松果菊苷固體脂質(zhì)納米粒的制備及其在體腸吸收特性、體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

決利利， 梁 婧， 李曉婷， 王柯靜， 周珊珊， 劉艷菊*

(1.鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 451150；2.無(wú)錫市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心，江蘇 無(wú)錫 214400)

松果菊苷是肉蓯蓉、松果菊等中藥的主要有效成分之一[1-2]，具有抗腫瘤、降血脂、抗氧化、肝保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、抗炎等活性，可用于多種系統(tǒng)疾病的治療[1,3-5]，但其溶解度僅為197.07 μg/mL，屬于極微溶解藥物，脂溶性差[6]，而且體內(nèi)容易代謝[4,7]，穩(wěn)定性不理想，導(dǎo)致口服吸收生物利用度低(0.83%)[5]。目前，鮮有關(guān)于松果菊苷新制劑技術(shù)的報(bào)道[6-7]。

固體脂質(zhì)納米粒是采用一種或幾種脂質(zhì)作為難溶性藥物載體制成的實(shí)體骨架型納米給藥系統(tǒng)[8]，可促進(jìn)藥物體外釋放及腸道吸收，增加口服吸收生物利用度[9-11]。因此，本實(shí)驗(yàn)將松果菊苷制成固體脂質(zhì)納米粒，采用在體腸灌流方法考察該制劑在大鼠不同腸段中的吸收差異，并研究其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)，以期為相關(guān)新制劑開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器 安捷倫1200型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；MSE125P型分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)；JC-2LZF型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(青島精誠(chéng)儀器儀表有限公司)；SZCL-2型磁力攪拌器(鄭州生化儀器有限公司)；BT100-1J/BZ15型蠕動(dòng)泵(重慶科耐普蠕動(dòng)泵有限公司)；M-sizer 3000型粒度分析儀(英國(guó)馬爾文儀器有限公司)；JP-040PLUS型超聲波儀(深圳市寶安區(qū)沙井潔盟德力生電器商行)；MS-3型漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；HNDK200-2型氮?dú)獯祾邇x(上海琪摩電子科技有限公司)。

1.2 試劑與藥物 松果菊苷(批號(hào)111670-201904，純度98.3%)、綠原酸(批號(hào)110753-201716，純度98.5%)對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院)；松果菊苷原料藥(批號(hào)190628，純度95%，武漢卡諾斯科技有限公司)。K-R試液(批號(hào)20201025，北京百奧萊博科技有限公司)；甘露醇(批號(hào)191123，四川博利恒藥業(yè)有限公司)；大豆磷脂(批號(hào)20190919，大連華農(nóng)豆業(yè)科技發(fā)展有限公司)；單硬脂酸甘油酯(批號(hào)20181208，上海吉至生化科技有限公司)。

1.3 動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠，雌雄不限，體質(zhì)量(220±20)g，購(gòu)自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(豫)2016-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 松果菊苷含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 Venusil XBP-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；Phenomenex C18預(yù)柱(4 mm×2 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈-0.4%磷酸(60∶40)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)333 nm。

2.1.2 供試品溶液制備 取1 mL固體脂質(zhì)納米?；鞈乙褐?0 mL量瓶中，加入10 mL甲醇超聲提取5 min，靜置20 min，流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.1.3 線性關(guān)系考察 取20.20 mg對(duì)照品至100 mL量瓶中(減重法稱量)，乙腈定容至刻度，得202 μg/mL貯備液，密封后置于冰箱中保存，取適量，流動(dòng)相稀釋至20.2、10.1、2.02、1.01、0.505、0.050 5 μg/mL，即得對(duì)照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得方程為Y=17.215 3X-0.419 4(r=0.999 9)，在0.050 5～20.2 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 方法學(xué)考察 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液，于0、3、6、9、12、24 h在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得松果菊苷含量RSD為1.06%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得松果菊苷含量RSD為1.67%，表明該方法重復(fù)性良好。取0.050 5、2.02、20.2 μg/mL對(duì)照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得松果菊苷含量RSD分別為1.14%、0.38%、0.49%，表明儀器精密度良好。取9份固體脂質(zhì)納米?；鞈乙?，每份0.5 mL，置于9個(gè)50 mL量瓶中，分為3組，分別加入202 μg/mL貯備液0.5、1、1.5 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得松果菊苷平均加樣回收率分別為101.72%、99.46%、100.85%，RSD分別為0.62%、1.17%、1.92%。

2.2 固體脂質(zhì)納米粒制備 采用冷均質(zhì)法制備[8,12]。取0.8 g單硬酯酸甘油酯、0.4 g大豆磷脂，65 ℃水浴加熱熔融，加入50 mg松果菊苷，磁力攪拌溶解得熔融液，迅速置于-65 ℃超低溫冰箱中12 h得固體物質(zhì)，適當(dāng)粉碎后置于120 mL 1%泊洛沙姆188溶液(4 ℃)中，膠體磨中形成粗分散體系，在壓力60 MPa條件下循環(huán)均質(zhì)8次，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，加蒸餾水至120 mL，即得。再以5%甘露醇為凍干保護(hù)劑，加到固體脂質(zhì)納米?；鞈乙褐?，搖勻，在-30 ℃下預(yù)凍2 d，迅速置于凍干機(jī)中，抽真空后冷凍干燥1 d，得到凍干粉。

2.3 包封率、載藥量測(cè)定 取固體脂質(zhì)納米?；鞈乙? mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定松果菊苷總量W0；取1 mL固體脂質(zhì)納米?；鞈乙褐岭x心管中，4 ℃、12 500 r/min離心30 min，取上清液，測(cè)定游離松果菊苷量W1；將沉淀物在-30 ℃下預(yù)凍2 d，迅速置于凍干機(jī)中，抽真空后冷凍干燥1 d，測(cè)定松果菊苷和脂質(zhì)總量W，計(jì)算包封率、載藥量，公式分別為包封率=[(W0-W1)/W0]×100%、載藥量=[(W0-W1)/W]×100%。結(jié)果，3批固體脂質(zhì)納米粒混懸液平均包封率為(83.34±1.41)%，載藥量為(3.19±0.23)%。

2.4 粒徑、Zeta電位測(cè)定 取固體脂質(zhì)納米?；鞈乙?.1 mL，蒸餾水稀釋40倍后測(cè)定其粒徑、Zeta電位。結(jié)果，固體脂質(zhì)納米?；鞈乙浩骄綖?192.07±9.14)nm，PDI為0.107±0.013，而其凍干粉復(fù)溶后兩者分別為(237.77±9.14)nm、0.186±0.024，見圖1；兩者Zeta電位分別為(-22.64±2.13)、(-18.71±2.24)mV，見圖2。

圖2 松果菊苷固體脂質(zhì)納米粒Zeta電位

2.5 XRPD掃描 取松果菊苷、空白輔料、物理混合物(松果菊苷與空白輔料比例同固體脂質(zhì)納米粒凍干粉)、固體脂質(zhì)納米粒凍干粉適量，設(shè)定掃描范圍為3°～45°，速度為6°/min，結(jié)果見圖3。由此可知，松果菊苷在10°～30°范圍內(nèi)出現(xiàn)多處晶型峰；物理混合物在11.9°、16.3°、16.8°、25.8°等處仍可見其晶型峰；固體脂質(zhì)納米粒凍干粉僅見空白輔料的晶型峰，松果菊苷晶型峰均消失，表明該成分變?yōu)闊o(wú)定型物質(zhì)。

注：a～d分別為松果菊苷、空白輔料、物理混合物、固體脂質(zhì)納米粒凍干粉。

2.6 油水分配系數(shù)測(cè)定 參考文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道，取過(guò)量松果菊苷、物理混合物、固體脂質(zhì)納米粒凍干粉適量，加入正辛醇飽和的水相，超聲處理30 min，固定于振蕩器上，37 ℃、100 r/min振蕩1 d，取上層混懸液，過(guò)0.22 μm水膜，測(cè)定在水中的溶解度C1，同法測(cè)定在蒸餾水飽和正辛醇中的溶解度C2，計(jì)算油水分配系數(shù)P，公式為P=(C1-C2)/C2，并計(jì)算lgP。結(jié)果，松果菊苷、物理混合物、固體脂質(zhì)納米粒凍干粉lgP分別為0.106、0.139、0.807，表明固體脂質(zhì)納米粒可增加松果菊苷油水分配系數(shù)，有助于該成分透膜吸收。

2.7 體外釋藥研究 取適量松果菊苷及其固體脂質(zhì)納米粒凍干粉(含30 mg松果菊苷)，加入3 mL空白釋放介質(zhì)得混懸液，轉(zhuǎn)移至透析袋中(截留分子量12～14 kDa)，一端用細(xì)尼龍繩扎緊，另一端固定于攪拌槳上，釋藥介質(zhì)為1 000 mL蒸餾水，設(shè)定轉(zhuǎn)速、溫度分別為75 r/min、37 ℃，于0、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、18、24、36 h各取樣3 mL，補(bǔ)加空白釋放介質(zhì)，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，測(cè)定松果菊苷含量，計(jì)算累積釋放度，結(jié)果見圖4。由此可知，在8 h，原料藥釋放度達(dá)94.48%，而固體脂質(zhì)納米粒僅為65.04%，屬于快速釋藥期；在8～36 h，固體脂質(zhì)納米粒累積釋放度呈緩慢增加趨勢(shì)，36 h內(nèi)達(dá)84.06%。

圖4 松果菊苷體外釋藥曲線(n=6)

2.8 在體腸吸收特性研究

2.8.1 腸灌流溶液制備 取K-R試液進(jìn)行在體腸灌流操作，收集流出液，作為空白腸灌流液。取松果菊苷及其固體脂質(zhì)納米粒凍干粉適量，空白腸灌流液配制15 mL(以松果菊苷計(jì)，質(zhì)量濃度為40 μg/mL)，即得。

2.8.2 含藥灌流液穩(wěn)定性 取“2.8.1”項(xiàng)下含藥灌流液，置于37 ℃恒溫水浴中，于0、15、30、45、60、90、120 min各取樣1 mL，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，原料藥、固體脂質(zhì)納米粒灌流液峰面積RSD分別為0.71%、1.14%，表明含藥灌流液在K-R試液中穩(wěn)定性良好。

2.8.3 腸壁對(duì)灌流液中藥物的物理吸附 剪取腸段，K-R試液沖洗3次，置于松果菊苷及其固體脂質(zhì)納米粒灌流液中孵育2 h，K-R試液沖洗2次，分別測(cè)定孵育前和孵育2 h后松果菊苷剩余藥量。結(jié)果，原料藥、固體脂質(zhì)納米粒灌流液剩余藥量分別為98.74%、101.26%，RSD分別為0.62%、0.81%，表明大鼠腸壁對(duì)灌流液中藥物無(wú)明顯的吸附作用。

2.8.4 實(shí)驗(yàn)操作 取禁食12 h(可自由飲水)的大鼠12只，隨機(jī)分為松果菊苷組、松果菊苷固體脂質(zhì)納米粒組，腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，仰臥固定于37 ℃保溫墊上，實(shí)驗(yàn)用管道均在同濃度灌流液中過(guò)夜浸泡，沿腹部中線打開腹腔，分離十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸，在待灌流腸段上部和下部用手術(shù)剪開口(勿剪斷)，插管后扎緊，K-R試液沖洗內(nèi)容物。大鼠腹部覆蓋浸有生理鹽水的紗布(適時(shí)灑生理鹽水以保濕)，設(shè)置灌流液體積流量為0.2 mL/min，開啟蠕動(dòng)泵，收集流出液，1 h后停止灌流，K-R試液沖洗2次，合并流出液，采用重量法對(duì)其體積進(jìn)行校正。剪斷灌流結(jié)束腸段，記錄內(nèi)徑(r)、長(zhǎng)度(l)，流出液6 500 r/min離心30 min，測(cè)定松果菊苷質(zhì)量濃度，計(jì)算吸收速率常數(shù)Ka、表觀吸收系數(shù)Papp，公式分別為Ka=(1-CoutQout/CinQin)Q/V、Papp=-Qln(CoutQout/CinQin)/2πrl，其中Qin、Qout分別為進(jìn)、出灌流液體積，Cin、Cout分別為進(jìn)、出灌流液濃度，Q為灌流液體積流量，V為待考察腸段體積。

2.8.5 結(jié)果分析 表1顯示，松果菊苷在各腸段中均有一定程度的吸收，其中結(jié)腸段吸收較差；將該成分制成固體脂質(zhì)納米粒后，Ka、Papp在各腸段中均升高(P<0.01)，其中結(jié)腸段更明顯，推測(cè)可能存在結(jié)腸靶向。

表1 松果菊苷吸收參數(shù)

2.9 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

2.9.1 血漿處理 參考文獻(xiàn)[2]報(bào)道，取血漿100 μL至5 mL離心管中，加入50 μL內(nèi)標(biāo)(綠原酸)溶液(10 μg/mL)，渦旋15 s后加入1 mL甲醇沉淀蛋白，密封后渦旋3 min，8 500 r/min離心6 min，移取上層有機(jī)相至另一離心管中，置于40 ℃氮吹儀中緩慢吹干得殘?jiān)?，加?00 μL乙腈超聲處理30 s進(jìn)行復(fù)溶，進(jìn)樣分析。

2.9.2 分組、給藥與采血 取松果菊苷適量，加入3 mL 0.5%CMC-Na制成混懸液(6 mg/mL)，同法制備固體脂質(zhì)納米粒凍干粉混懸液。取禁食12 h的大鼠12只(雌雄兼具)，分為2組，灌胃給予2種混懸液(50 mg/kg)，于0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12 h采血約0.3 mL，置于涂抹肝素的離心管中，振蕩混勻，3 000 r/min離心3 min，保存于-15 ℃冰箱中。

2.9.3 線性關(guān)系考察 大鼠麻醉后心臟采血，置于涂抹肝素的離心管中，振蕩混勻，3 000 r/min離心3 min，取上清液，即為空白血漿。取松果菊苷對(duì)照品適量，空白血漿制成1 600、800、400、200、100、20 ng/mL血漿對(duì)照品溶液，按“2.9.1”項(xiàng)下方法處理，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得方程為Y=0.016 2X+0.110 7(r=0.996 3)，在20～1 600 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.9.4 方法學(xué)考察 取給藥固體脂質(zhì)納米粒后1 h的血漿，于0、2、4、6、8、12 h在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得松果菊苷含量RSD為8.61%，表明血漿在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取20、400、1 600 ng/mL血漿對(duì)照品溶液適量，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得松果菊苷含量RSD分別為9.36%、5.19%、6.04%，表明儀器精密度良好。取上述3種溶液適量，按“2.9.1”項(xiàng)下方法處理，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得松果菊苷含量RSD分別為10.17%、7.56%、8.90%，表明該方法重復(fù)性良好。取上述3種溶液適量，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得松果菊苷平均加樣回收率分別為90.14%、95.62%、92.38%，RSD分別為7.16%、4.31%、5.28%。

2.9.5 結(jié)果分析 圖5、表2顯示，與原料藥比較，固體脂質(zhì)納米粒tmax延長(zhǎng)(P<0.01)，Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.01)，相對(duì)生物利用度提高至3.82倍。

圖5 松果菊苷血藥濃度-時(shí)間曲線(n=6)

表2 松果菊苷主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

3 討論

陳靜等[15]采用乳化固化法制備松果菊苷固體脂質(zhì)納米粒，但其包封率不足60%，可能是藥物處方中含有表面活性劑，在超聲增溶作用下使藥物進(jìn)入水相，從而影響脂質(zhì)載體對(duì)藥物的包裹效率。本實(shí)驗(yàn)采用冷均質(zhì)法制備該制劑，無(wú)需超聲提取，有助于減少藥物向水相的轉(zhuǎn)移[8]，包封率達(dá)(80.24±1.53)%。

由于在體腸灌流實(shí)驗(yàn)時(shí)大鼠各個(gè)腸段除了吸收藥物外，同時(shí)還吸收水分，故本實(shí)驗(yàn)采用重量法對(duì)灌流體積進(jìn)行校正，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果，松果菊苷固體脂質(zhì)納米粒Ka、Papp在大鼠結(jié)腸中的升高程度最大，可能是該處存在大量淋巴液[16]，從而增加該成分淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)所致。

一般認(rèn)為，當(dāng)Papp小于3×10-6時(shí)，藥物吸收較差[17]，而松果菊苷各腸段Papp均小于該數(shù)值，提示腸道吸收受限是該成分口服吸收較差的原因之一，而本實(shí)驗(yàn)將其制成固體脂質(zhì)納米粒，可顯著提高該參數(shù)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，松果菊苷在固體脂質(zhì)納米粒中變?yōu)闊o(wú)定型物質(zhì)，該形態(tài)往往比晶型藥物具有更高的生物利用度[18-19]；固體脂質(zhì)納米粒提高了松果菊苷油水分配系數(shù)，也有助于促進(jìn)該成分吸收[14,20]，從而提高其口服吸收生物利用度；與原料藥比較，固體脂質(zhì)納米粒tmax延長(zhǎng)，可能是因?yàn)橹|(zhì)載體的包裹作用及胃腸道對(duì)納米藥物的吸附作用，導(dǎo)致部分藥物釋放延緩，從而影響tmax。