GC法同時(shí)測定3種川芎茶調(diào)制劑中8種揮發(fā)性成分

劉 杰， 劉長河， 王艷艷

(河南省中醫(yī)藥研究院,河南 鄭州 450004)

川芎茶調(diào)散始載于《太平惠民和劑局方》，由川芎、白芷、羌活、細(xì)辛、防風(fēng)、荊芥、薄荷、甘草組成，具有疏風(fēng)止痛功效，用于治療風(fēng)邪頭痛、惡寒、發(fā)熱、鼻塞等癥，2020年版《中國藥典》收載了該方及其丸劑、顆粒劑等現(xiàn)代劑型[1]。研究表明，川芎茶調(diào)散具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎作用[2]，能預(yù)防偏頭痛[3]，顆粒劑也有著解熱鎮(zhèn)痛活性[4]。目前，關(guān)于川芎茶調(diào)制劑的研究包括液質(zhì)聯(lián)用法測定丸劑成分含量[5]、HPLC-CAD法測定散劑、顆粒劑成分含量[6-7]、HPLC法建立顆粒劑指紋圖譜[8]、GC-MS法分析揮發(fā)性成分組成[9-10]、顆粒劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[11]。

川芎茶調(diào)制劑中羌活[12-13]、薄荷[14]、荊芥[15]、川芎[16-17]含有多種揮發(fā)性成分，但2020年版《中國藥典》僅在川芎茶調(diào)顆粒項(xiàng)下有薄荷腦的TLC鑒別。因此，本實(shí)驗(yàn)參照藥典和文獻(xiàn)[1,18]報(bào)道，建立GC法同時(shí)測定川芎茶調(diào)散、丸、顆粒中α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮、胡椒酮、藁本內(nèi)酯的含量，以期更全面地評(píng)價(jià)上述制劑質(zhì)量。

1 材料

Clarus 500氣相色譜儀，配置FID檢測器、TotalChrom色譜數(shù)據(jù)工作站(美國PE公司)；DB-5石英毛細(xì)管氣相色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)(美國Agilent Technologies公司)；SB-5200DT超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；AE240電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。

川芎茶調(diào)散(河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院制劑室，批號(hào)210401、210501、210502、210601、210602)；川芎茶調(diào)丸(山西華康藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20200801、20200802、20200803、20210203、20210401、20210404)；川芎茶調(diào)顆粒(貴州威門藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)201003、201201、B201001、B201003、B201102；湖南安邦制藥股份有限公司，批號(hào)210301；國藥集團(tuán)德眾佛山藥業(yè)有限公司，批號(hào)21001)。

薄荷腦(批號(hào)110728-201707，純度99.8%)對(duì)照品購自中國食品藥品檢定研究院；α-蒎烯(批號(hào)PS020431，純度96.55%)、β-蒎烯(批號(hào)PS020105，純度95.53%)、檸檬烯(批號(hào)PS020126，純度97.19%)、(-)-薄荷酮(批號(hào)PS020152，純度94.44%)、胡薄荷酮(批號(hào)PS012550，純度99.50%)、胡椒酮(批號(hào)PS020565，純度95.0%)、藁本內(nèi)酯(批號(hào)PS011687，純度98.0%)對(duì)照品均購自成都普思生物科技股份有限公司。所用試劑均為分析純；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品α-蒎烯4.92 mg、β-蒎烯5.16 mg、檸檬烯9.58 mg、薄荷酮31.02 mg、薄荷腦55.92 mg、胡薄荷酮14.52 mg、胡椒酮6.58 mg、藁本內(nèi)酯34.25 mg，置于同一25 mL量瓶中，乙酸乙酯定容至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為0.196 8、0.206 4、0.383 2、1.240 8、2.236 8、0.580 8、0.263 2、1.370 mg/mL的貯備液，精密量取1、1、1、2、5 mL，分別置于50、25、10、10、10 mL量瓶中，乙酸乙酯定容至刻度，搖勻，即得(各成分質(zhì)量濃度分別為α-蒎烯0.003 94、0.007 87、0.019 7、0.039 4、0.098 4、0.197 mg/mL，β-蒎烯0.004 13、0.008 26、0.020 6、0.041 3、0.103、0.206 mg/mL，檸檬烯0.007 66、0.015 3、0.038 3、0.076 6、0.192、0.383 mg/mL，薄荷酮0.024 8、0.049 6、0.124、0.248、0.620、1.241 mg/mL，薄荷腦0.044 7、0.089 5、0.224、0.447、1.118、2.237 mg/mL，胡薄荷酮0.011 6、0.023 2、0.058 1、0.116、0.290、0.581 mg/mL，胡椒酮0.005 26、0.010 5、0.026 3、0.052 6、0.132、0.263 mg/mL，藁本內(nèi)酯0.027 4、0.054 8、0.137、0.274、0.685、1.370 mg/mL)。

2.1.2 供試品溶液 取散劑約8 g、丸劑和顆粒劑各約12 g，精密稱定，置于500 mL燒瓶中，加200 mL水，連接揮發(fā)油提取器，自提取器上端加水至充滿刻度并溢流入燒瓶為止，再緩慢加入乙酸乙酯4 mL，接上冷凝管回流提取4 h，放冷，從提取器上端小心吸取乙酸乙酯層，通過鋪有少許無水硫酸鈉的漏斗至10 mL量瓶中，乙酸乙酯分次洗滌提取器及冷凝管，洗滌液通過漏斗并入量瓶中，乙酸乙酯定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 取缺羌活、缺薄荷、缺荊芥、缺川芎的陰性樣品適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2 色譜條件 載氣氮?dú)猓怀绦蛏郎?初始100 ℃保持2 min，5 ℃/min升至200 ℃，20 ℃/min升至220 ℃，保持7 min)；進(jìn)樣口溫度200 ℃；分流進(jìn)樣，分流比10∶1；FID檢測器溫度250 ℃；氫氣、空氣體積流量45、450 mL/min；進(jìn)樣量1 μL，色譜圖見圖1。由此可知，各成分色譜峰與相鄰峰均能達(dá)到基線分離，陰性無干擾。

2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液1 μL，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，并以信噪比(S/N)10∶1為定量限，3∶1為檢出限，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.α-蒎烯 2.β-蒎烯 3.檸檬烯 4.薄荷酮 5.薄荷腦 6.胡薄荷酮 7.胡椒酮 8.藁本內(nèi)酯1.α-pinene 2.β-pinene 3.limonene 4.menthone 5.menthol 6.pulegone 7.piperitone 8. ligustilide

表1 各揮發(fā)性成分線性關(guān)系

2.4 精密度試驗(yàn) 取散劑(批號(hào)210502)適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，每次1 μL，測得α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮、胡椒酮、藁本內(nèi)酯峰面積RSD分別為2.82%、2.64%、2.35%、1.50%、1.60%、1.65%、1.23%、2.64%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取散劑(批號(hào)210502)適量，于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定7次，每次1 μL，測得α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮、胡椒酮、藁本內(nèi)酯峰面積RSD分別為1.33%、1.33%、1.06%、1.11%、1.74%、1.85%、2.35%、2.16%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批散劑(批號(hào)210502)適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮、胡椒酮、藁本內(nèi)酯含量RSD分別為1.65%、1.24%、1.03%、1.60%、0.85%、1.20%、1.15%、1.26%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 稱取各成分含量已知的散劑(批號(hào)210502)6份，每份約4.0 g，精密稱定，精密加入含對(duì)照品的乙酸乙酯溶液2 mL，振搖混勻，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，計(jì)算回收率。結(jié)果，α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮、胡椒酮、藁本內(nèi)酯平均加樣回收率分別為98.74% (RSD=1.51%)、97.05% (RSD=1.08%)、96.56% (RSD=1.02%)、96.42% (RSD=1.14%)、98.38% (RSD= 1.29%)、96.46% (RSD=1.37%)、96.24% (RSD=0.93%)、95.87% (RSD=2.84%)。

2.8 樣品含量測定 取18批樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 各揮發(fā)性成分含量測定結(jié)果(n=3)

由此可知，散劑中8種揮發(fā)性成分均有檢出，其中藁本內(nèi)酯、薄荷腦、薄荷酮含量較高，胡薄荷酮次之，其余較低；丸劑中藁本內(nèi)酯、薄荷腦含量較高，薄荷酮、胡薄荷酮、胡椒酮次之，但均未檢測到α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯，可能是由于三者揮發(fā)性較大，在干燥過程中損失較多所致；顆粒劑中薄荷腦、薄荷酮含量較高，胡薄荷酮次之，其余較低，但均未檢測到藁本內(nèi)酯，這是因?yàn)樵谥苽溥^程中川芎采用水煎煮提取，并未專門提取其揮發(fā)性成分。

3 討論

3.1 色譜條件選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了DB-5、DB-WAX(PEG-20M)、DB-624色譜柱，發(fā)現(xiàn)DB-WAX色譜柱中薄荷腦、胡薄荷酮完全重疊；DB-624色譜柱中各揮發(fā)性成分保留時(shí)間較長，基線抬高，分離效果不理想，最終確定為DB-5色譜柱。再分別以80、90、100、110 ℃為色譜柱初始溫度，考察了不同升溫程序，發(fā)現(xiàn)“2.2”項(xiàng)下條件最佳，各揮發(fā)性成分色譜峰與相鄰成分分離完全，而且分析時(shí)間較短。

3.2 供試品溶液制備方法選擇 預(yù)實(shí)驗(yàn)采用甲醇等溶劑進(jìn)行超聲提取，發(fā)現(xiàn)僅含量較高的揮發(fā)性成分被檢出，而且溶劑提取后直接進(jìn)樣會(huì)對(duì)色譜柱造成污染，影響柱效。因此，本實(shí)驗(yàn)改成揮發(fā)油提取器制備供試品溶液，可增加取樣量，更有利于測定含量較低的揮發(fā)性成分。

3.3 結(jié)果分析

3.3.1 成分歸屬 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)和陰性樣品色譜，發(fā)現(xiàn)α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯是羌活主要成分，胡薄荷酮是荊芥主要成分，薄荷腦是薄荷主要成分，薄荷酮是薄荷、荊芥主要成分，藁本內(nèi)酯是川芎主要成分。

3.3.2 含量測定 同一廠家3種川芎茶調(diào)制劑中各揮發(fā)性成分的種類和含量較穩(wěn)定，均在一定范圍內(nèi)浮動(dòng)。但2批川芎茶調(diào)顆粒中成分含量很低，表明其內(nèi)在質(zhì)量較差，需引起關(guān)注。

3.4 建議 有關(guān)部門可將揮發(fā)性成分的含量測定項(xiàng)納入川芎茶調(diào)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，可更全面地控制其質(zhì)量。另外，企業(yè)也可將上述項(xiàng)目作為內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以期提高產(chǎn)品競爭力。