棕櫚酸對溶藻弧菌的抑制效果及其作用機(jī)制研究

趙燕妮， 韓 潔， 周寧寧， 趙潔妤， 劉 歡*

(1.陜西科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院, 陜西 西安 710021； 2.河北環(huán)境工程學(xué)院 環(huán)境工程系, 河北 秦皇島 066102)

0 引言

溶藻弧菌(Vibrio.alginolyticus)是一類含有鞭毛的革蘭氏陰性弧菌，廣泛生存繁殖于世界各地的沿海、溪流及水生等生態(tài)環(huán)境中，能夠感染海洋魚類、貝類、蟹類以及蝦類等多種海水養(yǎng)殖動物[1-6]，出現(xiàn)細(xì)菌性出血、貧血及腮部潰爛等病癥[4,7]，從而給海水養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[8].溶藻弧菌還是一種典型的人-畜-魚共患的高致病性微生物，是細(xì)菌性的食源性致病菌，會導(dǎo)致人類中耳炎、創(chuàng)傷性感染，食用其某些菌株感染的水產(chǎn)食物還會引發(fā)人類食物中毒、腸道炎等疾病[9]，直接對人類生命健康造成嚴(yán)重威脅.有報(bào)道顯示在1988～2012年期間感染溶藻弧菌病例達(dá)1 331例，其中高達(dá)96%的病例來自沿海國家[10].目前，抗生素是應(yīng)對溶藻弧菌病害的主要防治手段，然而，抗生素的濫用不僅會造成細(xì)菌的耐藥性增強(qiáng)，而且殘留抗生素跟隨海產(chǎn)品進(jìn)入人體，也會引發(fā)食品安全問題.因此，開發(fā)新型安全有效海洋病原菌抑菌劑是目前亟待解決的問題.

脂肪酸作為細(xì)胞膜的重要組成部分，與細(xì)胞識別、種族特異性、細(xì)胞免疫、毒力、耐藥性等有著極為密切的關(guān)系.近年來的研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酸(FAs)及其衍生物可以選擇性抑制微生物病原體的生物被膜形成，改變細(xì)胞膜流動性、干擾細(xì)胞電子傳遞鏈系統(tǒng)、產(chǎn)生有毒降解產(chǎn)物.Kim等[11]發(fā)現(xiàn)鋸棕櫚油可抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157∶H7等多種微生物生物膜的形成，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)月桂酸和肉豆蔻酸可抑制大腸桿菌生物膜相關(guān)基因(csgAB、fimH和flhD)的表達(dá).Ryan等[12]和zhou等[13]發(fā)現(xiàn)野油菜黃單胞菌產(chǎn)生的脂肪酸(順-11甲基-2-十二烯酸)，是可擴(kuò)散信號因子(DSF)家族的第一個(gè)成員，該家族被發(fā)現(xiàn)可通過控制合成胞外酶(包括參與胞外多糖降解的內(nèi)葡聚糖酶)來誘導(dǎo)自身生物膜的分散.棕櫚酸作為一種重要的脂肪酸，已被美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)認(rèn)證是安全的食品成分并且被批準(zhǔn)可用作食品添加劑，在食品中作為潤滑劑、粘合劑、消泡劑和作為其他“食品級”添加劑中的復(fù)合物.我國GB2760-89規(guī)定，其也可用于配制各種食用香料、消泡劑和其他食品添加劑的原料.這意味著棕櫚酸已經(jīng)被認(rèn)可作為食品添加劑使用.已有研究發(fā)現(xiàn)棕櫚酸可抑制熱帶假絲酵母的生物膜、酶活性等毒力因子[14].然而目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)棕櫚酸對溶藻弧菌的抑菌效果及作用機(jī)制的研究工作.

本文通過測定棕櫚酸對溶藻弧菌的最小抑菌濃度、最小殺菌濃度以及其對溶藻弧菌生長曲線、細(xì)胞膜的影響，同時(shí)通過掃描電鏡觀察細(xì)胞表面形態(tài)變化來探究棕櫚酸對溶藻弧菌的抑制作用及可能機(jī)理，旨在為棕櫚酸對海產(chǎn)品病害防控技術(shù)的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株及培養(yǎng)條件

(1)菌株：本研究所用的菌株為溶藻弧菌EPGS(菌種保藏號 CCTCC No.AB209306)，由華東理工大學(xué)阿華生物工程研究所提供，溶藻弧菌長期儲存于-80 ℃.

(2)培養(yǎng)條件：實(shí)驗(yàn)時(shí)取菌種1%的接種量接種于LBS液體培養(yǎng)基(3%(w/v)NaCl，1%(w/v)Tryptone，0.5%(w/v)Yeast Extract)，加入0.1%(v/v)的氨芐青霉素，于200 r/min，30 ℃條件下活化復(fù)蘇培養(yǎng)12 h，本研究中所有實(shí)驗(yàn)操作前，溶藻弧菌均作此上活化培養(yǎng).

1.1.2 試劑及儀器

(1)主要材料與試劑

棕櫚酸(CAS 57-10-3)，購買于上海泰坦科技股份有限公司；NaCl，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；Tryptone(LP0042)、Yeast Extract(LP0021)，美國賽默飛世爾科技公司；氨芐青霉素，北京博奧托達(dá)科技有限公司；硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；葡萄糖(Glu)測試盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒(TBA法)，南京建成生物科技有限公司；磷酸緩沖溶液，陜西中暉赫彩生物醫(yī)藥科技有限公司；戊二醛，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙酸異戊酯，福晨化學(xué)試劑有限公司(天津).

(2)主要儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；ZD-85氣浴恒溫振蕩器，常州金壇良友儀器有限公司；H-1850R高速離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；JA2003電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HWS-24恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；VORTEX-5渦旋混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；SW-CJ-IFD單人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀，賽默飛世爾科技有限公司(芬蘭)；Verios 460場發(fā)射掃描電鏡，美國FEI公司；DDS-307電導(dǎo)儀，佑科儀器有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

所有實(shí)驗(yàn)均以未加棕櫚酸的溶藻弧菌培養(yǎng)液為對照組.

1.2.1 棕櫚酸對溶藻弧菌的最小抑菌濃度測定

最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)指在體外培養(yǎng)菌體24 h后能抑制培養(yǎng)基內(nèi)病原菌生長的最低藥物濃度.取-80 ℃甘油管凍存的溶藻弧菌，按1%的接種量接種于LBS液體培養(yǎng)基中，加入1%的氨芐青霉素，搖床活化培養(yǎng)12 h(30 ℃，200 r/min)，使菌液最終濃度約為108～109CFU/mL備用(4 ℃保存)，本實(shí)驗(yàn)采用二倍稀釋法對棕櫚酸擾動溶藻弧菌的MIC進(jìn)行測定，具體操作如下：先將棕櫚酸溶解于無水乙醇中，制備成10 mg/mL的母液，之后加入不同毫升數(shù)的棕櫚酸母液至LBS培養(yǎng)基中，使棕櫚酸最終的濃度為0 mg/mL、0.037 5 mg/mL、0.075 mg/mL、0.15 mg/mL、0.3 mg/mL、0.6 mg/mL、1.2 mg/mL，再按1%(v/v)接種量接入活化后的溶藻弧菌搖勻，將含有棕櫚酸的LBS菌懸液移植24孔板中，同時(shí)以不含棕櫚酸的菌懸液作為本實(shí)驗(yàn)的對照組.將24孔板置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，觀察菌體生長情況.培養(yǎng)液澄清，肉眼不可見菌體時(shí)所加入的棕櫚酸最低濃度即為棕櫚酸對溶藻弧菌的MIC.

1.2.2 棕櫚酸對溶藻弧菌的最小殺菌濃度測定

稱取海洋弧菌鑒別培養(yǎng)基粉末硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂(Thiosulfate citrate bile sucrose，TCBS)8.9 g，溶解至100 mL蒸餾水中煮沸，冷卻至50 ℃，倒入無菌培養(yǎng)板(固體培養(yǎng)基).經(jīng)章節(jié)1.2.1測定實(shí)驗(yàn)得出MIC后，于LBS液體培養(yǎng)基中加入不同毫升數(shù)的棕櫚酸，使得棕櫚酸最終的濃度分別為0、1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC，按1%的接種量加入活化后溶藻弧菌，搖床培養(yǎng)9 h(30 ℃，200 r/min)之后，將菌液劃線至TCBS固體培養(yǎng)板上，倒置培養(yǎng)24～36 h，觀察菌落生長，將未有溶藻弧菌菌落生長的最低濃度定為最小殺菌濃度(Minimum Bactericidal Concentration，MBC).

1.2.3 棕櫚酸對溶藻弧菌生長曲線的影響

經(jīng)章節(jié)1.2.1、1.2.2測定實(shí)驗(yàn)得出MIC、MBC后，對以上不同濃度的棕櫚酸對溶藻弧菌的生長曲線進(jìn)行測定.將經(jīng)活化后的溶藻弧菌菌懸液按1%的接種量加入LBS液體培養(yǎng)基中，并按0.1%的加入氨芐青霉素，搖床(30 ℃，200 r/min)培養(yǎng)12 h，每小時(shí)取200 uL于96孔板中，測定600 nm處的吸光值，并繪制生長曲線.

1.2.4 棕櫚酸對溶藻弧菌的細(xì)胞膜完整性的影響

(1)棕櫚酸對溶藻弧菌電解質(zhì)外泄的影響

取活化后的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)3 h后，加入0、MIC、2 MIC濃度的棕櫚酸，繼續(xù)培養(yǎng)6 h(30 ℃，200 r/min)，之后取1 mL菌液于6 000 r/min，4 ℃條件下離心5 min，使用電導(dǎo)率儀測定上清液的電導(dǎo)率，以去離子水作為空白對照.

(2)棕櫚酸對溶藻弧菌胞外葡萄糖的影響

取活化后的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)3 h后，加入0、MIC、2 MIC濃度的棕櫚酸，繼續(xù)培養(yǎng)6 h(30 ℃，200 r/min)，之后取1 mL菌液于6 000 r/min，4 ℃條件下離心5 min，使用葡萄糖試劑盒測定胞外葡萄糖含量.

(3)棕櫚酸對溶藻弧菌核酸、蛋白質(zhì)泄露的影響

取活化后的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)3 h后，加入0、MIC、2 MIC濃度的棕櫚酸，繼續(xù)培養(yǎng)6 h(30 ℃，200 r/min)，之后取1 mL菌液于8 000 r/min，4 ℃條件下離心3 min，在波長分別為260 nm(胞外核酸)、280 nm(胞外蛋白)處測定上清液的吸光值，以不加棕櫚酸的菌液上清作為對照.

(4)棕櫚酸對溶藻弧菌丙二醛含量(Malondialdehyde，MDA)的影響

取活化后的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)3 h后，加入0、MIC、2 MIC濃度的棕櫚酸，繼續(xù)培養(yǎng)6 h(30 ℃，200 r/min)，之后取1 mL菌液于4 000 r/min，4 ℃條件下離心3 min，使用丙二醛試劑盒測定上清液中MDA的含量.

(5)棕櫚酸對溶藻弧菌胞內(nèi)活性氧(Reactiveoxygen species，ROS)含量的影響

取活化后的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)3 h后，加入0、MIC、2 MIC濃度的棕櫚酸，繼續(xù)培養(yǎng)6 h(30 ℃，200 r/min)，之后取1 mL菌液于5 000 r/min，4 ℃條件下離心5 min，棄上清加入1 mL 10 umol/L的2,7—二氯二氫熒光素二乙酸酯溶液(2，7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)，于37 ℃下培養(yǎng)20 min后去除上清液，并用磷酸緩沖溶液(PBS)洗滌菌體3次，以增強(qiáng)測試結(jié)果的準(zhǔn)確性.測定細(xì)菌懸浮液的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm).

1.2.5 棕櫚酸對溶藻弧菌細(xì)胞形態(tài)的影響

取活化后的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)3 h后，加入0、MIC、2 MIC濃度的棕櫚酸，繼續(xù)培養(yǎng)6 h(30 ℃，200 r/min)，之后取1 mL菌液離心棄上清，加入1 mL 2.5%(v/v)戊二醛水溶液，于4 ℃冰箱靜置2～4 h.經(jīng)戊二醛固定后于8 000 r/min，4 ℃條件下離心3 min，去除上清液并加入1 mL PBS振蕩混勻10 min，再離心3 min(8 000 r/min，4 ℃)棄上清，洗脫3次除去菌體表面的培養(yǎng)液，之后依次用30%、60%、80%、100%(v/v)乙醇梯度洗脫(期間換梯度離心8 000 r/min，4 ℃，3 min)，棄上清加入1 mL乙酸異戊酯混勻，置于4 ℃冰箱浸泡30 min或過夜.離心去除上清液，菌體在干燥箱70 ℃下干燥3～4 h至固體粉末狀.最后將粉末狀菌體均勻涂抹于導(dǎo)電膠并裝載在載物臺，噴金后在高分辨場發(fā)射掃描電鏡下進(jìn)行觀察拍照.

1.3 數(shù)據(jù)分析

本研究中所有試驗(yàn)重復(fù)三次，所得數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.使用GraphPad Prism 8.0.2軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并且使用T檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行顯著性差異分析(“*”表示實(shí)驗(yàn)組與對照組有顯著差異(0.01

2 結(jié)果與討論

2.1 棕櫚酸對溶藻弧菌的最小抑菌濃度研究

溶藻弧菌在最適培養(yǎng)條件下，經(jīng)棕櫚酸處理后，測定發(fā)現(xiàn)棕櫚酸對溶藻弧菌的MIC為0.6 mg/mL.當(dāng)棕櫚酸的濃度低于0.6 mg/mL時(shí)，菌體經(jīng)24 h的生長繁殖，培養(yǎng)液出現(xiàn)不同程度的渾濁；當(dāng)棕櫚酸濃度達(dá)到或高于0.6 mg/mL時(shí)，溶藻弧菌經(jīng)24 h的培養(yǎng)未出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)菌生長，且培養(yǎng)液澄清透亮，與不加溶藻弧菌的空白組基本一致.結(jié)果表明棕櫚酸對溶藻弧菌有一定的抑菌作用，其MIC為0.6 mg/mL.基于所得的MIC，進(jìn)一步探究棕櫚酸對溶藻弧菌的抑菌作用.

2.2 棕櫚酸對溶藻弧菌的最小殺菌濃度研究

經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)得知，棕櫚酸對溶藻弧菌具有一定的抑菌作用，本文進(jìn)一步探究其對溶藻弧菌的殺菌作用.將經(jīng)不同濃度棕櫚酸(CK、1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC)處理后的溶藻弧菌菌懸液均勻劃線于TCBS瓊脂平板上進(jìn)行菌落觀察，將TCBS平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱(30 ℃)24 h，其結(jié)果如圖1所示.

圖1 棕櫚酸對溶藻弧菌的最小殺菌濃度研究

由圖1可知，未加棕櫚酸的對照CK組，溶藻弧菌長滿了平板，且菌落密集；經(jīng)1/2 MIC濃度的棕櫚酸處理后，溶藻弧菌亦有大量生長，形成了較為密集的菌落；當(dāng)濃度為MIC時(shí)，平板上仍有小部分菌體生長；而當(dāng)棕櫚酸濃度為2 MIC和4 MIC時(shí)，TCBS瓊脂板上未出現(xiàn)肉眼可見的菌落生長.故可確定棕櫚酸對溶藻弧菌的MBC為2 MIC，即MBC=2 MIC=1.2 mg/mL.為進(jìn)一步探究棕櫚酸對溶藻弧菌的抑菌作用，本文選擇CK(未加棕櫚酸)、MIC、2 MIC三組進(jìn)行后續(xù)研究.

2.3 棕櫚酸對溶藻弧菌生長曲線的研究

生長曲線是根據(jù)培養(yǎng)物中存在的活細(xì)胞數(shù)量確定的.棕櫚酸對溶藻弧菌的生長曲線(所有實(shí)驗(yàn)組及對照組的起始OD600值≈0)影響如圖2所示.

圖2 棕櫚酸影響下溶藻弧菌的生長曲線

由圖2可知，當(dāng)棕櫚酸濃度低于MIC時(shí)，溶藻弧菌的生長在0～3 h為遲緩期，菌體接入LBS后，菌體體積增大、代謝活躍，對新環(huán)境短暫的適應(yīng)，其中不適應(yīng)的菌體因轉(zhuǎn)種而死亡，即表明在遲緩期低于MIC棕櫚酸濃度下的菌體未出現(xiàn)明顯差異；在3～9 h內(nèi)溶藻弧菌進(jìn)入對數(shù)增長期，活菌數(shù)直線上升，不同濃度的棕櫚酸暴露，溶藻弧菌的生長曲線出現(xiàn)明顯梯度降低趨勢，即棕櫚酸對溶藻弧菌的生長曲線有明顯影響；9～12 h內(nèi)，溶藻弧菌進(jìn)入穩(wěn)定期(OD600≈1.56)，該期的生長菌群總數(shù)幾乎處于平坦階段，12 h時(shí)對照組的OD600≈2.04，1/2 MIC組的OD600≈1.20，菌群總數(shù)約降低了0.59倍，即表明在棕櫚酸濃度低于MIC處，其對溶藻弧菌亦有明顯的影響作用.當(dāng)棕櫚酸濃度達(dá)或高于MIC時(shí)，溶藻弧菌在整個(gè)檢測周期中未出現(xiàn)菌體增長，即溶藻弧菌完全被抑制.所有的生長結(jié)果表明：棕櫚酸嚴(yán)重干擾了溶藻弧菌的生長曲線.

2.4 棕櫚酸對溶藻弧菌細(xì)胞膜完整性的影響

基于對生長曲線的測定，菌體在對數(shù)增長期(3～9 h)內(nèi)細(xì)菌形態(tài)、染色、生物活性都很典型，對外界環(huán)境因素的作用敏感，因此在菌體生長9 h時(shí)研究細(xì)菌性狀最好，且抑菌作用在該時(shí)期的細(xì)菌效果最佳.

微生物細(xì)胞膜的完整性是保證其維持自身新陳代謝等正常生理活動的重要因素.目前，對于脂肪酸的抑菌機(jī)理大部分研究認(rèn)為，其主要以細(xì)胞膜為靶點(diǎn)的作用機(jī)理[11].由于細(xì)胞膜是控制細(xì)胞與外界進(jìn)行物質(zhì)交換的主要屏障，細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)可被細(xì)胞膜有選擇地控制進(jìn)出，避免胞內(nèi)物質(zhì)外泄以及胞外物質(zhì)非正常進(jìn)入.細(xì)胞膜作為大部分抑菌劑的作用靶點(diǎn)，其功能性質(zhì)隨抑菌劑發(fā)生變化.抑菌劑處理菌體會引起細(xì)胞膜流動性變差，細(xì)胞膜的選擇透過能力被破壞，胞內(nèi)例如K+、DNA、RNA等多種內(nèi)容物流出，導(dǎo)致細(xì)胞自身調(diào)控失調(diào)、細(xì)胞破裂、甚至死亡.Zhang等[15]發(fā)現(xiàn)經(jīng)抑菌劑-多糖干擾后菌液的電導(dǎo)率、蛋白質(zhì)等呈濃度依賴性增加，證明了該多糖對該菌的抑制作用，即表明通過測定電導(dǎo)率等指標(biāo)可監(jiān)測細(xì)胞膜功能性質(zhì)及抑菌劑的抑菌作用.

因此，為了進(jìn)一步明確棕櫚酸對溶藻弧菌細(xì)胞膜通透性、選擇透過性等功能的破壞程度，本研究使用電導(dǎo)率研究棕櫚酸對溶藻弧菌細(xì)胞膜的通透性影響，監(jiān)測棕櫚酸對溶藻弧菌胞外核酸、胞外蛋白質(zhì)含量的影響，分別利用葡萄糖試劑盒和丙二醛試劑盒對胞外葡萄糖和丙二醛進(jìn)行測定，以及對胞內(nèi)活性氧的監(jiān)測.

2.4.1 棕櫚酸對溶藻弧菌電解質(zhì)外泄的影響

細(xì)胞膜是微生物防止細(xì)胞外的有害物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的重要屏障，其保證了細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài).當(dāng)細(xì)胞膜被破壞，導(dǎo)致其通透性增大，大量的細(xì)胞內(nèi)容物外泄，從而影響細(xì)胞的正常生長代謝[16].使用電導(dǎo)率儀檢測菌液上清的電導(dǎo)率變化研究棕櫚酸對溶藻弧菌電解質(zhì)外泄的影響，如圖3所示.

圖3 棕櫚酸對溶藻弧菌電導(dǎo)率的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著棕櫚酸的濃度增加，處理組的電導(dǎo)率相比對照組有明顯的提高，MIC與2 MIC兩組的電導(dǎo)率相比較對照組隨棕櫚酸濃度的增大，電導(dǎo)率成正相關(guān)變化，分別增加了約4.36倍、5.71倍.電導(dǎo)率的增加可能是因?yàn)樽貦八嵋鹑茉寤【?xì)胞膜損傷，改變了菌體細(xì)胞膜的通透性、完整性，直接導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)除正常胞內(nèi)外運(yùn)輸?shù)碾x子以外(如K+、Na+、PO43-等)的離子大量流出，使電導(dǎo)率增大，從而影響了溶藻弧菌菌體的正常生長，達(dá)到了抑菌的目的.Zhou等[17]通過測定細(xì)胞膜的膜電位發(fā)現(xiàn)紫蘇精油破壞了糞腸球菌細(xì)胞膜的完整性，表明膜電位可用來判斷細(xì)胞膜的完整性：膜電位增加，細(xì)胞膜完整性降低.

2.4.2 棕櫚酸對溶藻弧菌胞外葡萄糖含量的影響

葡萄糖主要參與細(xì)胞的能量代謝，一般情況下細(xì)胞外的葡萄糖含量極少通過主動運(yùn)輸方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi).當(dāng)細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)時(shí)，大部分胞內(nèi)葡萄糖會泄露到細(xì)胞外.經(jīng)不同濃度棕櫚酸處理的溶藻弧菌胞外葡萄糖含量的變化結(jié)果如圖4所示.

圖4 棕櫚酸對溶藻弧菌胞外葡萄糖的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)棕櫚酸處理的MIC組、2 MIC組的葡萄糖含量隨棕櫚酸濃度的增加呈濃度依賴性增加，分別增加了4.17倍、4.83倍.由此可見，隨著棕櫚酸濃度增加，溶藻弧菌的細(xì)胞膜被破壞，胞內(nèi)的葡萄糖外泄至胞外.棕櫚酸擾動溶藻弧菌使菌體胞內(nèi)的葡萄糖外泄，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)正常的能量代謝受到嚴(yán)重干擾，從而影響菌體正常生命活動，達(dá)到一定的抑制干擾作用.

2.4.3 棕櫚酸對溶藻弧菌胞外核酸、胞外蛋白的影響

細(xì)胞膜是保護(hù)細(xì)胞的第一道屏障，當(dāng)抑制劑處理細(xì)胞后，微生物的天然屏障受到損傷，從而造成細(xì)菌內(nèi)容物包括核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)外泄.核酸和蛋白在260 nm、280 nm處有很強(qiáng)的紫外吸收峰.因此，本研究使用全波長掃描式多功能讀數(shù)儀檢測細(xì)胞外核酸含量、蛋白含量變化，以探究棕櫚酸對溶藻弧菌核酸、蛋白質(zhì)外泄的影響，結(jié)果如圖5、圖6所示.

圖5 棕櫚酸對溶藻弧菌胞外核酸的影響

圖6 棕櫚酸對溶藻弧菌胞外蛋白的影響

由圖可知，經(jīng)棕櫚酸處理的MIC組、2 MIC組的胞外核酸(分別增加了2.18倍、2.56倍)及胞外蛋白(分別增加了1.91倍、2.49倍)含量遠(yuǎn)高于CK組.且隨棕櫚酸濃度的增大，胞外核酸和胞外蛋白質(zhì)的含量呈正相關(guān)增長.由此可見，隨著棕櫚酸濃度增加，溶藻弧菌的細(xì)胞膜被破壞，胞內(nèi)的核酸和大分子蛋白外泄至胞外.推測棕櫚酸影響了溶藻弧菌細(xì)胞膜的通透性和完整性，使菌體胞內(nèi)核酸、胞內(nèi)蛋白質(zhì)外泄，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)正常的生命代謝受到嚴(yán)重干擾，從而影響菌體正常生命活動，達(dá)到一定的干擾作用.王虹懿等[18]通過檢測胞外核酸、胞外蛋白質(zhì)外滲情況，發(fā)現(xiàn)綠原酸與Ⅲ型細(xì)菌素復(fù)配使熒光假單胞菌的膜通透性增強(qiáng)，表明可通過監(jiān)測胞外核酸、胞外蛋白質(zhì)來監(jiān)測細(xì)胞膜的通透性.

2.4.4 棕櫚酸對溶藻弧菌丙二醛含量的影響

MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物之一，是監(jiān)測細(xì)胞膜通透性的主要指標(biāo)，它的產(chǎn)生能加劇細(xì)胞膜的損傷[19].本研究利用丙二醛試劑盒對對照組及經(jīng)棕櫚酸處理的實(shí)驗(yàn)組的丙二醛進(jìn)行測定，以檢測棕櫚酸對溶藻弧菌細(xì)胞膜的影響，結(jié)果如圖7所示.

圖7 棕櫚酸對溶藻弧菌丙二醛的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，經(jīng)棕櫚酸處理的MIC組、2 MIC組的丙二醛含量分別增加了1.69倍、2.03倍，呈劑量依賴性增加.以上結(jié)果說明棕櫚酸可攻擊溶藻弧菌細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜過氧化損傷.Dai等[20]通過檢測丙二醛含量，發(fā)現(xiàn)經(jīng)冷等離子體處理使鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞膜的氧化損傷，表明丙二醛含量增高，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞.

2.4.5 棕櫚酸對溶藻弧菌胞內(nèi)活性氧的影響

ROS具有較強(qiáng)的氧化活性，過量的ROS會氧化損傷菌體細(xì)胞膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)，從而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[21].Czaika等[22]發(fā)現(xiàn)ROS對金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林菌有較強(qiáng)的殺滅作用，表明ROS可加快細(xì)菌凋亡.本實(shí)驗(yàn)測定不同棕櫚酸處理后溶藻弧菌細(xì)胞內(nèi)的活性氧含量，結(jié)果如圖8所示.

圖8 棕櫚酸對溶藻弧菌胞內(nèi)活性氧的影響

與對照組相比，經(jīng)棕櫚酸處理的MIC組、2 MIC組的活性氧含量分別增加了1.08倍、1.25倍，且呈劑量依賴性.結(jié)果說明棕櫚酸可提高胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)量，ROS的積累表明：棕櫚酸可顯著抑制溶藻弧菌的代謝活性并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激從而導(dǎo)致細(xì)胞膜的過氧化損傷.

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明棕櫚酸對溶藻弧菌細(xì)胞膜完整性的破壞情況，棕櫚酸通過破壞溶藻弧菌細(xì)胞膜的完整，影響菌體正常的生命代謝活動，從而抑制了溶藻弧菌的生長繁殖.

2.5 高分辨場發(fā)射掃描電鏡觀察棕櫚酸對溶藻弧菌細(xì)胞形態(tài)的影響

通過章節(jié)2.3的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)棕櫚酸嚴(yán)重破壞了溶藻弧菌細(xì)胞膜的完整性和通透性，引起細(xì)胞內(nèi)容物外泄.為更加直觀的觀察棕櫚酸對溶藻弧菌細(xì)胞形態(tài)的影響，通過場發(fā)射掃描電鏡觀察經(jīng)不同濃度棕櫚酸處理后溶藻弧菌細(xì)胞形態(tài)的變化，如圖9所示.

圖9 掃描電鏡觀測棕櫚酸對溶藻弧菌細(xì)胞形態(tài)的影響

由圖9可知，未經(jīng)棕櫚酸處理的溶藻弧菌呈典型的弧菌形態(tài)(短桿狀)，細(xì)胞膜保持完整，菌體光滑飽滿，邊緣明顯且圓滑.當(dāng)加入棕櫚酸之后，溶藻弧菌的細(xì)胞形態(tài)遭受到一定的破壞，細(xì)菌菌體表面呈現(xiàn)明顯的凹凸不平、干扁殘缺、皺縮、甚至破裂等現(xiàn)象，MIC濃度棕櫚酸處理后，幾乎所有的細(xì)胞呈現(xiàn)出細(xì)胞不完整、褶皺的現(xiàn)象.隨棕櫚酸濃度增大，細(xì)胞損傷更加嚴(yán)重，已喪失溶藻弧菌固有的棒狀弧菌形態(tài)；經(jīng)2 MIC棕櫚酸作用后菌體細(xì)胞嚴(yán)重受損，出現(xiàn)畸形，在觀察視野下幾乎全部細(xì)胞呈高度破壞狀態(tài).溶藻弧菌細(xì)胞的受損程度和數(shù)量隨棕櫚酸濃度的增加而增大.以上結(jié)果表明，棕櫚酸能夠破壞溶藻弧菌細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)以及完整性，進(jìn)而抑制菌體正常生長甚至凋亡.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸對溶藻弧菌有較良好的抑制作用，能夠使細(xì)胞發(fā)生破損、坍塌，影響細(xì)胞膜的完整性和通透性等,進(jìn)而破壞細(xì)胞的正常形態(tài)，導(dǎo)致核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的泄漏，致使細(xì)胞穩(wěn)態(tài)被破壞使菌體凋亡.本研究結(jié)果可為新型、高效的天然弧菌抑菌劑的開發(fā)提供理論依據(jù).本文僅從抑菌活性角度初步解析棕櫚酸的抑菌作用，后期還需從棕櫚酸對溶藻弧菌毒力因子影響的角度開展深入研究，探究其抑菌機(jī)制.