暗色刺參的實時熒光PCR鑒定?

吳 姍， 虞惠貞， 沈旭芳， 孫 超， 張 荃， 陳 哲， 尹文秀， 張明哲， 張曉峰

(杭州海關(guān)技術(shù)中心， 浙江 杭州 310016)

海參不僅是珍貴的食品，也是名貴的藥材，在中國、日本、韓國、印度尼西亞等亞洲國家深受消費(fèi)者喜愛。全球有海參1 400余種，分別屬于6個目25個科，可供食用的海參約40多種[1]。暗色刺參(Isostichopusfuscus)屬棘皮動物門(Echinodermata)海參綱(Holothuroidea)楯手目(Aspidochirotida)刺參科(Stichopo-didae)，產(chǎn)于加拉帕戈斯群島一帶，墨西哥、巴拿馬、秘魯和厄瓜多爾是其主要出產(chǎn)國。暗色刺參是刺參中的珍品，也是被列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》(CITES)目錄的物種[2]，但受到經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使，市場上暗色刺參的銷售并未絕跡。

對瀕危動植物的精準(zhǔn)鑒別是開展瀕危物種保護(hù)的最基本手段。傳統(tǒng)的海參鑒別方法主要依賴海參的外部形態(tài)和解剖特征，如Toral[3]認(rèn)為，鑒定完整形態(tài)的暗色刺參時，其鈣質(zhì)骨針(Calcareous spicules)的特征優(yōu)于庫維管(Cuvierian tubules)和鈣質(zhì)環(huán)(Calcareous ring)的形態(tài)特征，是一種較可靠的分類依據(jù)。但基于形態(tài)學(xué)的鑒定需要鑒定人經(jīng)驗豐富，在海參銷售時，海參往往被加工成干海參、鹽漬海參、即食海參、凍干海參、海參膠囊及海參口服液等，形態(tài)已經(jīng)不完整，單純從其形態(tài)上難以鑒別。

現(xiàn)代分子生物學(xué)的鑒別方法可有效克服上述形態(tài)學(xué)鑒定方法的不足，同時也比物理學(xué)的光譜結(jié)構(gòu)分析法和化學(xué)的內(nèi)含物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析法更穩(wěn)定可靠。律迎春等[4]基于線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基 Ⅰ(Cytochrome oxidase subunit Ⅰ gene，CO Ⅰ)的序列特異性，通過斑點雜交方法鑒定了4種海參種類。此外，律迎春[5]又開發(fā)了PCR-RFLP方法并對梅花參(Thelenotaananas)、仿刺參(Apostichopusjaponicus)、加州擬刺參(Parastichopuscalifornicus)和北大西洋瓜參(Cucumariafrondosa)進(jìn)行了鑒定。和律迎春的基于CO Ⅰ的序列特異性不同，Wen等[6]基于線粒體16S rRNA(16S ribosomal RNA)基因序列，也建立了PCR-RFLP的方法，對6種刺參科的海參進(jìn)行了物種鑒定。但不論是斑點雜交，還是PCR-RFLP的方法，律迎春[5]認(rèn)為PCR方法的準(zhǔn)確率更高，可達(dá)到100%。Wen等[7]采用species-specific PCR的方法對市售的11種深加工海參進(jìn)行鑒定，通過特異性引物的設(shè)計，對11種海參的16S rRNA進(jìn)行了擴(kuò)增，并得到了較準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。Zuo等[8]則采用multiplex-PCR對仿刺參、加州擬刺參、梅花參等海參進(jìn)行了鑒定。目前，利用分子生物學(xué)對海參種類進(jìn)行鑒定的標(biāo)準(zhǔn)僅局限于仿刺參，包括DB21/T 2138—2013仿刺參基因識別檢測方法[9]和DB37/T 2292—2013刺參(種質(zhì))[10]，前者制定了仿刺參的熒光PCR的鑒定方法，后者利用微衛(wèi)星定點分析進(jìn)行物種鑒定。

進(jìn)行瀕危動物保護(hù)時，常關(guān)注的是哺乳動物、鳥類或鯨、鯊體型較大的海洋動物等，海參作為一種體型較小、較為低等的動物，受到的關(guān)注有限，因此目前尚未有利用分子生物學(xué)手段鑒定暗色刺參的報道。本研究基于暗色刺參物種特異性的核酸片段，設(shè)計了引物和探針，建立了能夠精準(zhǔn)鑒定暗色刺參的實時熒光PCR方法。與利用通用引物的非特異性分子鑒定方法(如DNA Barcoding方法)相比，本方法更簡單、準(zhǔn)確，適合在混合物中鑒定是否存在暗色刺參。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

用于實驗的海參種類見表1。此外用于暗色刺參引物探針特異性驗證的物種還包括：中國槍烏賊(Loligochinensis)、歐洲鰻(Anguillaanguilla)、大西洋鮭(Salmosalar)、大西洋鱈(Gadusmorhua)，上述材料均購自市場。

表1 用于檢測的海參物種Table 1 Sea cucumber species for study

1.2 DNA抽提及濃度測定

1.2.1 樣品前處理 干海參：取10 g用水泡發(fā)，取泡發(fā)后的海參2 g，用振蕩研磨儀(Bertin Precellys Evolution, Bertin Technologies, 法國)研磨成細(xì)末，研磨程序為：5 500 r/min，20 s，并重復(fù)4～6次。即食海參：取2 g直接用振蕩研磨儀研磨成細(xì)末，程序同上。

1.2.2 DNA抽提 采用QIAGEN食品提取試劑盒(DNeasy nericon Food Kit)，取樣量為200 mg，加入DNA提取裂解液1 mL使研磨后的海參降解成液狀，繼續(xù)按照說明書進(jìn)行DNA抽提，將抽提得到的DNA溶解在50 μL的水中，測定DNA濃度。

1.2.3 DNA濃度、純度測定 使用NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, 美國)測260和280 nm處的吸光值A(chǔ)260和A280，其中吸光值A(chǔ)260可換算成DNA濃度，用A260/A280比值表示DNA純度。

1.3 暗色刺參樣品的測序和BLAST比對

將購買的標(biāo)識為“暗色刺參”的樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，并進(jìn)行BLAST比對。PCR擴(kuò)增的方法見表2中參考文獻(xiàn)[5,11-12]，測序由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成，得到的序列詳見圖1，序列進(jìn)行BLAST比對的結(jié)果見表2。

表2 暗色刺參樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列比對Table 2 Sequence alignment of PCR products from I. fuscus sample

( (a), (b)和(c)： 分別對應(yīng)表2中的序列1、序列2和序列3。 (a), (b) and (c): Corresponding to sequence 1, sequence 2 and sequence 3, respectively, in table 2.)

1.4 暗色刺參特異性引物設(shè)計

在GenBank上收集暗色刺參和相關(guān)刺參科及其他近似物種的線粒體基因(見表3)。使用MegAlign軟件對表3中所列的COⅠ和16S rRNA序列分別進(jìn)行比對，找到與其他海參序列差異較大的區(qū)域(見圖2)，設(shè)計暗色刺參特異性引物和探針(見表4)。同時，根據(jù)1.3中測序得到的暗色刺參的序列(見圖1)，設(shè)計暗色刺參特異性引物和探針(見表4)。

表3 用于引物探針設(shè)計的基因/基因組序列Table 3 Gene /Genome sequences (GenBank numbers) for primer and probe design

((a), (b)和(c): 分別為I-fu-1的上游引物, 探針和下游引物的設(shè)計區(qū)域。 (d), (e)和(f): 分別為I-fu-2的上游引物, 探針和下游引物設(shè)計區(qū)域。 方框表示對應(yīng)的引物或探針序列的全部或者部分(圖(d)和(f)只顯示了部分的序列)。圖中標(biāo)黑的堿基表示和大多數(shù)序列中的堿基有差異。 (a), (b) and (c): Regions for design forward primer, probe and reverse primer of I-fu-1; (d), (e) and (f): Regions for design forward primer, probe and reverse primer of I-fu-2. The box in the figure indicates all or part of the corresponding primer or probe sequence ( (d) and (f) only show part of the sequences). Residues marked black were different from the majority.)

表4 引物探針序列Table 4 sequence for primer and probe

1.5 實時熒光PCR反應(yīng)

實時熒光PCR反應(yīng)體系如下：10 μL Premix Ex Taq(Takara，中國)，上游引物(0.01 μmol/L)0.4 μL，下游引物(0.01 μmol/L)0.4 μL，探針(0.01 μmol/L)0.4 μL，取上述DNA 2 μL，用水補(bǔ)足體積至20 μL。應(yīng)用熒光定量PCR儀lightcycle 480(Roche，美國)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序為:(1) 95 ℃，10 s。(2) 95 ℃，5 s；60 ℃，23 s；40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后采用儀器程序自帶的“Abs Quant/Fit Points for All Samples”方法計算Ct(Ct表示每個反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))值。每個反應(yīng)重復(fù)3次，本研究中所顯示的Ct值是重復(fù)3次的平均值，SD為標(biāo)準(zhǔn)差。

為檢驗抽提得到的海參、烏賊、魚類等物種的DNA質(zhì)量，參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T25165—2010[13]，制備檢測真核生物的引物探針組合18S rRNA，通過該熒光PCR反應(yīng)得到Ct值，該Ct值可表示對應(yīng)的DNA質(zhì)量。熒光PCR反應(yīng)條件，及引物和探針序列參照標(biāo)準(zhǔn)GB/T25165-2010[13]。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

為確定熒光PCR檢測體系的檢出限和線性范圍，對目標(biāo)DNA進(jìn)行梯度稀釋，并利用DNA濃度和Ct值之間的相關(guān)性繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將抽提得到的DNA進(jìn)行4倍梯度稀釋，進(jìn)行熒光PCR檢測。變量相關(guān)性公式[14]：Ct值=blog10[DNA濃度]+a，其中l(wèi)og是對數(shù)函數(shù)符號；b是斜率；a是截距。

1.7 深加工不同種海參混合樣中暗色刺參的檢測

1.7.1 深加工混合樣的制備及混合物的DNA提取 以暗色刺參、墨西哥刺參和梅花參為材料，制備深加工混合樣。將海參用冷水浸泡12 h，再沸水燉煮20 min。將燉煮后的海參按照表5的比例混合，每個混合樣總質(zhì)量10 g，共制成7個樣。按照比例混合后的10 g樣品經(jīng)過震蕩研磨儀(型號同1.2)充分混合研磨成細(xì)末(反應(yīng)程序同1.2)，加入DNA提取裂解液(DNeasy nericon Food Kit，QIAGEN)15 mL，使10 g混合物完全降解成液狀，取降解后液體混合物1 mL，繼續(xù)進(jìn)行DNA抽提，并測定DNA濃度和純度(方法同1.2)。

表5 3種深加工海參混合制品中暗色刺參的檢測結(jié)果Table 5 Detection of I. fuscus in the mixed sample of three processed sea cucumbers

1.7.2 熒光PCR檢測 根據(jù)1.5和1.6中不同引物探針的特異性、靈敏度的檢測結(jié)果，采用最佳的引物探針組合I-fu-4進(jìn)行檢測，檢測方法同1.5。每個濃度的樣品重復(fù)檢測3次，3次結(jié)果中2次的Ct值小于等于37即為陽性，否則為陰性。以“+”表示能檢測到該百分含量的暗色刺參，以“—”表示不能檢測到該百分含量的暗色刺參。

2 結(jié)果

2.1 引物探針的特異性驗證

在GenBank上收集了暗色刺參和相關(guān)刺參科及其他近似物種的線粒體基因。如表3所示，只有少數(shù)海參，如Stichopusludwigi、Cucumariaminiata和Parastichopusnigripunctatus等具有完整的線粒體基因組信息，而多數(shù)海參只收集到線粒體中16S rRNA和COⅠ基因的信息。將表3中16S rRNA基因的序列進(jìn)行排序比對，發(fā)現(xiàn)表3中海參之間的16S rRNA序列差異巨大，這可能是收集得到的序列不完整，長度差異大，從而導(dǎo)致序列比對有巨大差異，因此，未能在16S rRNA基因上找到適合設(shè)計引物探針的區(qū)域。通過比對COⅠ基因的序列，在圖2所示的區(qū)域設(shè)計了具有暗色刺參物種特異性的引物探針組合I-fu-1和I-fu-2(見表4)。根據(jù)測序得到的序列1、2和3設(shè)計了相應(yīng)的引物探針組合I-fu-3、I-fu-4、I-fu-5和I-fu-6(見表4)。

使用6組引物探針組合對20個樣本(含陰性對照樣本)進(jìn)行檢測，結(jié)果如表6所示。I-fu-1、I-fu-3、I-fu-4、I-fu-6的特異性較高，只在目標(biāo)物種中得到陽性結(jié)果；I-fu-2和I-fu-5除了在暗色刺參中出現(xiàn)陽性結(jié)果，在同一屬的墨西哥刺參中也得到了陽性結(jié)果。和I-fu-1、I-fu-3、I-fu-4比較，I-fu-6的檢測效率不高，檢測相同濃度的暗色刺參DNA，其余引物探針得到的Ct值在20～22之間，但I(xiàn)-fu-6的Ct值在28左右。因此在后續(xù)的靈敏度驗證中只對I-fu-1、I-fu-3、I-fu-4這3組引物探針進(jìn)行靈敏度驗證。

表6并未完整列出20個樣品的檢測結(jié)果，而只列出了特異性引物(I-fu-1～I(xiàn)-fu-6)反應(yīng)有陽性結(jié)果的樣品，其余檢測結(jié)果為陰性(低于檢測限)的樣品為：表1中的其他海參樣品，中國槍烏賊、歐洲鰻、大西洋鮭和大西洋鱈樣品，用于陰性對照的ddH2O。上述未列入表6的驗證樣品，用真核生物通用引物探針組合(18S rRNA)擴(kuò)增其DNA，除ddH2O外均得到陽性結(jié)果，且Ct值在18～23之間，說明樣品的DNA適合用于熒光PCR的擴(kuò)增。

表6 暗色刺參引物探針的特異性驗證Table 6 Specificity of primer and probe for detection of I. fuscus

2.2 引物探針的靈敏度驗證

引物探針的檢測靈敏度，即指在一次熒光PCR反應(yīng)中能夠檢測到暗色刺參的最低濃度，且DNA樣本中不包含其他物種的DNA。表7顯示I-fu-3和I-fu-4的靈敏度優(yōu)于I-fu-1，就real-time PCR擴(kuò)增曲線的圖形顯示(圖略)，I-fu-4的陽性曲線顯示的熒光值較高，陽性較強(qiáng)。比較了3組檢測體系的檢出限和線性范圍，進(jìn)一步比較I-fu-1、I-fu-3和I-fu-4引物探針組合的優(yōu)劣。I-fu-1能檢測到的最低濃度為0.003 ng/μL，以此濃度為低限，繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值大于0.99(y=-4.074 6x+25.751，R2=0.997 9)，說明在此檢測濃度范圍內(nèi)(40.0～0.003 ng/μL)，檢測得到的Ct值和DNA濃度相關(guān)性較大，I-fu-1的檢測靈敏度為0.003 ng/μL左右。表7顯示，I-fu-3和I-fu-4的最低檢測濃度是0.000 8 ng/μL，同樣以此濃度為低限，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值分別為0.984 8(y=-3.813 1x+24.104)和0.996 2(y=-4.182 2x+23.116)，說明在40.0～0.000 8 ng/μL的檢測濃度范圍內(nèi)，I-fu-4得到的Ct值更可信，與DNA濃度的相關(guān)性更高。因此，就檢測靈敏度而言I-fu-4優(yōu)于I-fu-1和I-fu-3，可以達(dá)到0.000 8 ng/μL。

表7 暗色刺參引物探針的靈敏度驗證Table 7 Sensitivity of primer and probe for detection of I. fuscus

2.3 不同種海參深加工混合樣品中的檢測靈敏度

用墨西哥刺參、梅花參和暗色刺參制備了9個不同含量比例的混合樣品(見表5)，樣品1～8都含有目標(biāo)物種暗色刺參，樣品9為只含有墨西哥刺參和梅花參的陰性對照。檢測結(jié)果的Ct值一方面受到目標(biāo)海參百分含量的影響，另一方面和抽提得到DNA的濃度、純度有關(guān)。表5所示，所提取的DNA濃度都在45 ng/μL左右(9個樣品的純度A260/A280在1.90～2.1之間，具體結(jié)果略)，只有樣品7濃度較高，達(dá)到61.9 ng/μL，而樣品2濃度較低，為20.9 ng/μL，這也導(dǎo)致了含暗色刺參百分含量更高的樣品2(含量為10%)與百分含量低一半的樣品3(含量為5%)檢測得到的Ct值相近。但總體趨勢是，目標(biāo)物種含量高，檢測結(jié)果Ct值較低，隨著目標(biāo)物種含量的降低，Ct值升高，且樣品1～8中目標(biāo)物種的檢測結(jié)果皆為陽性。通過計算得到暗色刺參含量最低的樣品8(含量為0.05%)中暗色刺參的DNA濃度為0.024 ng/μL(48.7×0.05%=0.024)，此時檢測得到的Ct值為33左右(見表5)，與表7中濃度相仿的樣品(0.01 ng/μL)相比Ct值(31.4±0.7)略升高，說明在檢測海參混合樣品時，檢測靈敏度較檢測單純樣品時有所降低。

3 討論

在動物研究領(lǐng)域，線粒體基因可以作為理想的分子標(biāo)記用于種質(zhì)鑒定，其中COⅠ、COⅡ、12S rRNA和16S rRNA基因是應(yīng)用頻率最高的一組分子標(biāo)記[15-17]。在棘皮動物中，COⅠ和16S rRNA基因更是被廣泛應(yīng)用于種群分類鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化研究[18-19]。收集了暗色刺參及其近似種海參的16S rRNA和COⅠ基因，但序列比對后發(fā)現(xiàn)16S rRNA的序列長度不一，序列間差異極大，因此較難設(shè)計合適的引物探針。比較而言，在海參中COⅠ基因信息較全，種和種之間差異也較明顯，適合于設(shè)計暗色刺參特異性引物探針，如本研究中的I-fu-1和I-fu-2。同時本研究又根據(jù)暗色刺參測序得到的序列設(shè)計了引物探針組合I-fu-3、I-fu-4、I-fu-5和I-fu-6。比較各引物探針組合的特異性和靈敏度，認(rèn)為引物探針組合I-fu-4的結(jié)果最佳，特別在靈敏度上明顯優(yōu)于特異性同樣優(yōu)異的I-fu-1，而I-fu-4和I-fu-1的差異僅存在于I-fu-4的下游引物中較I-fu-1少一個堿基C，同時I-fu-1探針中一個堿基G在I-fu-4中被替換成堿基A。I-fu-1根據(jù)GenBank中序列(AF486424.1、AF486425.1和AF486429.1，圖2(a)—(c))設(shè)計得到，I-fu-4則根據(jù)暗色刺參樣品的測序結(jié)果設(shè)計得到，這兩個序列產(chǎn)生差異的原因，可能是測序的誤差，也可能是樣品序列本身變異。但測序重復(fù)3次得到的結(jié)果一致，同時實驗結(jié)果顯示I-fu-4的引物探針組合較I-fu-1具有更高的檢測靈敏度，因此較傾向是樣本序列的變異。這是否會導(dǎo)致在用I-fu-4檢測序列和AF486424.1、AF486425.1、AF486429.1等一致的暗色刺參樣本時出現(xiàn)假陰性？但因為本研究實際沒有購買到COⅠ序列和AF486424.1一致的暗色刺參樣本，因此并未能進(jìn)行驗證。但本研究用I-fu-1檢測序列不一致的暗色刺參樣本時，檢測結(jié)果也并未出現(xiàn)假陰性，由此推測，用I-fu-4檢測COⅠ序列和AF486424.1等一致的暗色刺參樣本時，出現(xiàn)假陰性的可能性較低。此外，我們將I-fu-1和I-fu-4兩組引物探針進(jìn)行1∶1混合后對現(xiàn)有的樣本進(jìn)行特異性和靈敏度檢測，結(jié)果顯示特異性不受影響，只在目標(biāo)物種中檢測到陽性(結(jié)果略)，靈敏度和I-fu-4的結(jié)果相近，最低能檢測到0.000 8 ng/μL濃度的樣品(見表7)，雖然此濃度下對應(yīng)的Ct值為38左右，但顯示的R2為0.994 9(y=-4.206 1x+24.801)，說明該Ct值仍較為可信，能較準(zhǔn)確反應(yīng)DNA的濃度，因此為了防范因引物不匹配而造成的假陰性，可采用I-fu-1和I-fu-4兩組引物探針進(jìn)行1∶1混合的方法進(jìn)行檢測。

對3種混合海參樣本的檢測結(jié)果表明，本方法同樣適用于混合物中目標(biāo)物種暗色刺參的檢測。在混合樣本中，摻入的是和暗色刺參同一屬的墨西哥刺參以及不同屬的梅花參，一般而言混合樣本中，物種間的遺傳距離越近，則對目標(biāo)物種的檢測干擾越大。如作者之前的研究發(fā)現(xiàn)，在黃牛、水牛和牦牛的混合肉樣中檢測黃牛，比在黃牛、豬、羊的混合肉樣中檢測黃牛的檢測靈敏度會降低很多[20]。在混合物檢測的結(jié)果中(見表5)，即便在墨西哥刺參含量高達(dá)99.9%，暗色刺參含量低至0.05%混合樣中也成功檢測到了目標(biāo)物種暗色刺參。同時，研究中并未再制備暗色刺參含量更低的混合樣本，是認(rèn)為更低的含量在實際樣本中存在的可能性很小，沒有實際檢測的意義，本方法的靈敏度以及特異性能夠滿足日常鑒定檢測需求。

本文的檢測方法是基于暗色刺參特有的DNA序列設(shè)計的，因而即便混合物中暗色刺參含量低至0.05%也能成功檢出，相比較而言，使用通用引物(如DNA條形碼) 檢測的方法則不適用于在多種混合物中鑒定含量較低的目標(biāo)物種[21-22]。本方法和律迎春等[4-5]開發(fā)的斑點雜交法和PCR-RFLP鑒定海參的方法相比較，省卻了雜交、酶切等步驟；和Wen等[7]采用的species-specific PCR方法以及Zuo等[8]采用的multiplex-PCR方法相比較，省卻了電泳跑膠的步驟，與上述方法相比本方法較簡單、高效、易操作。

4 結(jié)語

對瀕危動植物的鑒定是對瀕危動植物保護(hù)的重要環(huán)節(jié)，本文探討了被列入CITES目錄的保護(hù)動物—暗色刺參的熒光PCR鑒定方法。經(jīng)驗證，基于暗色刺參線粒體的COⅠ基因設(shè)計的熒光PCR引物和探針具有高特異性和高靈敏度的特性，本方法適用于在混合樣本中檢測暗色刺參。使用本方法可快速、精準(zhǔn)的鑒定暗色刺參,這將有利于該物種的保護(hù)工作。