熱控電極與傳統(tǒng)電極不可逆電穿孔消融小鼠肝臟對照研究

張 科，王 杰，魏旭輝，劉中一

不可逆電穿孔（irreversible electroporation，IRE）消融，主要依賴高強度脈沖電場瞬間釋放的電能而非焦耳熱，相對于冷、熱消融，一直被稱為非熱消融或常溫消融［1-2］。近年研究表明IRE 消融過程中，亦伴隨著一定的熱效應，溫度變化主要取決于消融能量和組織散熱之間的平衡［3］。若IRE 前規(guī)劃和參數(shù)設置不當，可能會對組織造成熱損傷，失去其消融特點和優(yōu)勢。為了避免IRE 消融中的熱效應，國外學者提出熱控電極和溫度閉環(huán)反饋算法的概念，并進行體外細胞學和離體組織學初步實驗［4-5］。本研究應用熱控電極CT 導引經(jīng)皮肝穿刺對小鼠肝臟進行原位IRE 消融實驗，并與傳統(tǒng)電極消融進行比較，分析其技術特點、安全性和有效性。

1 材料與方法

1.1 高壓脈沖發(fā)生裝置和熱控電極構建

高壓脈沖發(fā)生裝置和熱控電極，由中國電子科技集團公司第14 研究所、南京臻泰微波科技有限公司自主研究開發(fā)。高壓脈沖發(fā)生裝置可提供脈寬300 ns～2 ms、輸出電壓500 V～3 kV、電流最大80 A、頻率0.1～10 Hz 的電脈沖。熱控電極由兩根22 G空芯不銹鋼單極電極（暴露長度5 mm）、特殊定制的絕緣型溫度傳感器、外部微控制器及溫度閉環(huán)反饋算法構成。溫度傳感器探頭同軸置于空芯電極頭端內(nèi)部并實時采集消融中的溫度數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)反饋給微控制器，微控制器接受溫度閉環(huán)算法指令，循環(huán)比較消融中電極實時溫度是否超出設定的溫度閾值。本研究小鼠實驗熱控電極反饋溫度設置為42℃。當高于42℃時，微控制器控制高壓脈沖發(fā)生裝置停止釋放電脈沖，直至溫度低于42℃。傳統(tǒng)電極為兩根單極電極，為了便于和熱控電極的消融溫度進行比較，對傳統(tǒng)電極也配置溫度采集功能，但沒有配備溫度控制功能。

1.2 計算機電場、溫度場仿真

參考相關文獻［6-7］，利用COMSOL Multiphysics多物理場仿真軟件進行IRE 電場和溫度場仿真，粗略估計本實驗所需要的電壓和場強參數(shù)，在以文獻報道的生物組織平均電導率0.4 s/m 條件下，得出消融電壓600 V、電極間距3.3 mm、場強1 800 V/cm，可獲得較為安全的小鼠肝臟IRE 有效電場覆蓋范圍（圖1①）?？紤]到本實驗小鼠肝臟的消融體積和范圍較小、散熱較慢，為簡化運算量，將總時長設置為2 ms（100 μs×20）進行穩(wěn)態(tài)分析，模擬出脈寬100 μs、脈沖個數(shù)20 個條件下溫度上升接近15℃（圖1②）。

1.3 CT 導引下經(jīng)皮肝穿刺小鼠肝臟IRE 消融

本動物實驗研究獲南京醫(yī)科大學實驗動物福利倫理委員會審批（IACUC-2007039）。18 只9～11 周齡美國癌癥研究所（ICR）小鼠，雌雄不限，隨機分為實驗組和對照組，每組9 只。實驗組采用熱控電極進行電場消融，對照組采用傳統(tǒng)電極消融。消融前實驗鼠禁食4 h，腹腔注射麻醉，取仰臥位，消毒電極和術區(qū)，固定電極間距3.3 mm；沿劍突下向頭側穿刺肝中葉，進針深度1 cm，CT 掃描驗證穿刺成功后將電極連接脈沖發(fā)生裝置高壓輸出端，按照仿真參數(shù)條件釋放電壓600 V、脈寬100 μs、頻率1 Hz 脈沖20 個。計算機連接溫度傳感器和微控制器，記錄兩組消融時間和消融過程中電極溫度變化，觀察術中小鼠對脈沖的反應，術后復蘇、進食及體能恢復情況。

1.4 病理學評估

消融后30 h 處死所有小鼠，取肝臟大體標本觀察、取材、固定、最大消融切面切片、蘇木精-伊紅（HE）染色和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）染色。采用ImageScope 病理掃描平臺進行病理切片掃描，由2 名病理醫(yī)師閱片及病理學評估。有效IRE 消融標準：電極間肝細胞消融徹底無殘余、細胞凋亡、消融邊界呈細胞級過渡和消融區(qū)管腔結構保留完好。同時計算兩組切片有效IRE 消融面積。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料比較用t 檢驗，率的比較用卡方檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 消融速率和消融溫度比較

雙通道示波器顯示兩組小鼠肝臟IRE 消融過程中每次脈沖輸出電壓穩(wěn)定，電流大小約8 A（圖2①）。消融起始時，兩組電極溫度曲線呈階梯狀上升，溫度隨每個脈沖釋放上升約0.5℃。實驗組在第9～12 個脈沖區(qū)間內(nèi)觸發(fā)溫度閉環(huán)反饋程序，待溫度降至設定溫度閾值42℃以下時再次發(fā)放，使脈沖發(fā)放間隔延長，釋放完20 個脈沖后消融總時長（32.5±3.5） s，熱控電極溫度升高（5.3±0.8）℃；對照組接受20 個脈沖后消融總時長（20.0±0） s，低于實驗組（P＜0.05），傳統(tǒng)電極溫度升高（18.6±4.3）℃，高于實驗組（P＜0.05）。以脈沖數(shù)目和所消耗時間對應關系的脈沖-時間曲線反映消融速率，兩組消融速率見圖2②。兩組電極溫度隨脈沖釋放變化的脈沖-溫度趨勢見圖2③。

2.2 IRE 術中和術后情況

兩組經(jīng)皮肝穿刺成功率均為100%，未發(fā)生氣胸等穿刺并發(fā)癥。脈沖釋放時，所有小鼠出現(xiàn)與脈沖頻率相伴的肌肉收縮。術后兩組小鼠存活率均為100%，恢復良好，能正常進食和活動。

2.3 病理學對比

實驗組和對照組各有2 只小鼠兩電極間存在殘余未完全消融的正常肝組織，視為無效消融；其余小鼠消融區(qū)肝組織HE 和TUNEL 染色均可見肝小葉結構消失、肝細胞凋亡、消融邊界呈細胞級過渡、消融區(qū)管腔結構保留完好等典型IRE 病理表現(xiàn)（圖3①②），提示消融有效；實驗組有效消融面積（15.2±3.6）mm2，小于對照組（21.3±5.2）mm2（P＜0.05）。有效IRE 消融切片中，對照組消融電極周圍存在不同程度細胞質(zhì)脫染情況，電極周圍區(qū)、消融中心區(qū)和消融邊緣區(qū)染色不均一（圖3③）；實驗組消融中心區(qū)、邊緣區(qū)和電極周圍區(qū)HE 染色均勻，同質(zhì)性好（圖3④）。

3 討論

本實驗采用熱控電極和傳統(tǒng)電極對小鼠肝臟進行IRE 電場消融，并從消融溫度、消融效率、消融特點、安全性和有效性等方面探討兩者區(qū)別。電極是產(chǎn)生IRE 脈沖電流回路的終端，電極溫度決定IRE 消融最高溫度。目前防止IRE 熱量產(chǎn)生的辦法主要有采取電流限制和采用熱控電極。本實驗由于消融范圍較小，電流較低，電流波動較小，不適宜采用電流限制方案。安吉戴尼克公司專利發(fā)明一種用于IRE 的灌注熱控電極，通過向電極內(nèi)主動灌注冷卻液方式降低電極溫度，是一種主動式熱控電極［8］。它不會延長消融時間，但缺點是電極內(nèi)徑較大、工藝復雜、不適用于小病灶穿刺消融。本研究所用熱控電極結構基于溫度傳感器和溫度閉環(huán)反饋算法，優(yōu)點是工藝簡單、體積小、成本低廉和便于實現(xiàn)，可在傳統(tǒng)電極基礎上加裝或定制，缺點是當達到設定溫度反饋閾值，會增加脈沖間隔時間被動等待組織降溫。結合本研究結果，實驗組脈沖數(shù)-時間曲線出現(xiàn)折點，提示熱控電極觸發(fā)溫度反饋，脈沖延遲發(fā)放，消融時間高于對照組，這表明消融速率較傳統(tǒng)電極低；對照組傳統(tǒng)電極因缺少溫度控制，脈沖-溫度曲線顯示溫度隨脈沖個數(shù)增加逐步上升，而熱控電極均能正常觸發(fā)溫度反饋，將電極溫度限制在溫度閾值附近，消融后溫度上升幅度顯著低于對照組。

相比于小鼠肝癌皮下移植瘤模型［9］和開腹模型［10］IRE 實驗，經(jīng)皮肝穿刺原位IRE 消融肝臟能夠反映電脈沖對靶器官和鄰近結構的IRE 效應和對全身安全的影響，也可排除因造瘤異質(zhì)性影響兩組電極的可比性；影像導引可提高靶區(qū)穿刺成功率，使電場不會波及非目標區(qū)域［11］；同時得益于計算機仿真，能夠對電壓、電極間距和電場范圍參數(shù)進行規(guī)劃［6］，保證電場最低有效范圍情況下把高壓電勢及其熱量對小鼠的威脅降到最低。本實驗結果顯示，術后所有小鼠未出現(xiàn)穿刺相關并發(fā)癥，術后小鼠體能恢復良好，無死亡；說明本方法安全、微創(chuàng)、簡便，便于高通量研究。

IRE 消融不同于熱消融引起的即刻性熱凝固性壞死，主要引起細胞凋亡且具有滯后性，因此評估其病理學變化一般需要在脈沖電場施加后24 h 左右或之后進行［12］。本實驗病理學結果發(fā)現(xiàn)，兩組消融有效性差異無統(tǒng)計學意義，消融區(qū)均能觀察到典型的IRE 病理學變化，但實驗組有效消融面積低于對照組。這個結果與Fesmire 等［5］報道的體外研究結果一致，說明高壓脈沖電場產(chǎn)生過程中的熱量介導了IRE 的增強效應。Ruarus 等［13］指出這種現(xiàn)象可能與溫度上升引起的組織電導率上升有關。結合本實驗結果，對照組電極溫度最高接近60℃，電極周圍消融區(qū)均存在細胞質(zhì)脫染現(xiàn)象，染色不如實驗組均一。推測這種脫染現(xiàn)象是細胞穿孔后細胞內(nèi)蛋白等物質(zhì)失去了細胞膜的隔熱作用，部分未及時散失的熱量進入細胞內(nèi)部，引起細胞內(nèi)水分丟失和細胞質(zhì)變性皺縮、脆硬脫落的緣故。本研究中熱控電極的消融效率（消融速率和消融范圍）不及傳統(tǒng)電極，正是因為對照組細胞受到電場能量和部分轉化的焦耳熱量的雙重效應，兩者具有協(xié)同效應，導致消融末期效率增加和熱量驟增。然而熱控電極能夠限制電極最高溫度，通過達到閾值后主動延長脈沖間隔避免消融中熱量積累，雖然“犧牲”了消融效率，但也避免熱量對穿孔后細胞內(nèi)物質(zhì)的損傷。今后在IRE 新設備研究開發(fā)、測試階段及進行IRE 相關基礎實驗時，最好能使用熱控電極對消融溫度進行控制，以便排除熱效應干擾，實現(xiàn)純粹“非熱”IRE，這樣得出的相關研究數(shù)據(jù)才更可信。

本研究表明在同等脈沖劑量下，傳統(tǒng)電極IRE在小鼠肝臟消融過程中比熱控電極產(chǎn)生更多熱量，熱控電極消融效率雖不及傳統(tǒng)電極，但能有效控制消融中的熱效應，使消融更均一，實現(xiàn)真正意義上的非熱消融。如何在多消融參數(shù)變量下動態(tài)控制IRE 消融過程熱量轉化與組織散熱間的平衡，使IRE 消融效率最大化，還有待于更進一步研究。