新型可降解光固化生物醫(yī)用黏合劑的制備及其性能研究

楊春芳，高 瑞，黃平升，馮祖建，王偉偉

世界上每年都有數(shù)以百萬人遭受創(chuàng)傷的困擾，需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)膫陂]合。 傳統(tǒng)的傷口閉合方式如縫合、打釘和醫(yī)用膠帶固定等，雖然可以比較穩(wěn)固地將傷口對(duì)接起來，但難以避免術(shù)后拆換線、術(shù)后留瘢、較高的操作難度且止血不夠及時(shí)等缺點(diǎn)。隨著醫(yī)學(xué)科技的進(jìn)步和醫(yī)療理念的更新， 需要尋求更加方便快速、功能全面的傷口閉合方式[1，2]。生物黏合劑作為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的“膠水”，具有使用方便、作用快速、不帶來手術(shù)創(chuàng)傷的特點(diǎn)，且能在傷口部位提供愈合環(huán)境，有希望成為手術(shù)縫線的替代物[1，3，4]。

在過去數(shù)十年間，多種類型的組織黏合劑、密封劑及止血?jiǎng)┍谎邪l(fā)并運(yùn)用于密封組織，防止出血或漏氣， 然而現(xiàn)存的生物黏合劑仍然缺乏足夠的黏合強(qiáng)度，無法完全替代縫線或吻合器，只能作為輔助封閉手段[5]。 高強(qiáng)度黏合劑，例如氰基丙烯酸酯等，通常又會(huì)帶來無法忽視的細(xì)胞毒性和組織刺激性[6]。 因此如何構(gòu)建兼具高黏合強(qiáng)度和高生物相容性的黏合劑是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的課題。 與組織特性、周圍環(huán)境和病理狀態(tài)相匹配的黏合劑， 將提供更好的治療效果，開啟精準(zhǔn)醫(yī)療的新篇章[2，7，8]。

在實(shí)驗(yàn)研究中，筆者以木糖醇、衣康酸和癸二酸為原料，通過縮聚反應(yīng)制備了聚（木糖醇-衣康酸-癸二酸酯）[poly（xylitol-itaconic acid-sebacate），PXIS]生物醫(yī)用黏合劑（簡(jiǎn)稱PXIS）。 其中衣康酸是含有不飽和雙鍵的活潑二元有機(jī)酸，可以在光引發(fā)下發(fā)生自由基聚合，實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的交聯(lián)固化，提高黏合劑的強(qiáng)度[9，10]。 利用流變學(xué)實(shí)驗(yàn)探究了不同原料配比對(duì)PXIS黏性及其固化時(shí)間的影響。利用力學(xué)性能實(shí)驗(yàn)考察了PXIS 在壓縮和拉伸條件下的機(jī)械性能表現(xiàn)， 而后使用搭接剪切實(shí)驗(yàn)考察了PXIS 對(duì)玻璃基材的黏附強(qiáng)度。最后，通過體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)埋植實(shí)驗(yàn)，探究了PXIS 的生物相容特性。 體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PXIS 是一種可快速光固化、 黏附性能良好和強(qiáng)度可調(diào)節(jié)，以及安全無毒的醫(yī)用黏合劑，有望運(yùn)用于組織損傷的封閉與愈合。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑

木糖醇、衣康酸、1，10-癸二酸、2-羥基-4"-（2-羥基乙氧基）-2-甲基苯丙酮， 由中國天津希恩思生化科技有限公司提供。 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚，由中國北京百靈威科技有限公司提供。

C57 小鼠15 只，鼠齡6 周，體質(zhì)量（20±2）g，雌性。 由北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)于獨(dú)立通風(fēng)籠具設(shè)備中。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SYXK（津）2019-0002。

BALB/c 小鼠15 只，鼠齡6 周，體質(zhì)量（20±2）g，雌性。 由北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)于獨(dú)立通風(fēng)籠具設(shè)備中。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SYXK（津）2019-0002。

小鼠成纖維細(xì)胞3T3，由上海佰曄生物科技中心提供。

1.1.2 主要儀器

DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（北京英儀科貿(mào)有限公司， 中國）；2XZ-4 型旋片式真空泵（YC7144。 浙江臺(tái)州求精真空泵有限公司，中國）；傅里葉紅外光譜儀 （NICOLET Is10。 Thermo Fisher，美國）；核磁共振波譜儀（AVANCE III，400 MHz。 布魯克，德國）；多功能流變儀（MCR 302。 Anton Paar，澳大利亞）；萬能拉力試驗(yàn)機(jī)（Instron，美國）；正置熒光顯微鏡 （BX53F。 OLYMPUS， 日本）； 酶標(biāo)儀（Thermo Fisher，美國）。

1.2 方法

1.2.1 聚（木糖醇-衣康酸-癸二酸酯）的制備

將0.1 mol 木糖醇、0.02 mol 衣康酸和0.08 mol癸二酸加入100 mL 圓底燒瓶，置于140 ℃油浴鍋中，在氦氣流通下、磁力攪拌（100 r/min）約30 min，至完全熔融。 在135 ℃真空反應(yīng)6 h 后，加入1.5 mg 2-羥基-4"-（2-羥基乙氧基）-2-甲基苯丙酮 （光敏劑）和10 mg 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（阻聚劑），混合均勻后，將產(chǎn)物PXIS 倒入10 mL 注射器中，排盡空氣，密封保存以待用。 上述為PXIS-2 的合成方法，其余PXIS 的合成參照表1 所示的摩爾比，方法同上。

表1 PXIS 的原料、配比及反應(yīng)條件Tab. 1 Raw materials, proportions and reaction conditions of PXIS

1.2.2 黏合劑聚（木糖醇-衣康酸-癸二酸酯）的表征

（1）PXIS 的核磁表征： 采用1H-核磁共振波譜（nucler magnetic resonance spectroscopy，NMR）法在室溫條件下測(cè)定PXIS 的化學(xué)結(jié)構(gòu)，氘代試劑為CDCl3，基于譜圖中相關(guān)特征峰的位置和積分面積以確定合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。

（2）PXIS 的紅外表征： 將少量PXIS 與干燥的KBr 固體粉末共同研磨并混合均勻，將混合粉末壓片后，使用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)試。

（3）PXIS 的流變學(xué)測(cè)試：在37 ℃條件下，將PXIS樣品均勻平整地涂抹在多功能流變儀測(cè)試平臺(tái)上，使用直徑10 mm 的轉(zhuǎn)子， 在刮去多余樣品后， 以轉(zhuǎn)速10 rad/s 進(jìn)行黏度測(cè)試。

（4）PXIS 的固化性能測(cè)試： 將PXIS 平鋪至聚四氟乙烯模具中，使用紫外點(diǎn)光源（365 nm）照射至完全固化（不再具有黏流體性質(zhì)），統(tǒng)計(jì)所需的固化時(shí)間。

1.2.3 聚（木糖醇-衣康酸-癸二酸酯）的力學(xué)性能測(cè)試

用于壓縮實(shí)驗(yàn)的PXIS 樣品條的制備：將PXIS均勻填充到聚四氟乙烯模具中，紫外線（365 nm）照射固化2 min，得到直徑10 mm、高10 mm 的固體柱狀樣品。

用于拉伸實(shí)驗(yàn)的PXIS 樣品條的制備： 將PXIS均勻鋪展到聚四氟乙烯模具中，于紫外線（365 nm）照射固化2 min，得到長(zhǎng)50 mm、寬10 mm、高1 mm 的固體片狀樣品。

拉伸實(shí)驗(yàn)： 使用萬能拉力機(jī)對(duì)PXIS 進(jìn)行拉伸測(cè)試。參數(shù)如下：拉伸速度10 mm/min；實(shí)驗(yàn)結(jié)束指標(biāo)：樣品條徹底斷開。對(duì)各樣品的楊氏模量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

壓縮實(shí)驗(yàn)：使用萬能拉力機(jī)對(duì)PXIS 進(jìn)行壓縮測(cè)試，壓縮速度為5 mm/min，得到應(yīng)變-壓縮模量曲線。

1.2.4 聚（木糖醇-衣康酸-癸二酸酯）的黏附性實(shí)驗(yàn)

搭接剪切樣品制作：如圖1 所示，將PXIS 均勻地涂抹在玻璃基材（50 mm × 10 mm × 1 mm）的一端表面（涂膠面積為10 mm×10 mm），將另一塊同規(guī)格的玻璃基材的一端覆蓋于膠面之上，用紫外線（365 nm）進(jìn)行照射固化2 min 即可。

圖1 搭接剪切實(shí)驗(yàn)示意圖Fig.1 Schematic diagram of lap shear test

搭接剪切實(shí)驗(yàn)：萬能拉力試驗(yàn)機(jī)的參數(shù)，拉伸速度10 mm/min；實(shí)驗(yàn)結(jié)束指標(biāo)為兩塊玻璃基材完全分離。對(duì)各樣品的剪切強(qiáng)度和界面韌性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

適合于臨床應(yīng)用的黏合劑， 應(yīng)當(dāng)具有快速固化、足夠的剪切強(qiáng)度與適宜的組織順應(yīng)性等特性。

1.2.5 聚（木糖醇-衣康酸-癸二酸酯）的生物相容性實(shí)驗(yàn)

（1）細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。 材料浸提液的制備：將0.1 g PXIS-2 樣品（10 mm ×10 mm × 1 mm）浸泡于50 mL的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液 （Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）中，48 h 后，用0.2 μm 濾膜將浸提液濾過，紫外線照射12 h 后備用。

細(xì)胞培養(yǎng)：將小鼠成纖維細(xì)胞3T3 復(fù)蘇，并置于DMEM 中培養(yǎng)；傳至第3 代時(shí)，待細(xì)胞密度至約50%，將細(xì)胞制成密度為104/mL 的細(xì)胞懸液， 按照每孔100 μL 加至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12 h（37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2）。

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：將上述PXIS 浸提液用DMEM 稀釋至特定倍數(shù)后，以換液的形式加入到96 孔板中。培養(yǎng)1 d 后， 配置含有10%CCK-8 溶液 （2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽） 的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）， 以換液的形式加入到96 孔板中（每孔100 μL），培養(yǎng)40 min 后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔于450 nm 處的光密度。

（2） 紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)： 使用肝素管從6 周大的C57 小鼠的眼眶中收集血液。 將3 mL 新鮮血液加入2 mL 0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）中制成懸浮液。 將懸浮液分裝到5 個(gè)1.5 mL EP 管中，離心5 min（37 ℃、1 000 r/min）。 去掉上清液，用1 mL 0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）重懸紅細(xì)胞。然后，將紅細(xì)胞加入0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）200 μL（陰性對(duì)照組）、PXIS 0.9 %氯化鈉溶液（生理鹽水）提取物200 μL（實(shí)驗(yàn)組）、Triton 0.5 wt%（陽性對(duì)照組），于37 ℃條件下靜置1 h，觀察后取上清液，用酶標(biāo)儀測(cè)量398 nm 處光密度。

（3）皮下埋植實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前將PXIS-3 在60 ℃熱熔后置入模具中，用紫外線固化2 min，制成10 mm×10 mm×2 mm 的矩形樣品， 浸泡在PBS 中。 植入過程： 將一塊制備好的PXIS 樣品植入BALB/c 小鼠下背部?jī)蓚?cè)皮下，縫合開口。 植入后第56 天處死小鼠，取植入部位皮膚及心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟，切片采用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后，進(jìn)行病理學(xué)檢查。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行非配對(duì)t 檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，分析結(jié)果均以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。 P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 聚（木糖醇-衣康酸-癸二酸酯）的表征

在PXIS 的1H-NMR（圖2A ）中，3.5 × 10-6處醇羥基峰、1.6 × 10-6處癸二酸亞甲基峰、6.0 × 10-6處衣康酸雙鍵氫峰的出現(xiàn)，以及紅外光譜圖（圖2B ）中2 930/cm 處亞甲基、1 710/cm 處羰基及3 410/cm 處羥基伸縮振動(dòng)峰的出現(xiàn)、產(chǎn)物羥基豐度較木糖醇的下降，證明了PXIS 合成成功。

圖2 PXIS 的1H-NMR（A）及紅外光譜圖（B）Fig.2 Diagrams of 1H-NMR(A)and infrared spectra(B)of PXIS

2.2 聚（木糖醇-衣康酸-癸二酸酯）的流變學(xué)性能及固化時(shí)間

PXIS 在37 ℃條件下，黏度都小于1 100 Pa·s，說明PXIS 黏合劑的擠出及施布的可行性。 癸二酸作為柔性長(zhǎng)鏈二酸，鏈段規(guī)整緊密，所以隨著癸二酸比例的升高，PXIS 黏度逐漸升高。而隨著木糖醇含量的逐漸降低，聚合物嵌段物理交聯(lián)點(diǎn)變少，PXIS 黏度逐漸下降。PXIS 的固化時(shí)間與衣康酸含量負(fù)相關(guān)，因?yàn)樽贤饩€照射固化的本質(zhì)是衣康酸中不飽和雙鍵在光引發(fā)下發(fā)生的自由基聚合反應(yīng)。 綜上結(jié)果，PXIS-2 和PXIS-3 具有適中的黏度及固化時(shí)間。 見表2。

表2 PXIS 的黏度及固化時(shí)間Tab.2 Viscosity and curing time of PXIS

2.3 聚（木糖醇-衣康酸-癸二酸酯）的力學(xué)性能

PXIS 在壓縮下沒有顯示出明顯的屈服或斷裂，壓縮模量介于295 ～438 kPa，說明PXIS 樣品具有良好的抗壓縮性（圖3A）。 拉伸實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3B）顯示，PXIS 面對(duì)機(jī)械拉伸表現(xiàn)出了良好的彈性， 其中PXIS-3 的彈性模量為（220.88 ± 30.46） kPa，顯著高于其余PXIS（P=0.001 3），這是因?yàn)镻XIS-3 中衣康酸含量高，經(jīng)相同時(shí)間的照射固化后，具有更高的交聯(lián)密度。

圖3 PXIS 的壓縮（A）及拉伸（B）實(shí)驗(yàn)Fig.3 Diagrams of compression(A)and tensile(B)test of PXIS

2.4 聚（木糖醇-衣康酸-癸二酸酯）的黏附性質(zhì)

PXIS 對(duì)于玻璃、木頭、塑料、金屬和硅膠等多種代表性基材都顯示出了強(qiáng)力的黏附能力 （圖4）。 應(yīng)力-應(yīng)變曲線顯示，PXIS 樣品在應(yīng)變?yōu)?0% 左右時(shí)發(fā)生脆性剝離，其中PXIS-3 的剝離強(qiáng)度最高，數(shù)值為（8.59±0.13）MPa（圖5）。 黏合劑的內(nèi)部自聚力和黏合劑與基材之間的界面力是決定黏合劑總黏合強(qiáng)度的兩個(gè)關(guān)鍵因素，而搭接剪切樣品的剪切強(qiáng)度和其界面韌性可以分別反映這兩個(gè)因素。 實(shí)驗(yàn)選取的PXIS 樣品的剪切強(qiáng)度差異和界面韌性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.636 0、0.453 5），剪切強(qiáng)度和界面韌性分別在5 ～10 MPa 和9 500 ～16 000 J/m2內(nèi)（圖6）。

圖4 PXIS 對(duì)不同基材的黏附情況Fig. 4 Diagrams of adhesion properties of PXIS in different substrates

圖5 4 種PXIS 對(duì)玻璃搭接剪切樣品的代表性應(yīng)力-應(yīng)變曲線Fig.5 Representative stress-strain curves of 4 PXIS for glass lap shear samples

圖6 4 種PXIS 對(duì)玻璃搭接剪切樣品的剪切強(qiáng)度與界面韌性對(duì)比柱狀圖Fig.6 Comparison of shear strength and interfacial toughness of 4 PXIS for glass lap shear samples by histogram

2.5 聚（木糖醇-衣康酸-癸二酸酯）的生物相容性實(shí)驗(yàn)

采用小鼠成纖維細(xì)胞3T3， 檢測(cè)PXIS 的細(xì)胞毒性。如圖7 顯示，培養(yǎng)24 h 后，與DMEM 組（85.37%～99.60%）相比，PXIS 組細(xì)胞存活率（88.16%～102.42%）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.445 9）。 且隨著稀釋倍數(shù)的提高，細(xì)胞存活率也沒有明顯的變化。 因此，PXIS 對(duì)3T3 細(xì)胞沒有毒性。

圖7 PXIS 浸提液不同稀釋比例、 不同時(shí)間對(duì)3T3 細(xì)胞存活率影響柱狀圖Fig.7 Effect of different dilution ratio and time of PXIS extract on 3T3 cell survival rate by histogram

溶血實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組溶血率為（1.56±0.14）%，陽性對(duì)照組溶血反應(yīng)率為（99.99±7.76） %，陰性對(duì)照組為 （0.01±0.04）%。 實(shí)驗(yàn)組溶血率與陰性對(duì)照組相當(dāng)，顯著低于陽性對(duì)照組（P ＜0.000 03、0.000 02）。

體內(nèi)埋植實(shí)驗(yàn)（圖8）表明，8 周后BALB/c 小鼠的埋植區(qū)域皮膚中炎性細(xì)胞已不再聚集，炎癥基本消退。埋植小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟等臟器與未埋植的對(duì)照組相比，無明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)或病理結(jié)構(gòu)的改變。 以上結(jié)果證明了PXIS 具有優(yōu)良的生物相容性。

圖8 BALB/c 小鼠皮下埋植PXIS 的皮膚、內(nèi)臟的HE 染色切片病理圖Fig.8 Pathology images of subcutaneously implanted PXIS in BALB/c mice by HE staining

3 討論

比起縫合等傳統(tǒng)的傷口閉合方式，醫(yī)用黏合劑具有使用方便、止血快速、不帶來手術(shù)創(chuàng)傷且無需拆換線等優(yōu)點(diǎn)，有希望成為手術(shù)縫線的替代物。 但目前已經(jīng)上市的醫(yī)用黏合劑因受限于有限的黏接強(qiáng)度及機(jī)械強(qiáng)度，往往都只用于輔助傳統(tǒng)傷口閉合方式，起到進(jìn)一步固定、防止氣液滲漏等作用。 如何能得到可以單獨(dú)封閉傷口的醫(yī)用黏合劑， 是一個(gè)值得思考的問題。 為了獲得高黏附度、良好機(jī)械性能的生物醫(yī)用黏合劑，筆者設(shè)計(jì)合成了新型生物醫(yī)用黏合劑PXIS。所制備的PXIS 具有強(qiáng)力的黏附力、優(yōu)良的機(jī)械性能和良好的生物相容性，有希望用于醫(yī)療手術(shù)中單獨(dú)封閉傷口。

利用木糖醇、衣康酸和癸二酸等低成本的生物相容性原材料，一步合成了多種原料配比的PXIS。PXIS可于常溫下儲(chǔ)存，幾乎所有比例的PXIS 在37 ℃下的黏度都在1 100 Pa·s 以下，故可輕松擠出涂布。 在紫外光照射下PXIS 會(huì)迅速進(jìn)行交聯(lián)固化，固化時(shí)間介于13 ～186 s（除PXIS-1 的固化需要近5 min 外）。 說明在較短的操作時(shí)間內(nèi)，PXIS 黏合劑就可以固化為膠貼片。

力學(xué)性能表現(xiàn)是衡量一種黏合劑是否可以將傷口區(qū)域牢固固定、是否可以對(duì)抗拉伸及壓縮等動(dòng)態(tài)環(huán)境變化的重要指標(biāo)。 PXIS 對(duì)于壓縮及拉伸都表現(xiàn)出了良好的抗性。此外，PXIS 對(duì)常見的基材都表現(xiàn)出了強(qiáng)力的黏接能力，對(duì)于玻璃搭接剪切的最大強(qiáng)度達(dá)到了近10 MPa，最大界面韌性達(dá)約16 000 J/m2，充分證明了PXIS 優(yōu)異的黏附性能。

生物相容性是生物醫(yī)用黏合劑應(yīng)當(dāng)具備的基本屬性，理想的生物醫(yī)用黏合劑應(yīng)具有良好的生物相容性，不引起組織過度的排異反應(yīng)。 圖5 ～7 系列相容性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示，PXIS 不會(huì)影響正常細(xì)胞的增殖，沒有引起紅細(xì)胞的溶血，也不會(huì)對(duì)小鼠的重要臟器帶來病變性反應(yīng)。

綜上所述，PXIS 具有良好的機(jī)械性能、黏附表現(xiàn)及生物相容性， 是一種性能全面的生物醫(yī)用黏合劑。通過調(diào)整PXIS 的原料配比，可以得到具有不同固化時(shí)間、黏附強(qiáng)度和機(jī)械性能表現(xiàn)的PXIS，達(dá)到順應(yīng)特定組織的目的。 PXIS 是一種合成簡(jiǎn)易、使用方便、作用快速且具有高黏附力和高強(qiáng)度的生物醫(yī)用黏合劑，在組織與器官的修補(bǔ)及閉合中具有潛在的應(yīng)用前景。