上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在器官纖維化中作用及中藥干預(yù)機(jī)制的研究進(jìn)展

李 娜， 鄭 雁， 李 萍， 江開春， 高小玲， 姬新穎

(1.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河南 鄭州 450064；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450000；3.河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南 開封 475000)

器官纖維化是多種疾病終末期的共同病理變化，可導(dǎo)致器官功能衰竭，幾乎可以發(fā)生在全身所有組織和器官，常因其發(fā)病率高，早期診斷困難、預(yù)后較差，已經(jīng)成為影響全球性公共健康的重要問題。但目前治療纖維化的藥物少且功效有限[1]。越來越多的研究證實上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)不僅參與了器官纖維化的形成，而且它在組織器官纖維化發(fā)生和發(fā)展中的作用越來越受到重視[2-4]，逆轉(zhuǎn)EMT已經(jīng)成為目前治療器官纖維化的新的研究熱點。中藥以多成分、多靶點的優(yōu)勢對EMT相關(guān)干預(yù)機(jī)制的研究取得一些進(jìn)展[5-6]，本文結(jié)合器官纖維化時EMT的相關(guān)因子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等，闡明中藥單體、有效成分和復(fù)方在干預(yù)器官纖維化進(jìn)程中可能存在的調(diào)控機(jī)制。

1 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)

組織由細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成。上皮細(xì)胞是上皮組織的主要成分，它們覆蓋在人體體表和多個器官的管、腔和囊的內(nèi)表面，其特征是大量細(xì)胞呈層狀緊密排列，細(xì)胞有極性，相鄰細(xì)胞間有緊密連接和粘附等(如黏著連接、緊密連接、橋粒和縫隙連接)。基底面附著在基底膜上，與深部結(jié)締組織相連。這些結(jié)構(gòu)包繞形成了立體的3D空間，它們共同維持著細(xì)胞的極性和柵欄功能，因此上皮細(xì)胞具有相對穩(wěn)定和不可移動性。間質(zhì)細(xì)胞是間質(zhì)和結(jié)締組織的主要組成成分，分散存在于細(xì)胞基質(zhì)中，與上皮細(xì)胞相比結(jié)構(gòu)松散，細(xì)胞之間少有細(xì)胞間連接，且胞質(zhì)內(nèi)有豐富的細(xì)胞骨架，可隨著細(xì)胞骨架內(nèi)成分和密度的不同，形成不規(guī)則結(jié)構(gòu)，所以間質(zhì)細(xì)胞外形可塑，單個細(xì)胞可移動并能發(fā)生遷移。

1982年Gerenbegr和Hay在三維膠原凝膠培養(yǎng)基中首次發(fā)現(xiàn)晶狀體上皮細(xì)胞可形成偽足并轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞樣形態(tài)[7]，首次提出了EMT的概念。上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，稱為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，包括內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial mesenchymal transition,EndMT)。這樣的轉(zhuǎn)化是一個可逆的過程，反之亦然稱為“間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化”(mesenchymal epithelial-transition,MET)。EMT不僅發(fā)生在胚胎形成、組織修復(fù)再生等生理過程中，也發(fā)生在器官纖維化、慢性炎癥和腫瘤等病理過程中。2008年在冷泉港舉行的國際會議中根據(jù)EMT發(fā)生的背景、生物學(xué)行為，將其分為3種類型，Ⅰ型為參與胚胎發(fā)生和器官發(fā)育的EMT；Ⅱ型為與組織相關(guān)的EMT，包括修復(fù)、再生和器官纖維化；Ⅲ型為與惡性腫瘤相關(guān)的EMT。這3種類型的EMT有1個共同的結(jié)果，即從具有游離-基底極性的典型貼壁上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成具有間充質(zhì)表型的運動細(xì)胞[8]，細(xì)胞表型發(fā)生變化。上皮細(xì)胞之間及其與基質(zhì)之間大量的緊密連接蛋白(Zonula occludens-1，ZO-1)、細(xì)胞鈣粘蛋白的表達(dá)或功能的喪失，出現(xiàn)間葉細(xì)胞標(biāo)記，如神經(jīng)鈣黏蛋白(N-cadherin,N-cad)、波形蛋白、纖連蛋白、纖維母細(xì)胞特定蛋白1 (fibroblast specific protein 1,FSP-1)和α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)等[9]。EMT過程中細(xì)胞形態(tài)、功能的改變主要是由于基因差異性表達(dá)引起，表現(xiàn)在分子水平上上皮細(xì)胞的標(biāo)志物轉(zhuǎn)變成間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物。首先，上皮細(xì)胞標(biāo)志物的丟失，其中最顯著的是E-鈣黏蛋白(E-cadherin,E-cad)表達(dá)的降低[10]，E-cad負(fù)責(zé)維持上皮細(xì)胞的橫向接觸，通過粘附連接，促進(jìn)組織內(nèi)細(xì)胞粘附和相對不動[11]。E-cad的下調(diào)也通過1種減少E-cad轉(zhuǎn)運到細(xì)胞的中間絲-波形蛋白(vimentin，Vim)的上調(diào)被介導(dǎo)。接著，N-cad、波形蛋白、整合蛋白、纖維連接蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)等蛋白表達(dá)發(fā)展為間質(zhì)表型細(xì)胞，獲得間充質(zhì)標(biāo)記和功能[12]。然后，整合素(如纖連蛋白)表達(dá)上調(diào)，使得上皮細(xì)胞的細(xì)胞骨架的損失和板狀偽足的形成[13]，增加了對細(xì)胞凋亡的抵抗力，同時細(xì)胞遷徙、侵襲性能力增強(qiáng)。

2 Ⅱ型EMT在器官纖維化的作用

EMT對于適當(dāng)?shù)呐咛グl(fā)育至關(guān)重要，在成人傷口愈合、組織重建修復(fù)再生和器官纖維化及癌癥進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用。由損傷和炎癥引起Ⅱ型EMT，也稱為纖維化型EMT。由各種反復(fù)損傷和持續(xù)炎癥引起的器官纖維化被認(rèn)為是器官損傷愈合異常的病理結(jié)果。正常的傷口愈合包括幾個相互重疊的階段，與相關(guān)的損傷誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)重構(gòu)有關(guān)[14]。損傷修復(fù)過程中，ECM經(jīng)代謝調(diào)整，其成分會有所變化，Ⅲ型膠原減少而Ⅰ型膠原增多，使組織修復(fù)能力增強(qiáng)，大量的肌成纖維細(xì)胞前體細(xì)胞瞬時活化成肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts,MFs)，一旦組織愈合后MFs可由細(xì)胞凋亡或表型逆轉(zhuǎn)而消失。然而，器官嚴(yán)重反復(fù)慢性損傷和炎癥引起的傷口愈合反應(yīng)失調(diào)情況下，“促纖維化微環(huán)境”形成，該臟器的各種不同來源的成纖維細(xì)胞可增殖、持續(xù)激活、轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，最終引起ECM過度增多和沉積，導(dǎo)致器官發(fā)生纖維化和硬化。有大量的證據(jù)表明，在創(chuàng)傷愈合的重塑和成熟階段發(fā)揮關(guān)鍵作用的肌成纖維細(xì)胞不僅來源于骨髓，還來源于損傷部位的EMT細(xì)胞，這些細(xì)胞合成ECM成分并收縮創(chuàng)面，使損傷邊緣接近[15]。正常組織的ECM可以引導(dǎo)細(xì)胞驅(qū)動傷口的修復(fù)再生的進(jìn)程，而異常的ECM微環(huán)境可以引導(dǎo)組織細(xì)胞開始病理愈合。其中EMT轉(zhuǎn)化過程中上皮細(xì)胞完整性丟失，正是由于MMPs降解了上皮細(xì)胞間接觸的粘附連接。MMPs不僅參與了與基質(zhì)自身穩(wěn)定相關(guān)的功能，而且在基質(zhì)中傳遞細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)間的信號，并具有潛在信號放大作用。研究發(fā)現(xiàn)，EMT的誘導(dǎo)依賴于Ⅰ型膠原纖維的豐度以及其與α2β1整合素之間的相互作用，這種相互作用觸發(fā)了細(xì)胞內(nèi)的級聯(lián)反應(yīng)[16]。因此ECM的組成、細(xì)胞表面整合素豐度的改變、細(xì)胞內(nèi)信號分子產(chǎn)生、細(xì)胞外環(huán)境的刺激調(diào)控著EMT的進(jìn)展。器官纖維化可以看作是一種對各種損傷以保持組織器官的相對完整性的修復(fù)反應(yīng)，但是反復(fù)損傷和持續(xù)的炎癥反應(yīng)“促纖維化微環(huán)境”誘導(dǎo)MFs的激活和增殖，持續(xù)活化的肌成纖維細(xì)胞會產(chǎn)生大量的ECM，過量的ECM積聚導(dǎo)致器官纖維化，特別是高度表達(dá)α-SMA的肌成纖維被公認(rèn)是合成或分泌ECM的主要細(xì)胞[17]。Ⅱ型EMT在器官纖維化的發(fā)生發(fā)展過程(圖1)包括①在誘發(fā)因素(如TGF-β等生長因子等)的作用下，細(xì)胞E-cad表達(dá)下降甚至缺失；②細(xì)胞Vim表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞骨架重組，細(xì)胞向心性收縮；③基質(zhì)降解酶(如基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9等)表達(dá)上調(diào)并破壞基底膜，細(xì)胞縱向延伸，脫離基底膜，伸出突起，表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞粘附分子，最后細(xì)胞脫落；④通過細(xì)胞骨架肌動蛋白、肌球蛋白的收縮和細(xì)胞間粘附的變化，改變了細(xì)胞的形態(tài)，喪失極性、細(xì)胞連接等，增強(qiáng)了細(xì)胞運動和侵襲的能力，執(zhí)行間質(zhì)細(xì)胞的功能；⑤表達(dá)轉(zhuǎn)變成MFs前體細(xì)胞，在“促纖維化微環(huán)境”持續(xù)活化下，表達(dá)α-SMA，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)。在Ⅱ型EMT過程中，具有極性的上皮細(xì)胞在外界刺激和細(xì)胞內(nèi)其他生長因子的調(diào)控下，喪失上皮細(xì)胞表型，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂虚g質(zhì)表型的肌成纖維細(xì)胞，組織器官內(nèi)持續(xù)活化的肌成纖維細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)而導(dǎo)致器官纖維化。因此，Ⅱ型EMT在瘢痕和纖維化的發(fā)展中扮演著重要的角色。

圖1 Ⅱ型EMT在器官纖維化發(fā)生發(fā)展過程

器官纖維化是各種因素引起無法完全控制的慢性傷口修復(fù)和恢復(fù)組織功能的病理重塑結(jié)果，纖維化涉及腎臟、肺臟、肝臟、心臟和其他器官，是許多慢性退行性疾病的標(biāo)志，引起器官功能下降甚至導(dǎo)致器官衰竭。EMT參與多種組織包括器官纖維化在內(nèi)的多種纖維形成，來自上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞導(dǎo)致受損組織中的纖維結(jié)締組織過度累積，從而形成永久性瘢痕或器官功能障礙。器官纖維化發(fā)生發(fā)展過程中許多生長因子、復(fù)雜信號網(wǎng)絡(luò)和ECM等“微環(huán)境”促進(jìn)了EMT的啟動和調(diào)控[18-19]，轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、Wnt、β-catenin、Notch、Hedgehog和受體酪氨酸激酶等介導(dǎo)的信號通路可誘導(dǎo)EMT轉(zhuǎn)錄[20]。國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)部分中藥有效成分及復(fù)方可以有效阻斷EMT相關(guān)通路和發(fā)生過程。

3 中藥干預(yù)EMT的研究進(jìn)展

傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中并無肺纖維化、肝纖維化、腎纖維化等病名，而是根據(jù)疾病的臨床特征、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸等整體過程將其進(jìn)行劃分。如肺纖維化，可歸于中醫(yī)“肺痹”“肺痿”的病癥范疇，氣虛、痰瘀、血瘀為其關(guān)鍵病機(jī)；而肝纖維化屬于中醫(yī)學(xué)“脅痛”“積聚”“肝著”等范疇，臨床辯證多分為肝膽濕熱、肝郁脾虛、氣陰虛損、瘀血阻絡(luò)等證型；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的“腎纖維化”在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中可歸屬為“腎風(fēng)”“水腫”“腎衰竭”“關(guān)格”等范疇，其病機(jī)為本虛標(biāo)實，虛火上擾可致清從濁化而痰濁內(nèi)聚，滯而不化，使得瘀血與痰濁互結(jié)阻于腎絡(luò)之內(nèi)或結(jié)于腎絡(luò)，而標(biāo)實則是指濁毒、瘀血、濕邪為主，但尤其以瘀血貫穿疾病始終。因此，器官纖維化都存在“正虛血瘀”的病機(jī)特點，中醫(yī)在此領(lǐng)域具有長期的積累，根據(jù)補(bǔ)虛化瘀“異病同治”的理論基礎(chǔ)，發(fā)展中醫(yī)藥治療肺、腎、肝纖維化作用機(jī)制的研究也越來越多。

3.1 中藥通過干預(yù)EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子，影響EMT主要生物標(biāo)志物變化 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是由轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動的，這些蛋白與細(xì)胞相關(guān)的基因啟動子區(qū)結(jié)合，并抑制上皮標(biāo)記基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄，激活間質(zhì)標(biāo)記基因的表達(dá)。這些轉(zhuǎn)錄因子包括Snail1、Snail2(也稱為Slug)、E-box-binding (ZEB)、basic helix-loop-helix (bHLH)、Twist[21]、T細(xì)胞因子(TCF)、NF-κB和淋巴樣增強(qiáng)子結(jié)合因子-1 (LEF-1)[22]。

在EMT過程中，上皮細(xì)胞粘附連接E-cad被具有更大連接靈活性的蛋白N-cad取代，從而導(dǎo)致細(xì)胞分離和細(xì)胞運動性增強(qiáng)[23]。研究發(fā)現(xiàn)，E-cad功能喪失以及表達(dá)下調(diào)或抑制都可以啟動EMT，當(dāng)細(xì)胞間連接由E-cad轉(zhuǎn)化為N-cad時，促進(jìn)了細(xì)胞活動的能力[24]。中醫(yī)藥對EMT的調(diào)控較直觀地表現(xiàn)在細(xì)胞表面標(biāo)志物的改變。從傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)角度來看，氣虛、痰瘀、血瘀為肺纖維化關(guān)鍵病機(jī)，中醫(yī)從活血散瘀、益氣養(yǎng)陰、化濕祛痰、補(bǔ)肺益腎等方面進(jìn)行辨證治療。三七為五加科人參屬植物，具有散瘀止血之效，主要活性成分為三七總皂苷，阮越勇等[25]研究發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷體外干預(yù)可提高EMT過程中上皮標(biāo)志物E-Cad表達(dá)，并抑制間質(zhì)標(biāo)志物Vim的表達(dá)，對EMT過程有一定的干預(yù)作用。養(yǎng)陰益氣合劑由生黃芪、黨參、北沙參、黃精、玄參等藥物組成，具有益氣養(yǎng)陰、活血解毒之效；而肺纖方為姜良鐸教授治療肺纖維化相關(guān)疾病的經(jīng)驗方，由黃芪、紅景天、冬蟲夏草、水蛭等藥物組成，具有活血、化痰、通絡(luò)及補(bǔ)益肺腎的功效，研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)陰益氣合劑和肺纖方均可能通過上調(diào)E-cadmRNA表達(dá)，下調(diào)α-SMA、ColⅠ、LNmRNA表達(dá)，抑制博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠肺泡上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[26-27]。

3.2 中藥干預(yù)TGF-β等生長因子誘導(dǎo)EMT的分子調(diào)控機(jī)制 在器官持續(xù)損傷和炎癥因素的刺激下，組織細(xì)胞可釋放多種生長因子，并刺激同一胚層發(fā)育來的細(xì)胞或同類細(xì)胞增生促進(jìn)修復(fù)。常見的生長因子包括BMP、纖維母細(xì)胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、IGF、HGF、血小板源生長因子(PGDF)和TGF-β[28]，其中一些生長因子(GFs)，如FGF、EGF、PDGF或IGF，作為相應(yīng)受體即酪氨酸激酶跨膜蛋白的配體，形成二聚體并發(fā)生自磷酸化，刺激受體酪氨酸蛋白激酶(receptor tyrosine kinases,RTKs)，從而激活多種信號通路，包括Ras、PI3K、Src和ILK介導(dǎo)的通路[29]。這些信號級聯(lián)激活轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors,TFs)與編碼EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的基因啟動子結(jié)合，如Snail1/2、ZEB1/2和Twist，通過抑制編碼細(xì)胞粘附分子的表達(dá)基因來誘導(dǎo)EMT[30]。翁曉璐等[31]通過鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)1型糖尿病大鼠實驗發(fā)現(xiàn)，通過干預(yù)纖維細(xì)胞生長因子-21(FGF21)能明顯抑制上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而降低腎組織細(xì)胞外基質(zhì)沉積來改善糖尿病腎纖維化。腎元顆粒含藥血清中含有淫羊藿苷、黃芪甲苷、大黃素，以“溫補(bǔ)脾腎、通腑泄?jié)帷绷⒎ㄖ委熖悄虿∧I纖維化，陳立等[32]通過高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)研究發(fā)現(xiàn)，腎元顆粒含藥血清通過調(diào)節(jié)FGFR1/FGF2信號通路能改善高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。越來越多的證據(jù)表明，細(xì)胞因子TGF-β1尤其在EMT中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，它通過激活經(jīng)典的依賴Smad和非經(jīng)典的非Smad依賴信號通路和其他纖維化反應(yīng)導(dǎo)致器官纖維化[33]。

3.2.1 中藥干預(yù)TGF-β1/Smad信號通路逆轉(zhuǎn)EMT TGF-β經(jīng)典的Smads 依賴途徑中TGF-β配體與Ⅱ型和Ⅲ型受體(TGF-βRⅡ和TGF-βRⅢ)結(jié)合，導(dǎo)致Ⅰ型受體(TGF-βRⅠ)的募集和磷酸化。這激活了多種信號通路，包括SMAD2/3、Ras和PI3K介導(dǎo)的信號通路，這些信號通路激活轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)編碼EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)。除了激活SMADs，TGF-β信號也能激活抑制性SMAD蛋白質(zhì)(SMAD6和SMAD7)，結(jié)合TGF-βRⅠ并防止該通路的異常激活[33]。

研究發(fā)現(xiàn)，中藥可通過調(diào)控TGF-β1/Smad信號通路逆轉(zhuǎn)EMT，減輕肝、肺、腎、皮膚等器官的纖維化。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在治療肝纖維化時，一般在靈活運用養(yǎng)陰、活血化瘀的基礎(chǔ)上，與疏肝、清利濕熱、補(bǔ)肝腎等治法相結(jié)合。如垂盆草，為景天科植物，歸肝、膽、小腸經(jīng)，具有清熱利濕的功效，垂盆草總黃酮[34]可能通過抑制TGF-β1/Smad2/3信號通路的激活有關(guān)，抑制肝星狀細(xì)胞增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化引起肝纖維化；苦參味苦，性寒，可清熱燥濕，Wu等[35]證實，苦參素通過上調(diào)肝纖維化SD大鼠Smad7蛋白表達(dá)、下調(diào)Smad3蛋白表達(dá)，影響 TGF-β1/Smad信號通路，從而抑制ECM沉積而減輕肝纖維化?；⒄瓤苫钛?，祛風(fēng)通絡(luò)，清熱利濕，解毒；血府逐瘀湯中有當(dāng)歸、桃仁、紅花、川芎、赤芍等可活血祛瘀，生地黃配當(dāng)歸又可養(yǎng)血和血，使祛瘀而不傷陰血，運用虎杖中提取的虎杖總蒽醌和血府逐瘀湯[36-37]均可降低博來霉素溶液建立PF模型大鼠肺組織E-cad表達(dá)升高，可能通過抑制TGF-β1/Smad3信號通路，來干預(yù)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來減輕肺纖維化。梔子味苦，性寒，歸心、肺、三焦經(jīng)，可瀉火除煩，清熱利尿，為藥食同源之品，尹健彬[38]通過動物模型和體外細(xì)胞證實梔子的主要藥效成分-京尼平苷能顯著降低博萊霉素(BLM)誘導(dǎo)肺纖維化小鼠肺系數(shù)及肺組織中TGF-β1、CTGF、Smad2/3和p38蛋白的表達(dá)。冷偉等[39]發(fā)現(xiàn)，紅景天苷可能通過抑制TGF-β1/Smad通路改善鏈尿佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠腎纖維化。銀杏葉具有活血化瘀，通絡(luò)止痛之功效，阮亮[40]發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物通過下調(diào)TGF-β1的表達(dá)和降低Smad3的磷酸化并上調(diào)Smad7的表達(dá)，有效阻斷TGF-β1/Smad信號通路介導(dǎo)的EMT，組織中肌成纖維細(xì)胞數(shù)量減少，改善皮膚組織纖維化。

桑白皮可瀉肺平喘，利水消腫，主治肺熱喘痰、水飲停肺，歸肺、脾經(jīng)，在體外由TGF-β1誘導(dǎo)的人肺泡上皮細(xì)胞實驗中，桑白皮提取物樺木酸[41]下調(diào)ColⅠ和α-SMAmRNA表達(dá)，上調(diào)E-cadmRNA表達(dá)，對生長轉(zhuǎn)化因子(TGF-β1)誘導(dǎo)的人肺泡上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有抑制作用。大黃出自《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有瀉下攻積、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃的功效，龍脈[42]發(fā)現(xiàn)，大黃中的有效活性成分之一大黃素可緩解TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，其可能通過減少TGF-β1誘導(dǎo)的線粒體融合蛋白2(Mfn2)的表達(dá)來減緩腎臟纖維化；腎復(fù)康由黃芪、太子參、生地黃、山茱萸、茯苓、丹參、大黃組成，既可益氣健脾，又可補(bǔ)腎化瘀，黃上等[43]利用腎復(fù)康含藥血清處理TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞HK-2纖維化模型實驗發(fā)現(xiàn)，TGF-β1下游Smad2/3蛋白磷酸化及核內(nèi)蛋白水平降低，整聯(lián)蛋白連接激酶(ILK)表達(dá)減少，E-cadmRNA表達(dá)下降，推斷腎復(fù)康可能抑制Smad2/3/ILK 信號通路活化逆轉(zhuǎn)HK-2細(xì)胞EMT過程改變腎纖維化。

3.2.2 中藥干預(yù)TGF-β1/非Smad信號通路逆轉(zhuǎn)EMT TGF-β非Smads依賴途徑通過細(xì)胞外信號激酶(ERK)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK) 激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)和整合素連接蛋白ILK結(jié)合，磷酸化蛋白激酶B(Akt)，NF-κB信號途徑，進(jìn)而抑制Snail核轉(zhuǎn)位和β連環(huán)蛋白(β-catenin)的激酶GSK-3β的功能，啟動EMT轉(zhuǎn)錄表達(dá)。馬金蘭等[44]利用低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，低氧可致內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性增加，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化；利用細(xì)胞信號阻滯劑發(fā)現(xiàn)低氧可能通過TGF-β1-RhoA/ROCK信號通路促進(jìn)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。

中醫(yī)藥通過下調(diào)組織中p38MAPK信號通路的表達(dá)，可以減弱致纖維化細(xì)胞因子、炎癥因子表達(dá)，從而改善纖維化進(jìn)程。從中醫(yī)角度來看，腎纖維化中腎氣虛也是主要病機(jī)之一，黃芪可補(bǔ)氣升陽、固表止汗，又可利水消腫、生津養(yǎng)血。徐維佳等[45]通過體內(nèi)和體外實驗，均證實了黃芪甲苷可抑制p38 MAPK的磷酸化水平，減少TGF-β1分泌，有效阻斷由TGF-β1誘導(dǎo)的FN、ColⅣ和α-SMA的表達(dá)，改善腎小管間質(zhì)纖維化。江茜等[46]采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎法復(fù)制大鼠腎間質(zhì)纖維化模型實驗，證實尿毒康通過抑制p38/ERK MAPK，改善結(jié)扎側(cè)腎小管細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，明顯減緩大鼠的腎纖維化進(jìn)程。

3.3 中藥干預(yù)Wnt信號逆轉(zhuǎn)EMT的分子調(diào)控機(jī)制 目前已有許多研究揭示了Wnt信號通路可能參與EMT的發(fā)生發(fā)展。在經(jīng)典Wnt信號通路中，Wnt配體與7次跨膜受體Frizzled結(jié)合后抑制胞質(zhì)中GSK3β的表達(dá)，進(jìn)而使β-catenin的降解受抑而在胞質(zhì)中累積，后者進(jìn)一步作為共轉(zhuǎn)錄激活因子與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)子(TCF/LEF)共同移位至核內(nèi)并調(diào)控多個EMT相關(guān)基因的表達(dá)[47]。研究證實，Wnt信號通路的異常與腎臟、肺臟、肝臟、心臟等各種組織器官纖維化疾病的發(fā)生與進(jìn)展關(guān)系密切。Wnt信號激活，可促進(jìn)肝纖維化時肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)的增殖和活化[48]。臨床試驗和實驗研究表明，異常Wnt信號是與特發(fā)性肺纖維化的發(fā)展進(jìn)程有關(guān)，該病發(fā)生期間肺組織表達(dá)Wnt組件蛋白，并且核內(nèi)β-catenin表達(dá)增加，組織學(xué)觀察到大量的成纖維細(xì)胞形成[49-50]。腎組織Wnt/β-catenin信號通路激活促進(jìn)纖連蛋白、FSP1、Twist、Snail1、MMP-7、PAI-1和c-Myc和細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)[51]。劉金娟等[52]通過博來霉素硬皮病小鼠腹腔注射IGC-001(Wnt/β-catenin信號通路抑制劑)發(fā)現(xiàn)，小鼠真皮層明顯變薄，膠原纖維明顯減少，羥脯氨酸水平及Ⅰ型膠原蛋白、纖維鏈接蛋白、α-平滑肌肌動蛋白、波形蛋白和神經(jīng)性鈣黏蛋白表達(dá)降低，上皮性鈣粘附蛋白表達(dá)增加，β鏈蛋白表達(dá)無顯著性變化。抑制Wnt/β-catenin信號通路可延緩硬皮病小鼠皮膚組織纖維化，其機(jī)制可能抑制皮膚組織上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

研究發(fā)現(xiàn)某些中藥可通過干預(yù)Wnt信號通路抑制EMT，發(fā)揮抗器官纖維化機(jī)制。柴胡皂苷是由柴胡中提取出來的一種天然苷類混合物，性味苦、辛，微寒。管淑紅等[53]發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷D溶液可改善大鼠肺泡炎和肺纖維化程度，降低肺組織E-cad、Wnt和β-actenin蛋白表達(dá)。柴胡皂苷可能通過抑制Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路負(fù)向調(diào)節(jié)EMT過程來抑制腎纖維化進(jìn)程。熊佳俊[54]通過高糖刺激人腎小管上皮細(xì)胞實驗和鏈脲霉素糖尿病腎纖維化動物實驗均發(fā)現(xiàn)，漸尖毛蕨二氫黃酮苷可能通過降低β-catenin表達(dá)和抑制GSK-3β磷酸化失活來調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，最終減輕糖尿病腎病大鼠腎組織的纖維化。

3.4 中藥干預(yù) EMT相關(guān)microRNAs的調(diào)控機(jī)制 EMT進(jìn)程中基因表達(dá)涉及多個層面的調(diào)控，其中非編碼RNA中microRNA(miRNAs)對EMT基因能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控。它們長約20～25個核苷酸，識別靶mRNA，通過形成沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和癌變等多種生物和病理過程中調(diào)控基因表達(dá)。越來越多的證據(jù)表明，miRNAs參與了包括心臟、腎臟、肝臟和肺臟在內(nèi)的許多器官的纖維化過程[55-57]。靳立振等[58]通過TGF-β1誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞A549構(gòu)建肺纖維化模型，發(fā)現(xiàn)miR-212在TGF-β1干預(yù)A549細(xì)胞中呈高表達(dá)，TOB2表達(dá)降低，干擾miR-212 表達(dá)可通過促進(jìn)TOB2的表達(dá)而抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞纖維化及EMT轉(zhuǎn)化進(jìn)程。黃連素是清熱類中藥黃連中一種生物堿，郭小雷[59]通過高糖誘導(dǎo)的MPC-5足細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29b mimic或miR-29b inhibitor實驗，驗證了黃連素可以通過調(diào)節(jié)miR-29b水平，進(jìn)而降低高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞TGF-β1表達(dá)，阻斷足細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)率。牡丹皮為毛茛科植物牡丹的干燥根皮，具有清熱涼血、活血散瘀的功效，丹皮酚為牡丹皮最主要的藥用成分，周浩等[60]用IMR-1(Notch1/Jagged1信號通路抑制劑)治療單側(cè)輸尿管梗阻腎間質(zhì)纖維化大鼠，發(fā)現(xiàn)丹皮酚能逆轉(zhuǎn)HOTAI(RlncRNA Hox校正轉(zhuǎn)錄反義RNA)下調(diào)miR-124激活Notch1/Jagged1信號通路，干預(yù)腎間質(zhì)纖維化。

4 總結(jié)與展望

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是多細(xì)胞生物胚胎發(fā)育與器官形成中的的基本過程，在腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移以及多種慢性疾病引起器官纖維化過程中起著重要的作用[61]。器官纖維化時的EMT過程是細(xì)胞在特定的動態(tài)微環(huán)境中細(xì)胞基因差異表達(dá)和再分化的結(jié)果。引起器官纖維化的多種因素在損傷部位構(gòu)成了誘發(fā)或促進(jìn)EMT的微環(huán)境，這些因子相互作用，相互補(bǔ)充，形成一個控制EMT的大型調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[62-63]。細(xì)胞內(nèi)信號分子、細(xì)胞信號通路間存在交互通話，如TGF-β與Wnt信號通路、NF-κB以及其他信號通路。

器官纖維化如常見的臟器肝、肺、腎的纖維化，“正虛”“血瘀”為基本病機(jī)，在治療過程中，根據(jù)中醫(yī)基礎(chǔ)理論指導(dǎo)下的“異病同治”治則，為常用的如“補(bǔ)虛”“化瘀”等主要治法奠定了相關(guān)理論基礎(chǔ)和依據(jù)。中醫(yī)藥，不論中藥還是中成藥，其成分具有多樣性，其作用機(jī)制也可能通過多個靶點來實現(xiàn)，即便是中藥單一提取物，它作用機(jī)制也是多方面的，這顯然是中醫(yī)藥通過抑制EMT治療器官纖維化的獨特優(yōu)勢，但也使得中藥作用機(jī)制方面的研究變得異常的復(fù)雜和艱難。中藥單體、有效成分和復(fù)方調(diào)控EMT的不同轉(zhuǎn)錄因子、特異性生長因子、信號通路和小RNA等，顯示了其逆轉(zhuǎn)ENT治療器官纖維化的潛力。目前有些藥物已投入臨床并確有療效，但對于EMT進(jìn)程至關(guān)重要的具體因素和轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)鍵目標(biāo)基因的發(fā)現(xiàn)還有待于更深入的研究，這將為中藥更好的服務(wù)臨床以及完善中醫(yī)藥作用機(jī)制提供更多理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

考慮到臨床和動物模型中均存在著器官纖維化逆轉(zhuǎn)的情況，相信控制甚至逆轉(zhuǎn)纖維化是可行的。從總結(jié)的證據(jù)表明，EMT是一個動態(tài)的生理、病理過程，它依賴于諸多細(xì)胞分子及其相關(guān)的信號通路的相互作用。持續(xù)的EMT是包括皮膚在內(nèi)的多個器官纖維化病理的關(guān)鍵機(jī)制，EMT相關(guān)信號通路蘊(yùn)含了一些潛在的靶點，識別和了解促進(jìn)EMT的機(jī)制可能會帶來治療器官纖維化新策略。更為重要的是認(rèn)識到器官纖維化時EMT在微環(huán)境發(fā)生動態(tài)變化的本質(zhì)，可以開發(fā)出針對EMT 關(guān)鍵分子及信號通路的靶點藥物，闡明正虛血瘀的證候內(nèi)涵，必將為中醫(yī)藥對纖維化疾病的臨床防治帶來新的曙光。