HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定地麥活性糖顆粒中4種糖類成分

張建偉， 劉海燕， 呂海陽(yáng)， 鄧龍飛， 周 嘯， 劉 力

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021)

生地黃為玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的干燥塊根，具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津之功效，用于治療熱入營(yíng)血、熱病傷陰、舌絳煩渴、津傷便秘、內(nèi)熱消渴等癥[1]。課題組前期從中提取分離出由水蘇糖、棉子糖、甘露三糖等糖類組成的生地低聚糖[2]，具有改善氣道病理變化、延緩或逆轉(zhuǎn)COPD發(fā)生的作用[3]。另外，生地免煎顆粒可增加2型糖尿病大鼠體質(zhì)量，顯著降低空腹血糖、24 h尿量、尿蛋白等指標(biāo)[4]。

麥冬為百合科植物麥冬Ophiopogonjaponicus(L. f)Ker-Gawl.的干燥塊根，具有養(yǎng)陰生津、潤(rùn)肺清心之功效，用于治療肺燥干咳、陰虛癆嗽、津傷口渴、內(nèi)熱消渴等癥[5]。課題組前期從中分離純化出麥冬多糖，具有抗心肌缺血[6]、降低血糖、改善胰島素抵抗的作用[7]。

預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生地低聚糖、麥冬多糖組合糖具有治療糖尿病作用，故將兩者與可溶性淀粉、微粉硅膠制成地麥活性糖顆粒。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-ELSD法[8-9]同時(shí)測(cè)定地麥活性糖顆粒中果糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖的含量，以期為該制劑質(zhì)量控制提供依據(jù)，也為其臨床應(yīng)用和藥效研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1100液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技公司)；SEDEX75蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(法國(guó)SEDEX公司)；TG332A微量電子分析天平、FA2004B電子分析天平(上海精密科技儀器有限公司)；KQ-500DB超聲波清洗器儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 果糖(批號(hào)100231-201606，純度99.7%)、蔗糖(批號(hào)111507-201704，純度100%)、水蘇糖(批號(hào)112031-201701，純度90.5%)對(duì)照品均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；棉子糖對(duì)照品(批號(hào)19042322，純度99.6%)由上海同田生物技術(shù)有限公司提供。地麥活性糖顆粒(批號(hào)20190913-2)由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院制劑實(shí)驗(yàn)室制備。乙腈為色譜純，由上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 NH2P-50 4E色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈-水，梯度洗脫(0～15 min，75%～45%乙腈；15～30 min，45%乙腈)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；蒸發(fā)光散射器檢測(cè)溫度40 ℃；采集頻率3.125 Hz。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 稱取果糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖對(duì)照品適量，置于 2 mL量瓶中，超聲溶解后定容，搖勻，即得(質(zhì)量濃度分別為1.314、1.536、1.591、1.888 mg/mL)。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取本品0.1 g，置于10 mL量瓶中，加適量水超聲處理20 min，冷卻至室溫，加水定容，搖勻，0.45 μm水性微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 稱取麥冬多糖、可溶性淀粉、二氧化硅適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 專屬性考察 精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，各糖類分離度均大于1.5，陰性無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

1. 果糖 2. 蔗糖 3. 棉子糖 4. 水蘇糖

2.4 線性關(guān)系考察 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，加水稀釋成一定質(zhì)量濃度，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣量對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，并分別以信噪比3∶1、10∶1為定性限、定量限，結(jié)果見表1，可知各糖類在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，配制成低、中、高質(zhì)量濃度，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得果糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖峰面積RSD分別為0.94%～3.82%、1.05%～2.73%、1.23%～2.92%、0.77%～2.79%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，配制成低、中、高質(zhì)量濃度，于0、24、48 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得48 h內(nèi)中、高質(zhì)量濃度溶液中果糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖峰面積RSD分別為1.29%～2.17%、0.61%～1.03%、1.17%～1.49%、0.42%～0.53%；48 h內(nèi)低質(zhì)量濃度溶液中四者峰面積RSD均大于5%，而24 h內(nèi)分別為4.54%、4.59%、2.95%、2.31%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[10]報(bào)道，精密稱取本品0.1 g至10 mL量瓶中，分別加入50%、100%、150%水平對(duì)照品溶液各3份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

2.8 樣品含量測(cè)定 稱取本品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表3。由此可知，各糖類含量RSD均小于3%。

3 討論

3.1 檢測(cè)方法選擇 地麥活性糖顆粒中生地低聚糖主要由蔗糖、棉子糖、水蘇糖組成[2]，而麥冬多糖由35分子果糖、1分子葡萄糖組成[6]。課題組前期采用蒽酮-硫酸顯色法[11]測(cè)定總糖含量，發(fā)現(xiàn)生地低聚糖在沸水浴條件下顯色穩(wěn)定，重復(fù)性好，但麥冬多糖顯色不穩(wěn)定，重復(fù)性差，而且顆粒中可溶性淀粉會(huì)干擾總糖含量測(cè)定。因此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-ELSD法。

3.2 流動(dòng)相選擇 預(yù)實(shí)驗(yàn)以水、乙腈為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)在等度洗脫時(shí)采用不同流動(dòng)相比例、體積流量、檢測(cè)器溫度、信號(hào)采集頻率均不能解決水蘇糖裂峰現(xiàn)象，故改為梯度洗脫。結(jié)果，隨著流動(dòng)相極性增加，4種糖類的出峰時(shí)間縮短，其中果糖峰寬無(wú)顯著變化，而蔗糖、棉子糖、水蘇糖峰寬逐漸減小、峰面積逐漸增大，并且四者分離度良好，水蘇糖無(wú)裂縫現(xiàn)象。

3.3 提取溶劑、提取時(shí)間選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了水、15%乙腈、30%乙腈對(duì)4種糖類含量的影響，發(fā)現(xiàn)水、15%乙腈提取時(shí)四者含量無(wú)顯著差異；30%乙腈提取時(shí)水蘇糖含量高于水提時(shí)，但3批樣品中其差異較大，其原因可能為該成分在乙腈中峰寬小，響應(yīng)值高，而在有機(jī)溶劑中溶解度較小的麥冬多糖、可溶性淀粉會(huì)將其包裹，導(dǎo)致其重復(fù)性差，不利于提取，為了操作方便、數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠，故以水為提取溶劑。同時(shí)，考察了提取時(shí)間，發(fā)現(xiàn)提取15、20、30 min時(shí)4種糖類含量無(wú)顯著差異，最終確定為20 min。

表1 各糖類線性關(guān)系

表2 各糖類加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定地麥活性糖顆粒中果糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖含量，該方法無(wú)干擾，操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，可有效控制該制劑質(zhì)量，也可為其他糖類制劑的相關(guān)研究提供借鑒。

表3 各糖類含量測(cè)定結(jié)果(n=6)