研究齲損的形成和再礦化機(jī)制。為了研究齲病的發(fā)生機(jī)制和預(yù)防措施，從20世紀(jì)50年代起人工齲實(shí)驗(yàn)已被廣泛用于觀察和分析齲病的發(fā)生、發(fā)展和修復(fù)過(guò)程[13]。

表1 蘇木4種提取物對(duì)牙釉質(zhì)再礦化后激光掃描共聚焦顯微鏡測(cè)量參數(shù)

人工齲的主要方法有體外法，包括化學(xué)齲法、電化學(xué)法、細(xì)菌產(chǎn)酸齲法和人工口腔模型。本實(shí)驗(yàn)采用的化學(xué)致齲法是目前人工齲模型中最常用的方法，其優(yōu)點(diǎn)是可以在控制變量的條件下研究單個(gè)因素的影響，從而得到牙齒硬組織表層和表層下脫礦及再礦化動(dòng)力學(xué)變化的信息[14-15]。

偏光顯微鏡是研究牙體硬組織晶體結(jié)構(gòu)的基本方法，通過(guò)偏振光的折射反映出釉質(zhì)中具有雙折射特性的礦物質(zhì)，可用于定性觀察脫礦和再礦化過(guò)程中晶體結(jié)構(gòu)的變化[16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，脫礦組和陰性組的釉質(zhì)樣品因大量脫礦，齲損嚴(yán)重，呈現(xiàn)正性雙折射的暗帶，而樣品經(jīng)過(guò)蘇木各提取物處理后，齲損厚度明顯變淺，密度變小并呈現(xiàn)負(fù)性雙折射的再礦化帶，表明蘇木各提取物均有抑制脫礦和促進(jìn)再礦化的作用。

激光共聚焦顯微鏡是目前觀察牙齒硬組織脫礦和再礦化的一種先進(jìn)方法，是生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究中最常用的熒光顯微工具之一，已經(jīng)成為新的實(shí)驗(yàn)手段，它解決了一些以往研究中存在的技術(shù)難題，創(chuàng)造更好的條件，在口腔硬組織定性和定量研究方面有很大的應(yīng)用價(jià)值[17]。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡測(cè)得齲損區(qū)域的熒光面積，總熒光量及平均熒光量可以了解標(biāo)本脫礦及再礦化情況。牙釉質(zhì)自身無(wú)法發(fā)熒光，需要使用羅丹明B等染料染色，經(jīng)過(guò)激光共聚焦顯微鏡照射可發(fā)射熒光，然后利用Image J軟件進(jìn)行定量分析。熒光染料分子可以滲進(jìn)脫礦牙釉質(zhì)的微孔中，脫礦區(qū)域的脫礦情況和總熒光量、平均熒光量成正比。實(shí)驗(yàn)中熒光條帶代表脫礦部分，通過(guò)計(jì)算熒光條帶的總熒光量和平均熒光量，分析再礦化的效果[18]。本研究結(jié)果顯示，脫礦后紅色熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，紅色條帶熒光面積較大；氟化鈉和蘇木各提取物處理后的牙片熒光強(qiáng)度較暗，紅色條帶較細(xì)、短，紅色條帶熒光面積較小，進(jìn)一步說(shuō)明蘇木提取物有促進(jìn)牙釉質(zhì)再礦化作用，從而達(dá)到防齲的效果。

綜上所述，蘇木作為一種抑菌殺菌能力強(qiáng)、對(duì)牙組織有再礦化效果的天然藥物，具有良好的應(yīng)用前景和藥用價(jià)值。