紅花化學(xué)成分及其抑制子宮平滑肌收縮作用

趙 芮， 李馨蕊， 李 雷， 彭 成， 劉 娟*， 熊 亮*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，省部共建西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)西南特色藥材創(chuàng)新藥物成分研究所，四川 成都 611137)

紅花CarthamustinctoriusL.是菊科紅花屬植物，又名紅藍花、刺紅花等，始載于《新修本草》，主要藥用部位為其干燥管狀花[1]，我國產(chǎn)區(qū)主要為四川、新疆、河南、甘肅、云南等地[2]，其性溫，味辛，歸心、肝經(jīng)，具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛之功效[3]，臨床上用于治療原發(fā)性痛經(jīng)[4]、心腦血管疾病等，目前相關(guān)研究主要集中于化學(xué)成分分離鑒定及藥理活性研究[5]，國內(nèi)外學(xué)者從中分離鑒定出近200個化合物，包括黃酮、生物堿、聚炔、木脂素、萜類、苯丙素等[6]。現(xiàn)代藥理研究表明，紅花具有保護腦組織、抗血栓、抗炎、抗腫瘤、保肝，鎮(zhèn)痛等多種生理活性[6-7]，但目前關(guān)于該植物抑制子宮平滑肌收縮的研究還較少，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。因此，本實驗采用現(xiàn)代色譜分離技術(shù)對紅花水煎液化學(xué)成分進行研究，并考察所得化合物對大鼠離體子宮平滑肌收縮活動的影響，以期為該植物治療痛經(jīng)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Rotavapor R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、Gradient Former B-687中壓液相色譜儀(瑞士Buchi公司)；半制備型C18色譜柱(250 mm×10 mm，5 μm)、制備型C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，4 μm)、Micro TOF-Q Ⅱ型質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)；Avance Neo 600 MHz核磁共振波譜儀、Avance Neo 700 MHz核磁共振波譜儀(德國Bruker公司)；Milli Q超純水儀(美國Millipore公司)；Powerlab多功能生理記錄儀、恒溫水浴槽、Labchart Pro專業(yè)版軟件(澳大利亞埃德公司)；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)。

高效薄層硅膠GF254(煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司)；柱色譜硅膠H(200～300目，青島海洋化工廠)；D101大孔吸附樹脂(成都科龍化工試劑廠)；Sephadex LH-20、葡聚糖凝膠Sephadex HW-40F(瑞典Amershan Pharmacia公司)。縮宮素注射液(江西省創(chuàng)欣藥業(yè)基團有限公司，批號20191011)；戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，批號401A，規(guī)格1 mg/片)；鹽酸維拉帕米(中國食品藥品檢定研究院，批號100223-200102)。甲醇、乙腈為色譜純(美國Sigma公司)；其余試劑均為分析純。

1.2 藥材 紅花于2018年6月采自四川省巴中市平昌縣石埡鄉(xiāng)鑼樂村，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院高繼海副教授鑒定為菊科紅花屬植物紅花CarthamustinctoriusL.的干燥花，標(biāo)本(CT-20180608)保存于成都中醫(yī)藥大學(xué)西南特色藥材創(chuàng)新藥物成分研究所。

1.3 動物 健康成年未孕SD大鼠，普通級，體質(zhì)量220～250 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(川)2020-030。

2 提取與分離

取干燥紅花50 kg，加水煎煮2次，每次1 h，藥液合并濃縮，得水提物16 kg，加水溶解分散后經(jīng)D101大孔吸附樹脂富集，分別用純水、20%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇梯度洗脫，回收溶劑得到5個洗脫部分。70%乙醇洗脫部分經(jīng)硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇(1∶0～0∶1)洗脫得到14個流分(Fr.1～Fr.14)，F(xiàn)r.3依次經(jīng)硅膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇100∶1～0∶1)、Sephadex HW-40F柱色譜(甲醇)、反相半制備高效液相色譜(50%甲醇)，得到化合物1(3.5 mg)。Fr.7經(jīng)反相中壓液相色譜，20%～100%甲醇梯度洗脫，得到10個流分(Fr.7-1～Fr.7-10)，F(xiàn)r.7-3經(jīng)硅膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇50∶1～1∶1)洗脫得到4個流分(Fr.7-3-1～Fr.7-3-4)，F(xiàn)r.7-3-1經(jīng)Sephadex HW-40F(50%甲醇)洗脫得到14個流分(Fr.7-3-1-1～Fr.7-3-1-14)，F(xiàn)r.7-3-1-10經(jīng)制備薄層色譜(二氯甲烷-甲醇12∶1)、反相半制備高效液相色譜(50%甲醇)得到化合物3(1 mg)、4(1 mg)，F(xiàn)r.7-3-3經(jīng)制備薄層色譜(石油醚-丙酮1.5∶1)、反相半制備高效液相色譜(60%甲醇)得到化合物2(1.5 mg)；Fr.7-5經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜(60%甲醇)得到3個流分(Fr.7-5-1～Fr.7-5-3)，F(xiàn)r.7-5-1再經(jīng)制備薄層色譜(石油醚-丙酮1.2∶1)、反相半制備高效液相色譜(45%甲醇)得到化合物5(3.1 mg)，F(xiàn)r.7-5-3經(jīng)硅膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇50∶1～1∶1)梯度洗脫得到6個流分(Fr.7-5-3-1～ Fr.7-5-3-6)，F(xiàn)r.7-5-3-5經(jīng)反相半制備高效液相色譜(37%乙腈)得到化合物6(3.3 mg)；Fr.7-7經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜(60%甲醇)得到4個流分(Fr.7-7-1～Fr.7-7-4)，F(xiàn)r.7-7-1經(jīng)制備薄層色譜(石油醚-丙酮1∶1)、反相半制備高效液相色譜(45%甲醇)得到化合物7(2.0 mg)；Fr.7-7-4依次經(jīng)制備薄層色譜(石油醚-丙酮1∶1)、反相半制備高效液相色譜(45%甲醇)得到化合物8(4.0 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末，易溶于甲醇；HR-ESI-MSm/z：606.257 8[M+Na]+(C34H37N3O6Na)。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)，δ：7.53(1H，d，J=16.2 Hz，H-7″)，7.48(1H，d，J=16.2 Hz，H-7?)，7.45(1H，d，J=16.2 Hz，H-7′)，7.43(2H，d，J=8.4 Hz，H-2″，6″)，7.39(2H，d，J=8.4 Hz，H-2?, 6?)，7.36(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′, 6′)，6.79(2H，d，J=8.4 Hz，H-3?，5?)，6.77(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，6.73～6.77(2H，d，J=8.4 Hz，H-3″，5″)，6.79 (1H，d，J=16.2 Hz，H-8″)，6.42(1H，d，J=16.2 Hz，H-8?)，6.41 (1H，d，J=16.2 Hz，H-8′)，3.52(4H，m，H2-4，6)，3.35(4H，m，H2-2，9)，1.93(1H，m，H-3a)，1.86(1H，m，H-3b)，1.70(2H，m，H2-7)，1.61(2H，m，H2-8)；13C-NMR(150 MHz，CD3OD)δ：169.2(C-9′，9?)，169.1/169.4(C-9″)，160.6/160.7(C-4′，4″，4?)，144.4(C-7″)，141.8/141.9/142.2(C-7′，7?)，130.9(C-2″，6″)，130.6(C-2′，6′，2?，6?)，127.8(C-1″)，127.6(C-1′，1?)，118.4(C-8?)，118.1/118.3(C-8′)，116.8(C-3′，3″，3?，5′，5″，5?)，114.8(C-8″)，47.6/49.0(C-6)，45.7/47.0(C-4)，39.9/40.1(C-9)，37.9/38.2(C-2)，28.9/30.6(C-3)，27.9/28.0(C-8)，26.3/27.9(C-7)。與文獻[8]報道基本一致，故鑒定為N1，N5，N10-tri-p-coumaroylspermidine。

化合物2：無色油狀物，易溶于甲醇；HR-ESI-MSm/z：215.068 2[M+Na]+(C11H12O3Na)。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.58(1H，d，J=16.2 Hz，H-7)，7.38(2H，d，J=9.0 Hz，H-2，6)，6.71(2H，d，J=9.0 Hz，H-3，5)，6.21(1H，d，J=16.2 Hz，H-8)，4.20(2H，q，J=7.2 Hz，H2-1′)，1.31(3H，t，J=7.2 Hz，H3-2′)；13C-NMR(150 MHz，CD3OD)δ：169.8(C-9)，159.5(C-4)，147.1(C-7)，131.3(C-2，C-6)，124.9(C-1)，118.2(C-3，C-5)，113.2(C-8)，61.3(C-1′)，14.7(C-2′)。與文獻[9]報道基本一致，故鑒定為4-乙氧基桂皮酸。

化合物3：無色針晶，易溶于甲醇；HR-ESI-MSm/z：215.068 1[M+Na]+(C11H12O3Na)。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.60(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)，6.85(1H，d，J=12.6 Hz，H-7)，6.74(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)，5.75(1H，d，J=12.6 Hz，H-8)，4.16(2H，q，J=7.2 Hz，H2-1′)，1.26(3H，t，J=7.2 Hz，H3-2′)；13C-NMR(150 MHz，CD3OD)δ：165.8(C-9)，160.5(C-4)，144.7(C-7)，133.5(C-2，6)，126.6(C-1)，115.8(C-8)，115.3(C-3，5)，61.2(C-1′)，14.5(C-2′)。與文獻[10]報道基本一致，故鑒定為順式對羥基肉桂酸乙酯。

化合物4：無色晶體，易溶于甲醇；HR-ESI-MSm/z：215.068 1[M+Na]+(C11H12O3Na)。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.60(1H，d，J=15.6 Hz，H-7)，7.45(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)，6.80(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)，6.31(1H，d，J=15.6 Hz，H-8)，4.22(2H，q，J=7.2 Hz，H2-1′)，1.31(3H，t，J=7.2 Hz，H3-2′)；13C-NMR(150 MHz，CD3OD)δ：169.4(C-9)，161.4(C-4)，146.4(C-7)，131.1(C-2，6)，127.1(C-1)，116.8(C-8)，115.3(C-3，5)，61.4(C-1′)，14.6(C-2′)。與文獻[11]報道基本一致，故鑒定為反式對羥基肉桂酸乙酯。

化合物5：無色晶體，易溶于甲醇；HR-ESI-MSm/z：319.151 8[M+Na]+(C16H24O5Na)。1H-NMR(700 MHz，CD3OD)δ：8.01(1H，d，J=16.1 Hz，H-8)，6.55(1H，d，J=16.1 Hz，H-7)，5.78(1H，brs，H-10)，4.12(1H，m，H-3)，3.82(1H，dd，J=7.0，2.8 Hz，H-12a)，3.72(1H，d，J=7.0 Hz，H-12b)，3.70(3H，s，OCH3-11)，2.09(3H，brs，H3-15)，2.04(1H，dd，J=14.0，7.0 Hz，H-4a)，1.86(1H，dd，J=14.0，7.0 Hz，H-4b)，1.73(1H，dd，J=14.0，10.5 Hz，H-2a)，1.66(1H，m，H-2b)，1.15(3H，s，H3-14)，0.94(3H，s，H3-13)；13C-NMR(175 MHz，CD3OD)δ：168.1(C-11)，152.0(C-9)，135.7(C-7)，131.7(C-8)，118.3(C-10)，87.8(C-5)，83.2(C-6)，77.3(C-12)，66.0(C-3)，51.6(OCH3-11)，49.5(C-1)，46.0(C-4)，44.5(C-2)，21.2(C-15)，19.6(C-14)，16.4(C-13)。與文獻[12]報道基本一致，故鑒定為(-)-methyl dihydrophaseate。

化合物6：無色晶體，易溶于甲醇；HR-ESI-MSm/z：277.177 5[M+Na]+(C15H26O3Na)。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ：5.20(1H，d，J=1.8 Hz，H-15a)，4.71(1H，d，J=1.8 Hz，H-15b)，3.73(1H，d，J=9.0 Hz，H-3)，3.49(1H，ddd，J=11.4，9.0，5.4 Hz，H-2)，1.78(1H，d，J=12.0 Hz，H-5)，1.74(1H，dd，J=12.6，4.8Hz，H-1a)，1.71(1H，m，H-8a)，1.64(1H，m，H-6a)，1.60(1H，dt，J=12.6，3.0Hz，H-9a)，1.38(1H，m，H-7)，1.32(1H，m，H-6b)，1.28(1H，m，H-1b)，1.26(1H，m，H-9b)，1.21(1H，m，H-8b)，1.18(3H，s，H3-12)，1.18(3H，s，H3-13)，0.73(3H，s，H3-14)；13C-NMR(150 MHz，CD3OD)δ：151.8(C-4)，105.3(C-15)，79.7(C-3)，73.8(C-2)，73.3 (C-11)，50.4(C-7)，49.3(C-1)，49.1(C-5)，41.7(C-9)，35.9(C-10)，27.4(C-13)，26.8(C-12)，26.1(C-8)，23.1(C-6)，17.7(C-14)。與文獻[13]報道基本一致，故鑒定為plucheol A。

化合物7：無色膠狀物，易溶于甲醇；HR-ESI-MSm/z：336.120 2[M+Na]+(C18H19NO4Na)。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.36(1H，d，J=1.8 Hz，H-2′)，7.00(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)，6.93(1H，dd，J=8.4，1.8 Hz，H-6′)，6.74(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.69(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)，6.61(1H，d，J=12.6 Hz，H-7′)，5.81(1H，d，J=12.6 Hz，H-8′)，3.83(3H，s，OCH3-3′)，3.40(2H，t，J=7.2 Hz，H2-8)，2.69(2H，t，J=7.2 Hz，H2-7)；13C-NMR(150 MHz，CD3OD)δ：170.4(C-9′)，156.9(C-4)，148.6(C-4′)，148.5(C-3′)，138.4(C-7′)，131.2(C-1)，130.7(C-2，6)，128.5(C-1′)，124.8(C-6′)，121.6(C-8′)，116.3(C-3，5)，115.8(C-5′)，113.9(C-2′)，56.4(OCH3-3′)，42.4(C-8)，35.6(C-7)。與文獻[14]報道基本一致，故鑒定為N-順式-阿魏酰酪胺。

化合物8：白色粉末，易溶于甲醇；HR-ESI-MSm/z：337.162 5[M+Na]+(C16H26O6Na)。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ：5.58(1H，m，H-3)，4.27(1H，d，J=7.8 Hz，H-1′)，4.16(1H，d，J=12.6 Hz，H-10a)，4.07(1H，d，J=12.6 Hz，H-10b)，3.86(1H，dd，J=12.0，1.8 Hz，H-6′a)，3.67(1H，dd，J=12.0，6.0 Hz，H-6′b)，3.34(1H，t，J=9.0 Hz，H-3′)，3.28(1H，t，J=9.0 Hz，H-4′)，3.22(1H，m，H-5′)，3.19(1H，m，H-2′)，2.43(1H，dt，J=8.4，5.4 Hz，H-6a)，2.29(2H，m，H2-4)，2.24(1H，m，H-1)，2.09(1H，m，H-5)，1.31(3H，s，H3-8)，1.20(1H，d，J= 8.4 Hz，H-6b)，0.85(3H，s，H3-9)；13C-NMR(150 MHz，CD3OD)δ：146.1(C-2)，121.6(C-3)，102.7(C-1′)，78.2(C-5′)，78.0(C-3′)，75.1(C-2′)，72.5(C-10)，71.7(C-4′)，62.8(C-6′)，44.5(C-1)，42.1(C-5)，38.9(C-7)，32.4(C-6)，32.3(C-4)，26.7(C-8)，21.4(C-9)。與文獻[15]報道基本一致，故鑒定為桃金娘苷。

4 抑制子宮平滑肌舒張活性研究

大鼠灌胃給予戊酸雌二醇溶液8 mg/kg，連續(xù)2 d，以提高子宮對藥物的敏感性。第3天，頸椎脫臼處死大鼠，迅速剖取子宮，快速置于盛有洛氏液的玻璃皿中，剔除肌條上脂肪，剪除周圍組織，取中間段子宮平滑肌2～3 cm，將肌條一端固定于盛有20 mL洛氏液的恒溫水浴槽中[16](持續(xù)通入95%O2、5%CO2，每秒1～2個小氣泡)，另一端連接張力換能器，將靜息張力調(diào)節(jié)為1 g，采用PowerLab多功能生理記錄儀記錄子宮收縮曲線。采用160 μL縮宮素建立大鼠子宮平滑肌收縮模型，以100 μL DMSO為溶劑對照，4×10-6mol/L鹽酸維拉帕米為陽性對照，給藥組終濃度分別為1、10、50 μmol/L，給藥后觀察10 min內(nèi)離體子宮平滑肌的收縮張力及收縮活力(收縮張力平均值×收縮頻率，其中收縮頻率為10 min內(nèi)子宮平滑肌收縮次數(shù))，記錄收縮曲線，計算給藥后收縮活力抑制率和收縮張力抑制率。每次藥物作用后用洛氏液沖洗子宮肌條3次，待其收縮穩(wěn)定后再進行其他實驗，重復(fù)3次[17]。

如圖1所示，與正常組比較，加入160 μL縮宮素后大鼠子宮平滑肌收縮活動顯著提高；DMSO對子宮平滑肌收縮活動無明顯影響，而鹽酸維拉帕米和不同濃度化合物對其具有一定抑制作用。如表1、圖2所示，與溶劑對照組比較，陽性對照組大鼠子宮平滑肌收縮活力抑制率、收縮張力抑制率升高(P<0.01)；化合物1、7中、高劑量組收縮張力抑制率升高(P<0.05，P<0.01)，而兩者各劑量組收縮活力抑制率無顯著差異(P>0.05)。

表1 化合物1、7對子宮平滑肌收縮活動的影響

5 討論

紅花為傳統(tǒng)的川產(chǎn)活血化瘀中藥，藥用歷史悠久，對治療婦科疾病具有顯著療效[18]，其活血通經(jīng)作用一直為研究熱點[19]。本實驗采用現(xiàn)代分離手段和波譜學(xué)技術(shù)，從紅花中分離鑒定了8個化合物1～8，其中1、7為生物堿，5、6、8為萜類，2～4為苯丙素類，豐富了對該植物化學(xué)成分的認(rèn)識。另外，中高劑量化合物1、7均能抑制大鼠子宮平滑肌收縮張力，并呈現(xiàn)劑量依賴性。