冬凌草甲素通過下調(diào)lncRNA AFAP1-AS1表達對人乳腺癌細胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用

李志明， 黃 勇， 龍 鳳,2*， 孫少康， 劉曉燕， 趙 玉

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

乳腺癌是女性最常見的癌癥之一，已成為世界第一大癌癥[1]。三陰性乳腺癌是乳腺癌的一種亞型，由于其特殊的分子異質(zhì)性及高侵襲性，目前藥物、手術(shù)效果均欠佳[2-5]，故明確本病內(nèi)在分子機制，研發(fā)高效、低毒、可靶向性的抗癌新藥及藥物組合刻不容緩。冬凌草甲素是冬凌草的主要活性成分，多次被報道在乳腺癌中扮演抗癌角色，但其具體抗癌分子機制尚不明確。已有研究表明AFAP1-AS1在乳腺癌中高表達，患者具有較高的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)風(fēng)險[6]，敲低AFAP1-AS1可通過影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關(guān)基因的表達來抑制三陰性乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[7]。lncRNA可充當(dāng)microRNA(miRNA)海綿或競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)，調(diào)控下游靶基因，影響癌細胞惡性生物學(xué)行為。因此，本研究觀察siRNA靶向沉默lncRNAAFAP1-AS1并聯(lián)合冬凌草甲素對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲及EMT的影響，分析冬凌草甲素抗三陰性乳腺癌可能的ceRNA調(diào)控分子機制，旨在進一步揭示冬凌草甲素抗乳腺癌作用的新分子靶標(biāo)，以期為以lncRNAAFAP1-AS1為靶點研發(fā)治療乳腺癌的靶向藥物及藥物組合提供藥理學(xué)依據(jù)和奠定科學(xué)理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細胞株 人乳腺癌MDA-MB-231細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞庫，編號TCHu227。

1.2 試劑與藥物 冬凌草甲素(批號3239848，純度94.2%)購自美國Merck公司。CCK-8試劑盒(批號LK811)購自日本同仁公司；Transwell小室(批號02920022)、Matrigel基底膠(批號9343008)購自美國Corning公司；riboSCRIPTTM mRNA/lncRNA qRT-PCR Starter Kit試劑盒(批號S1230)、人屬AFAP1-AS1引物(批號T0814)、riboFECT CP Transfection Kit(批號T0915)、RiboTM h-AFAP1-AS1 Smart Silencer-2(批號T0824)、lncRNA Smart Silencer NC#1(批號T0710)購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；兔抗人GAPDH(批號YM3215)、Vimentin(批號YT4879)、E-cadherin(批號YT1454)、N-cadherin多克隆抗體(批號YT2988)，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(批號RS002)均購自蘇州睿瀛生物技術(shù)有限公司；兔單克隆抗體CDC42(批號ab187643)購自英國Abcam公司；小鼠單克隆抗體MAP3K10(批號sc-393675)購自美國Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗(批號CR2012171)購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 儀器 HERAcell VIOS 160i型CO2恒溫培養(yǎng)箱、Varioskan LUX型酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；LightCycler?96型實時熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)；PowerPacTM Basic型電泳槽/電轉(zhuǎn)移裝置(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 人乳腺癌MDA-MB-231細胞加到含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期者進行實驗。

2.2 細胞轉(zhuǎn)染及分組 采用riboFECTTM CP試劑盒、RiboTM lncRNA Smart Silencer試劑沉默MDA-MB-231細胞中AFAP1-AS1表達，由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成AFAP1-AS1 siRNA的靶序列和包括在人轉(zhuǎn)錄組中沒有靶標(biāo)的siRNA作為非靶標(biāo)對照(si-NC)。用riboFECTTM CP轉(zhuǎn)染試劑在6孔板中以30%～50%的細胞密度進行siRNA轉(zhuǎn)染，并孵育48 h。取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞，以4 μg/mL冬凌草甲素處理的細胞作為冬凌草甲素組；將si-NC、si-AFAP1-AS1分別轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細胞中，作為siNC、siAFAP1-AS1組；將si-NC、si-AFAP1-AS1分別轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細胞中，再用4 μg/mL冬凌草甲素處理，分別作為siNC+冬凌草甲素、siAFAP1-AS1+冬凌草甲素組；對照組加入含或者不含有血清、0.1% DMSO的DMEM培養(yǎng)液。

2.3 CCK-8法檢測細胞活力 以每孔3×103個細胞的密度接種到96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜后將細胞培養(yǎng)液更換為含有不同質(zhì)量濃度冬凌草甲素(0、2、4、6、8 μg/mL，DMSO溶解)的新鮮培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24、48、72 h；或?qū)⒓毎础?.2”項下方法分組及給藥，培養(yǎng)48 h，加入CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，采用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測光密度(OD)值。對照孔細胞存活率為100%，計算各組細胞相對存活率。

2.4 RT-qPCR法檢測AFAP1-AS1 mRNA表達 收集各組細胞，采用RNAiso Plus試劑提取總RNA，超微量核酸蛋白測量儀在260 nm/280 nm波長處檢測RNA濃度。根據(jù)riboSCRIPTTM mRNA/lncRNA qRT-PCR Starter Kit試劑盒說明書檢測各組細胞AFAP1-AS1 mRNA表達，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，延伸30 s，共40個循環(huán)。AFAP1-AS1正向引物序列5′-CGGCATCCAACTCACAAGAC-3′，反向引物序列5′-GTCCTCTTCCCATGTGAGTCATC-3′，GAPDH內(nèi)參引物由廣州銳博生物技術(shù)有限公司提供。采用2-ΔΔCT法分析AFAP1-AS1相對表達。

2.5 劃痕實驗 將各組細胞以每孔1×106個的密度接種于含完全培養(yǎng)基的6孔板中，待細胞生長至80%～90%后更換為不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，200 μL槍頭在每孔中劃線，PBS洗去脫落的細胞，加入無血清的含藥或不含藥培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h，在倒置顯微鏡下觀察0、48 h劃痕愈合的情況，并計算遷移率。實驗重復(fù)3次。

2.6 Transwell侵襲實驗 將40 μL用DMEM稀釋后的基質(zhì)膠均勻鋪在Transwell小室底部，在37 ℃下孵化過夜，將各組MDA-MB-231細胞密度調(diào)整為5×105/mL。Transwell上室加入100 μL細胞懸液，下室每孔加入500 μL含20%胎牛血清的DMEM養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用棉簽拭子擦除小室上層未侵襲的細胞，4%福爾馬林固定膜下的細胞，0.1%結(jié)晶紫染色，在倒置顯微鏡下拍照計數(shù)。

2.7 Western blot法檢測CDC42、MAP3K10蛋白及EMT相關(guān)蛋白表達 取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞接種于6孔板中，按“2.2”項下方法分組及給藥，培養(yǎng)48 h后收集細胞，采用高效RIPA裂解液裂解并提取蛋白，BCA法檢測蛋白濃度并定量。蛋白樣品加入4×蛋白上樣緩沖液，水浴加熱變性，保存?zhèn)溆?。將各組蛋白加至PAGE膠中進行電泳，再移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉40 min，加入一抗GAPDH(1∶5 000)、Vimentin(1∶1 000)、E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 500)、CDC42(1∶10 000)、MAP3K10(1∶500)，在4 ℃下孵育過夜，1×TBST洗膜3次，每次10 min，加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)或HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，1×TBST洗膜3次，每次10 min。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒和Western印跡成像系統(tǒng)檢測目標(biāo)條帶灰度，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，計算目的蛋白相對表達。

3 結(jié)果

注：與正常組織比較，**P<0.01；與AFAP1-AS1低表達組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.1 lncRNAAFAP1-AS1在三陰性乳腺癌組織中高表達并與乳腺癌患者不良預(yù)后有關(guān) 分別通過GEPIA2和lnCAR database在線工具分析AFAP1-AS1在三陰性乳腺癌組織中的表達，結(jié)果如圖1A～1B所示，可知AFAP1-AS1在正常乳腺組織和三陰性乳腺癌組織中差異性表達(P<0.01)；與正常乳腺組織比較，AFAP1-AS1在三陰性乳腺癌組織中高表達(P<0.01)。為了進一步探討AFAP1-AS1在乳腺癌患者中的預(yù)后意義，通過lnCAR database在線工具“survival analysis模塊”分析AFAP1-AS1表達與乳腺癌患者總生存期和無復(fù)發(fā)生存期的相關(guān)性，結(jié)果如圖1C～1D所示，與AFAP1-AS1低表達的乳腺癌患者比較，AFAP1-AS1高表達的乳腺癌患者的生存期降低(P<0.05，P<0.01)。

3.2 冬凌草甲素調(diào)控lncRNAAFAP1-AS1表達對MDA-MB-231細胞增殖的影響 如表1所示，與對照組比較，冬凌草甲素組細胞存活率降低，并呈現(xiàn)時間和劑量依賴性(P<0.05，P<0.01)。如表2所示，與對照組比較，冬凌草甲素下調(diào)了MDA-MB-231細胞中AFAP1-AS1 mRNA表達(P<0.05)。

如表3所示，與si-NC組比較，沉默AFAP1-AS1表達后，細胞存活率降低(P<0.01)，siAFAP1-AS1和冬凌草甲素聯(lián)合使用對MDA-MB-231細胞活力的抑制作用比單獨應(yīng)用siAFAP1-AS1或冬凌草甲素更為明顯(P<0.01)。

表1 冬凌草甲素對MDA-MB-231細胞存活率的影響

表2 冬凌草甲素或siAFAP1-AS1對MDA-MB-231細胞AFAP1-AS1 mRNA表達的影響

表3 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1對MDA-MB-231細胞存活率的影響

3.3 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1對MDA-MB-231細胞遷移和侵襲的影響 如圖2、表4所示，與si-NC組比較，siAFAP1-AS1組細胞相對遷移率、侵襲細胞數(shù)均降低(P<0.05)；siAFAP1-AS1和冬凌草甲素聯(lián)合使用對細胞遷移、侵襲的抑制作用比單獨應(yīng)用siAFAP1-AS1或冬凌草甲素更顯著(P<0.01)。

圖2 各組MDA-MB-231細胞遷移(A)和侵襲(B)能力(×200)

表4 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1對MDA-MB-231細胞遷移和侵襲的影響

3.4 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1對MDA-MB-231細胞中EMT相關(guān)蛋白表達的影響 如圖3、表5所示，與對照組比較，冬凌草甲素組和siAFAP1-AS1組細胞E-cadherin蛋白表達均升高(P<0.05，P<0.01)，N-cadherin和Vimentin蛋白表達均降低(P<0.05，P<0.01)；siAFAP1-AS1和冬凌草甲素聯(lián)合使用上調(diào)E-cadherin蛋白表達，下調(diào)N-cadherin和Vimentin蛋白表達的作用比單獨應(yīng)用冬凌草甲素或siAFAP1-AS1更顯著(P<0.01)。

圖3 各組MDA-MB-231細胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達

3.5 基于生物信息學(xué)分析lncRNAAFAP1-AS1的靶基因 在線數(shù)據(jù)庫ENCORI、DIANA-LncBasev.2預(yù)測與AFAP1-AS1相互作用的microRNA，取交集篩選出2個候選miRNA(圖4A)為miR-2278、miR-155-5p。有研究報道，miR-155-5p是三陰性乳腺癌中差異上調(diào)的miRNA且miR-155-5p和AFAP1-AS1之間存在互補位點[8-9]。通過在線數(shù)據(jù)庫ENCORI、miRDB和TargetScan7.2預(yù)測miR-155-5p的靶基因，共找到包括絲裂原活化蛋白激酶激酶10(MAP3K10)在內(nèi)的220個靶基因(圖4B)。通過Bioconductor在線軟件對220個靶基因進行GO(圖4C)和KEGG信號通路(圖4D)分析，發(fā)現(xiàn)其共同靶點主要富集于DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、鈣黏蛋白結(jié)合和細胞粘附分子結(jié)合等關(guān)鍵生物過程；主要富集于多種癌癥通路，MAPK、PI3K-Akt和催乳素信號通路。

表5 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1對MDA-MB-231細胞EMT相關(guān)蛋白表達的影響

圖4 生物信息學(xué)分析

3.6 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1對MDA-MB-231細胞中CDC42、MAP3K10蛋白表達的影響 如圖5、表6所示，與對照組比較，冬凌草甲素和siAFAP1-AS1均可下調(diào)CdC42、MAP3K10蛋白表達(P<0.05，P<0.01)；siAFAP1-AS1和冬凌草甲素聯(lián)合使用對細胞CdC42、MAP3K10蛋白表達的抑制作用比單獨應(yīng)用冬凌草甲素或siAFAP1-AS1更顯著(P<0.01)。

圖5 各組MDA-MB-231細胞中Cdc42、MAP3K10蛋白表達

4 討論

目前已證實lncRNA作為新功能調(diào)控分子，參與多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程[10-11]。一項薈萃分析顯示，AFAP1-AS1在多種癌癥中均上調(diào)，AFAP1-AS1高表達與不良的臨床結(jié)果(如淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移)密切相關(guān)并參與腫瘤進展[12]。

表6 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1對MDA-MB-231細胞Cdc42、MAP3K10蛋白表達的影響

本研究通過在線數(shù)據(jù)庫分析，進一步證明了AFAP1-AS1過表達與乳腺癌患者總生存期和無復(fù)發(fā)生存期呈負相關(guān)。冬凌草甲素被報道可下調(diào)人胰腺癌BxPC-3和PANC-1細胞中AFAP1-AS1的表達[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，冬凌草甲素可下調(diào)細胞中AFAP1-AS1表達，與報道一致，結(jié)果表明AFAP1-AS1可能是冬凌草甲素治療乳腺癌的潛在分子靶標(biāo)。

本研究探討了冬凌草甲素聯(lián)合siAFAP1-AS1對人乳腺癌MDA-MB-231細胞的影響，結(jié)果表明，冬凌草甲素組和siAFAP1-AS1組細胞活力、遷移率和侵襲率均降低，且聯(lián)合使用對細胞抑制作用更顯著。EMT是腫瘤遷移的早期事件，它與細胞間連接的結(jié)構(gòu)變化有關(guān)，對癌細胞遷移至關(guān)重要，本研究結(jié)果表明，與單獨應(yīng)用冬凌草甲素或siAFAP1-AS1比較，冬凌草甲素聯(lián)合siAFAP1-AS1可降低EMT相關(guān)標(biāo)記蛋白N-cadherin、Vimentin蛋白表達，升高E-cadherin蛋白表達，提示冬凌草甲素聯(lián)合siAFAP1-AS1治療乳腺癌可獲得更佳的抗癌療效。

研究表明lncRNA參與ceRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，它維持調(diào)控癌細胞中基因通路的活性和功能平衡[14-15]。本研究通過在線數(shù)據(jù)庫分析共找到包括MAP3K10在內(nèi)的220個靶基因，而MAPK為顯著性富集的信號通路之一。MAP3K10是MAPK信號通路關(guān)鍵調(diào)控分子，可通過激活MKK4和MKK7激活JNK通路，參與細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)過程[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)，MAP3K10在胰腺導(dǎo)管腺癌組織和細胞系中表達上調(diào)，MAP3K10過表達促進胰腺癌細胞增殖[18]。細胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42, Cdc42)是MAP3K10上游的信號分子，參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞遷移和侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細胞周期進程和腫瘤血管生成等[19]。在乳腺癌中，Cdc42能夠與下游效應(yīng)蛋白相互作用，抑制表皮生長因子受體降解，從而使MAPK被持續(xù)激活，最終造成腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移[20]。因此，推測Cdc42/MAP3K10可能作為AFAP1-AS1靶點參與冬凌草甲素和siAFAP1-AS1抑制MDA-MB-231細胞惡性生物學(xué)行為的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，單獨應(yīng)用冬凌草甲素或siAFAP1-AS1均可下調(diào)MDA-MB-231細胞中CDC42、MAP3K10蛋白表達；聯(lián)合使用對細胞中CDC42、MAP3K10蛋白表達的抑制作用更顯著，提示冬凌草甲素和 siAFAP1-AS1對Cdc42/MAP3K10信號通路存在一定的抑制作用。

綜上所述，冬凌草甲素對MDA-MB-231細胞生長、遷移和侵襲的抑制作用可能是通過下調(diào)AFAP1-AS1表達進而抑制Cdc42/MAP3K10信號通路實現(xiàn)的。此實驗結(jié)果為冬凌草甲素應(yīng)用于乳腺癌的治療提供了新的藥理學(xué)依據(jù)，為以lncRNAAFAP1-AS1為靶點研發(fā)治療乳腺癌的靶向藥物及藥物組合提供了可能。