糖原合酶激酶3β與腎臟病變的關(guān)系

糖原合酶激酶3(GSK-3)有GSK-3α與GSK-3β兩種亞型，GSK-3β是真核生物細胞重要信號通路的關(guān)鍵酶，廣泛參與機體的多種重要生命活動[1-4]。GSK-3β的活性在真核生物體內(nèi)受到嚴密調(diào)控，鋰可抑制GSK-3β的活性，部分長期應(yīng)用鋰制劑者會出現(xiàn)尿崩癥，提示其在腎臟濃縮功能或水平衡調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。雷帕霉素可抑制GSK-3β的活性，長期應(yīng)用可引起足細胞損傷產(chǎn)生蛋白尿。本文主要簡述GSK-3β的調(diào)控機制，重點探討其參與尿液濃縮功能及足細胞損傷的機制。

GSK-3β的功能與調(diào)節(jié)機制

編碼GSK-3α與GSK-3β的基因分別位于19q13.2和3q13.3[5]，兩個基因序列具有85％的同源性，在催化結(jié)構(gòu)域的同源性則高達98％[2]。MacAulay等[6]報道，腎臟可同時表達GSK-3α與GSK-3β，在大鼠、小鼠及人集合管上皮細胞上均可檢出GSK-3β。Kjaersgaard等[7]觀察到，隨生長發(fā)育進程，GSK-3β在腎臟皮質(zhì)的表達量逐漸減低，而其在髓質(zhì)的表達量則保持不變。

GSK-3β是多條重要信號通路的關(guān)鍵酶，廣泛參與真核生物重要生命活動，包括胚胎發(fā)育、真核生物細胞有絲分裂、細胞分化、細胞骨架組裝、上皮細胞的正常功能維持與存活等。GSK-3β的活性在真核生物體內(nèi)受到嚴密調(diào)控，主要包括三種調(diào)節(jié)方式：磷酸化與去磷酸化，形成蛋白復合體，亞細胞隔離[8]。磷酸化與去磷酸化是最主要的調(diào)節(jié)方式。多種蛋白激酶(如PKB或Akt、PKC、PKA)可磷酸GSK-3β的9位絲氨酸，使其不能與底物結(jié)合而失去活性，在去磷酸酶的作用下磷酸化的GSK-3β可恢復活性[9]。

在Wnt信號通路中，GSK-3β與息肉病蛋白(APC)、軸蛋白及酪蛋白酶Ⅰ(CK-Ⅰ)等構(gòu)成蛋白復合體，稱為β連環(huán)蛋白降解復合物[10]。如果細胞外無Wnt信號，GSK-3β以活性形式與APC、軸蛋白、CK-Ⅰ等形成蛋白復合物，導致β連環(huán)蛋白泛素化沿蛋白酶體途徑降解。當有Wnt信號與細胞表面受體(FZD與LRP5/6)結(jié)合，引起CK-Ⅰ磷酸化獲得激酶活性，催化GSK-3β發(fā)生磷酸化，失去與APC、軸蛋白等的結(jié)合能力，β連環(huán)蛋白降解減少并轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用(圖1)[11]。

圖1 Wnt信號與糖原合酶激酶3(GSK-3)的關(guān)系

GSK-3β的活性可能受到miRNA的調(diào)控。Tsukigi等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，59％的腎臟腫瘤患者瘤組織內(nèi)miRNA-199a表達量減低，并且GSK-3β主要聚集在細胞核內(nèi)，兩者具有良好的相關(guān)性。利用基因重組的方法進一步證實，在miRNA-199a過表達腫瘤體系，明顯下調(diào)了細胞內(nèi)GSK-3β的表達，腫瘤細胞的增生與存活能力則明顯下降。提示miRNA-199a依某種方式影響GSK-3β的活性，并降低腫瘤細胞的增生與存活能力 。

GSK-3β參與尿液濃縮的分子機制

腎臟主要依賴抗利尿激素(AVP)調(diào)節(jié)集合管上皮細胞水通道蛋白2(AQP2)的表達及分布調(diào)節(jié)水平衡。AVP與集合管表面受體結(jié)合激活腺苷酸環(huán)化酶，增加細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)含量，增加AQP2在集合管的表達及正確分布[13,14]。Rao等[2]研究證實，GSK-3β可影響AVP信號轉(zhuǎn)導通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，參與調(diào)節(jié)腎臟濃縮功能。

鋰是GSK-3β的強效抑制劑，可引起腎性尿崩癥(NDI)，提示GSK-3β可能參與了腎臟尿液濃縮。Rao等[15]成功構(gòu)建了集合管特異性 GSK-3β基因敲除小鼠發(fā)現(xiàn)，其在嚴格限水或精氨酸加壓素(dAVP，AVP類似物)刺激條件下，與正常組比較，尿量明顯增加而尿滲量明顯減低(即類似于尿崩癥的表現(xiàn))。提示GSK-3β在腎臟濃縮功能中發(fā)揮了重要作用。該作者進一步研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3β基因敲除小鼠或利用SB216763抑制GSK-3β活性后，集合管上皮細胞腺苷酸環(huán)化酶的活性明顯下降，致使細胞內(nèi)cAMP的水平減低，影響AQP2的表達甚至細胞分布，腎臟調(diào)節(jié)水平衡的能力下降，出現(xiàn)上述類似尿崩癥的表現(xiàn)。

GSK-3β可下調(diào)環(huán)氧化酶2(COX2)的表達[16]，鋰抑制GSK-3β活性，細胞內(nèi)COX2水平上升，前列腺素E2(PGE2)產(chǎn)生增加，促進AQP2在溶酶體降解。Rao等[17]利用鋰制作NDI模型，檢出腎髓質(zhì)間質(zhì)細胞(RMICs)COX2表達上升，尿液中PGE2排泄增加，使用COX2抑制劑可緩解NDI小鼠尿崩癥癥狀；鋰處理NDI小鼠，檢測RMICs中GSK-3β活性下降，此現(xiàn)象與COX2升高處于同一時期。Kortenoeven等[18]通過體外實驗證實，PGE2促進AQP2在溶酶體的降解，而不會影響細胞內(nèi)AQP2基因表達。提示RMICs中GSK-3β活性下降提高了COX2表達，產(chǎn)生更多的PGE2，可能通過旁分泌形式作用于集合管上皮細胞，拮抗AVP的作用。

GSK-3β可能參與維持組織正常結(jié)構(gòu)與功能。首先， GSK-3β敲除小鼠，胚胎發(fā)育過程中心肌細胞過度增生造成肥厚性心肌病[19]。Kjaersg-aard等[7]發(fā)現(xiàn)，小鼠出生后第7天開始飼喂含檸檬酸鋰的食物(50 mmol 鋰/kg食物)至第28天，小鼠集合管形成異常微囊泡結(jié)構(gòu)，并證實其為主細胞及閏細胞增生所致。長期服用鋰的患者，腎穿刺組織切片上可見異常類似的微囊泡結(jié)構(gòu)，沿微囊泡分布的鄰近上皮細胞內(nèi)可檢出高水平磷酸化的GSK-3β[2]。Rao等[15]構(gòu)建的集合管特異性GSK-3β基因敲除小鼠中并未觀察到細胞增生與囊泡結(jié)構(gòu)的形成。Nielsen等[20]提出，短期鋰處理可能主要通過相關(guān)信號通路最終影響AQP2的表達豐度及細胞分布，長期鋰的處理才會引起細胞異常增生，改變集合管正常形態(tài)結(jié)構(gòu)。

GSK-3β參與調(diào)節(jié)腎臟尿液濃縮功能可能主要通過以下兩種機制：(1)GSK-3β影響COX2-PGE或腺苷酸環(huán)化酶-cAMP的生成，調(diào)節(jié)AQP2的表達及細胞分布；(2)GSK-3β參與維持腎臟集合管的正常形態(tài)，長期使用GSK-3β抑制劑可使集合管發(fā)生微囊泡，這種異常改變削弱了集合管上皮細胞對血管加壓素的反應(yīng)性[2]。GSK-3β通過COX-PGE2或腺苷酸環(huán)化酶-cAMP調(diào)節(jié)AVP尿液濃縮功能的作用。首先，鋰抑制腎RMICs中GSK-3活性后，細胞內(nèi)COX2及PGE2的水平升高，可能通過旁分泌的方式作用于集合管上皮細胞相應(yīng)受體(EP1/EP3)，拮抗AVP誘導的cAMP水平的上調(diào)。其次，GSK-3可直接正性調(diào)節(jié)集合管上皮細胞內(nèi)COX2的活性，促進cAMP的生成及AQP2的生成和AQP2翻轉(zhuǎn)到頂端膜側(cè)。因此，GSK-3活性被抑制后，cAMP及AQP2的生成減少或分布異常，導致腎臟尿液濃縮能力下降(圖2)。

圖2 糖原合酶激酶3(GSK-3)通過兩種方式參與調(diào)節(jié)腎臟尿液濃縮功能[2]

GSK-3β與足細胞損傷

Nephrin與Nck接頭蛋白、白細胞分化抗原2相關(guān)蛋白(CD2AP)、閉合小環(huán)蛋白1等構(gòu)成蛋白復合體，維持足細胞足突裂孔膜(SD)正常結(jié)構(gòu)與功能。一方面，Nephrin是參與構(gòu)成SD的分子之一，另外，Nephrin還可轉(zhuǎn)導細胞外信號至足細胞內(nèi)，引起足細胞骨架行為變化或相關(guān)基因的表達[21]。Zhou等[22]與Yook等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，在Wnt通路中GSK-3β可使細胞轉(zhuǎn)錄因子(Snail)發(fā)生磷酸化，促進后者發(fā)生泛素化而后沿蛋白酶復合體降解。Matsui等[24]對嘌呤霉素氨基核苷腎病PAN(小鼠模型)的研究發(fā)現(xiàn)，PAN小鼠Wnt2表達上調(diào)，激活 GSK-3β發(fā)生磷酸化失活， Snail泛素化受阻得以在足細胞內(nèi)積累。Snail可與neph基因(表達nephrin蛋白)E-box序列結(jié)合，抑制nephrin的表達，可引起足細胞損傷、產(chǎn)生蛋白尿。

器官移植受者長期應(yīng)用雷帕霉素可引起足細胞損傷或腎小球局灶節(jié)段硬化性病變，發(fā)生蛋白尿。Vollenbr?ker等[25]利用雷帕霉素處理人源足細胞株，mTOR表達表達水平減低及其磷酸化水平均減低，導致SD蛋白成分或細胞骨架蛋白(如nephrin,TRPC6,和 Nck)表達減少，并使骨架蛋白actin形成異常斑點狀結(jié)構(gòu)，足細胞遷移、黏附能力也明顯下降。足細胞長期接受雷帕霉素刺激，細胞內(nèi)GSK-3β磷酸化水平增高而失活，提示GSK-3β可能參與足細胞損傷。Vollenbroker等[25]利用GSK-3β抑制劑(鋰及SB-216763)處理足細胞，觀察到足細胞SD蛋白成分及細胞骨架蛋白表達減少且分布異常，伴隨足細胞遷移能力的減弱，足細胞損傷形式與雷帕霉素處理后大致相同。GSK-3β抑制劑導致足細胞損傷的同時，mTOR通路下游分子p70S6K磷酸化水平減低，提示GSK-3β可能參與了雷帕霉素誘導蛋白尿的發(fā)生機制[26]。

因此，在PAN足細胞損傷模型中， Wnt通路激活使GSK-3β磷酸化失活，Snail泛素化受阻降解減少而在細胞質(zhì)內(nèi)聚集，轉(zhuǎn)移至細胞核抑制nephrin表達。雷帕霉素抑制足細胞mTOR表達及其磷酸化，而增加GSK-3β磷酸化，引起足細胞分子表型改變及細胞骨架行為變化。綜上所述，GSK-3β可能是溝通Wnt、mTOR兩條重要信號通路的關(guān)節(jié)點，Vigneron等[27]在心臟缺血再灌注損傷的研究中也提出了同樣的觀點。

小結(jié)：GSK-3β通過直接調(diào)節(jié)集合管上皮細胞環(huán)氧合酶或cAMP的水平，或間接影響腎臟RMICs中COX2的水平及其產(chǎn)生PGE2的能力，繼而再作用于集合管上皮細胞，影響AQP2的表達及其細胞分布，參與AVP對腎臟水平衡的調(diào)節(jié)。另外，GSK-3β還可能參與維持了集合管上皮的增生及正常形態(tài)。在PAN模型及雷帕霉素誘導蛋白尿的體外研究中，GSK-3β活性被抑制后，足細胞相關(guān)分子表達、細胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而導致蛋白尿發(fā)生。因此， GSK-3β在腎臟生理病理過程中具有重要作用，不僅影響腎臟的尿液濃縮功能，且GSK-3β活性被抑制后可導致足細胞損傷產(chǎn)生蛋白尿。GSK-3β廣泛參與生物細胞多種生命活動過程，在腫瘤、阿爾茲海默病等精神性疾病中也有重要作用，已成為治療多種疾病的新靶點，同時也應(yīng)關(guān)注應(yīng)用GSK-3β抑制劑可能帶來的負效應(yīng)。

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