海綿動(dòng)物共附生石油烴降解菌的篩選、復(fù)配及其降烴影響因素響應(yīng)面優(yōu)化

侯亞楠, 劉書偉, 王 燕, 張?zhí)锾? 王阿文, 沈夢(mèng)霞

(海南熱帶海洋學(xué)院 生態(tài)環(huán)境學(xué)院, 海南 三亞 572022)

0 引言

石油被譽(yù)為工業(yè)的血液，它不僅是社會(huì)發(fā)展的重要能源，也是許多化工產(chǎn)品的原料[1].近年來，在石油開采、煉制和運(yùn)輸?shù)冗^程中，溢油事故頻發(fā)[2]，釋放到海洋環(huán)境中的石油烴化合物影響海洋生態(tài)系統(tǒng)，進(jìn)而威脅人類健康[3].消除石油污染和保護(hù)海洋環(huán)境已經(jīng)成為全世界關(guān)注的環(huán)境問題[4].目前，海洋石油烴污染的處理方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法[5]，但物理法處理不徹底，化學(xué)法易造成海洋環(huán)境二次污染，生物法具有降油效果好、成本低和二次污染小等優(yōu)點(diǎn)，因此，生物法已成為最具有應(yīng)用前景的石油烴污染的修復(fù)技術(shù)[6].然而，海洋溢油事件發(fā)生后，常采用圍油欄、撇油器收集海面上大量的石油烴，對(duì)于已擴(kuò)散或殘留的石油烴，暫無有效的處理方法，進(jìn)一步分散到海水中，致使這類石油烴污染物的集中處理成為一個(gè)難題.

海綿是一種多細(xì)胞濾食性海洋動(dòng)物，具有較強(qiáng)的泵水能力，每天泵水量可達(dá)自身的體積的170～72 000倍，加勒比海的海水幾乎每天都被海綿過濾一遍[7].海綿動(dòng)物獨(dú)特的孔狀結(jié)構(gòu)使其成為許多海洋微生物的優(yōu)良宿主[8]，其濾食性使微生物在海綿體內(nèi)不斷積累，并與之形成共生體，所以海綿動(dòng)物體內(nèi)含有大量微生物，許多種類其體內(nèi)微生物的比重高達(dá)40%～60%[9].海綿-微生物共生體類似于布滿微生物的篩子——“微生物篩”，其利用海綿動(dòng)物不斷泵水的特征，將海水源源不斷地泵入“微生物篩”，海水中的污染物在通過“微生物篩”時(shí)，有一部分被微生物降解，所以，海綿-微生物共生體對(duì)海水具有一定的凈化能力[10].可見，從海綿中分離具有降解功能的微生物，用于海洋環(huán)境的生物修復(fù)具有非常重要的意義.

本研究從海綿動(dòng)物中篩選降烴菌株，并對(duì)其進(jìn)行鑒定、復(fù)配和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，探討和分析不同溫度、pH值、轉(zhuǎn)速和石油烴濃度等環(huán)境因素對(duì)目標(biāo)菌株降烴效果的影響，以期構(gòu)建具有良好降烴效果的海綿-降烴菌株共生體，從而解決海洋石油烴污染物難以集中處理的問題.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要材料

海綿動(dòng)物樣品取自海南省黎族自治縣清水灣；實(shí)驗(yàn)所用石油烴由中國(guó)海洋石油集團(tuán)有限公司提供，密度為0.92 g/mL.

1.1.2 主要試劑

氯化鈉(AR)、磷酸氫二鈉(AR)、氯化銨(AR)、硫酸鎂(AR)和硝酸鉀(AR)等試劑購(gòu)自天津市福晨化學(xué)試劑廠，石油醚(AR)購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司，D2000 DNA Marker、2×Taq PCR Master Mix購(gòu)自天根生物科技有限公司.

1.2 主要儀器設(shè)備

DGL-35B高壓滅菌鍋(上海力辰邦西儀器科技有限公司)、UV-5100紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)、Flexcycler多功能PCR儀(德國(guó)耶拿分析儀器股份公司)、Enduro GDS凝膠成像系統(tǒng)(深圳市賽進(jìn)生物科技有限公司)等.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 石油烴降解菌的富集、分離和純化

將海綿剪碎后置于無菌研缽中，并加入適量無菌海水，充分研磨后取上清液5 mL于100 mL石油烴培養(yǎng)基[11]中，在28 ℃、160 r/min條件下富集7 d，當(dāng)培養(yǎng)基中出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，取5 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入100 mL新鮮的石油烴培養(yǎng)基中，連續(xù)富集3次后，對(duì)降烴菌進(jìn)行稀釋涂布和純化[12].

1.3.2 石油烴降解率的測(cè)定

采用紫外分光光度法[13]繪制石油烴標(biāo)準(zhǔn)曲線，以石油烴濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.005 5x-0.005 9，R2=0.999 1；石油烴降解率計(jì)算公式[14]如式(1)所示：

(1)

1.3.3 菌株的鑒定

以降解率為指標(biāo)，優(yōu)選降烴效果最佳的3株單菌株進(jìn)行鑒定，如果3株單菌株種屬相同，則鑒定降烴效果次之的單菌株，以此類推，直至選出降烴效果最佳的3種菌株.鑒定方法采用16S rDNA測(cè)序，即：將菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心并提取總DNA，以總DNA為模板，采用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取5 μL PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳20 min，送至上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序.測(cè)序結(jié)果運(yùn)用Genbank中的BLAST進(jìn)行序列比對(duì)，鑒定菌株的種屬，并采用MEGA7.0軟件建立發(fā)育樹.

1.3.4 石油降解復(fù)合菌系的構(gòu)建

對(duì)優(yōu)選的3種菌株采用2種菌種或3種菌種復(fù)配，共計(jì)4個(gè)組合.組合內(nèi)各菌株量比例相等，每個(gè)組合菌株總濃度相等(用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株濃度為OD600=1.5)，從每個(gè)組合中取體積1 mL的菌液分別加入4個(gè)50 mL石油烴培養(yǎng)基中，并設(shè)置空白對(duì)照(無菌的50 mL石油烴培養(yǎng)基)，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)7 d.測(cè)量各培養(yǎng)基中石油的含量，計(jì)算降解率，選擇降解率最高的一組作為優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行下一步試驗(yàn).本實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)重復(fù).

1.3.5 單因素試驗(yàn)

參考吳秉奇等[15]的方法并改良設(shè)定單因素試驗(yàn)的培養(yǎng)條件：(1)培養(yǎng)溫度：20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃；(2)培養(yǎng)基初始pH值：5.6、6.4、7.2、8.0和8.8；(3)搖床轉(zhuǎn)速：120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min和200 r/min；(4)石油烴初始濃度：10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L和50 g/L.石油烴降解率的測(cè)定方法同1.2.2.本實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)重復(fù).

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化條件、模型擬合與驗(yàn)證

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)降解率影響較大的3個(gè)因素為自變量，以石油烴降解率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行二次回歸擬合及方差分析檢驗(yàn)，得出各變量最佳參數(shù).按照模型最佳參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃裕治鲎罱K優(yōu)化結(jié)果.本實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)重復(fù).

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用SPSS19.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，并選用Origin5.0進(jìn)行作圖，利用Design Expert 8.0軟件對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，并提出回歸模型.

2 結(jié)果與討論

2.1 降烴菌株的篩選、鑒定和復(fù)配

2.1.1 降烴菌株的篩選

經(jīng)過稀釋涂布法初步分離，篩選降烴菌株23株(圖1)，分別命名為Y1、Y2、Y3……Y23.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定菌株的降解率，其中降解率超過20%的微生物有7株，降解率超過30%的微生物有3株為Y2、Y5和Y6，其降解率分別是30.09%、33.90%、30.45%，優(yōu)選降烴效果最佳的3株單菌株開展后續(xù)鑒定實(shí)驗(yàn).如果3株單菌株種屬相同，則鑒定降烴效果次之的單菌株，以此類推，直至選出降烴效果最佳的3種菌株.

圖1 單菌株對(duì)石油烴的降解能力

2.1.2 降烴菌株的鑒定

對(duì)菌株Y2、Y5和Y6進(jìn)行16S rDNA基因擴(kuò)增與測(cè)序，并將所得序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，利用MEGA7.0軟件的N-J法建立系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示.從系統(tǒng)發(fā)育樹上可以看出，菌株Y2與Stappia屬菌株Stappiaconradaestrain MIO處于一個(gè)最小的獨(dú)立分支，且自展支持率為99，并與該屬其他物種處于相近卻又不同的分支，由此可以鑒定菌株Y2為Stappia屬的菌株，并且為Stappiaconradae物種.同理分析可得，菌株Y5為Halomonas屬的菌株，并且為Halomonasaquamarina物種；菌株Y6為Sphingopyxis屬的菌株，并且為Sphingopyxisterrae物種.

圖2 菌株Y2(NR115950.1)、Y5(EU440965.1)和Y6(MH385010.1)的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

2.1.3 降烴菌株的復(fù)配

對(duì)Y2、Y5和Y6開展復(fù)配實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果如表1所示.由表1可知，復(fù)合菌系Y5-Y6對(duì)石油烴的降解率最高，因此，選取復(fù)配菌群Y5-Y6進(jìn)行后續(xù)的降解條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn).由于石油成分復(fù)雜，單一菌株難以完成對(duì)石油全組分的降解，通過不同菌株間的共生和協(xié)同作用形成復(fù)雜的微生物區(qū)系，可以實(shí)現(xiàn)污染物的有效降解，進(jìn)而提高石油降解率[16].寧卓等[17]研究發(fā)現(xiàn)石油降解菌組合的降解率或高于或低于單菌株的降解率，這是由于微生物之間存在各種相互關(guān)系，如共附生、競(jìng)爭(zhēng)和拮抗等.本研究中也觀察到了類似的結(jié)果，Y2-Y5-Y6組合的降解率低于Y5-Y6組合，可能是由于微生物之間存在拮抗關(guān)系.細(xì)菌組合的選定僅靠“降解率”單一指標(biāo)來進(jìn)行，各種微生物之間的相互作用以及降解機(jī)理有待進(jìn)一步研究.

表1 石油混合菌群復(fù)配方案及結(jié)果

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 初始pH值對(duì)降解率的影響

酸堿環(huán)境是微生物生長(zhǎng)代謝的主要影響因素之一，環(huán)境pH值過高或過低都會(huì)影響微生物酶的活性，從而影響菌株對(duì)石油烴的降解.由圖3可知，石油烴降解率隨著pH值的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中pH=8.0時(shí)降解率達(dá)到峰值(39.90%).

圖3 初始pH值對(duì)石油烴的降解率影響

2.2.2 石油烴濃度對(duì)降解率的影響

圖4顯示了降解率隨石油烴濃度呈先升高后降低趨勢(shì)，當(dāng)石油烴濃度為20 g/L降解率達(dá)到峰值；石油烴濃度從20 g/L升至50 g/L，降解率急劇下降，同時(shí)石油烴的實(shí)際降解量也隨之降低，說明高濃度的石油烴,抑制了微生物的活性,影響了菌體生長(zhǎng)，也會(huì)導(dǎo)致溶解氧含量的降低，影響微生物的代謝作用.

圖4 石油烴濃度對(duì)降解率影響

2.2.3 轉(zhuǎn)速對(duì)降解率的影響

由圖5可知，隨著轉(zhuǎn)動(dòng)速度由120 r/min提高至160 r/min，組合Y5-Y6的降烴效果逐漸升高，當(dāng)轉(zhuǎn)速為160 r/min時(shí)，石油烴的降解率隨著溶解氧的升高而變大；當(dāng)轉(zhuǎn)速繼續(xù)上升至200 r/min時(shí)，降解效果反倒有所下降，可能是由于振速過高影響細(xì)菌與碳源的接觸情況.

圖5 轉(zhuǎn)速對(duì)石油烴的降解率影響

2.2.4 溫度對(duì)降解率的影響

溫度會(huì)影響微生物自身的代謝活性[18].由圖6可知，組合Y5-Y6降烴的最佳溫度是30 ℃，石油烴的去除率達(dá)40%以上.當(dāng)溫度低于或高于30 ℃時(shí)，酶的活性可能降低，導(dǎo)致該組合的降解率變小.

圖6 溫度對(duì)石油烴的降解率影響

2.3 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果

利用SPSS對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，選取對(duì)降解率影響較大的3個(gè)因素初始pH值、溫度和石油烴濃度為自變量，各因子和水平情況見表2所示.依據(jù)Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理進(jìn)行了17次試驗(yàn)，其結(jié)果見表3所示.

表2 各因子和水平

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

2.3.2 回歸方程與方差分析

采用Design Expert 10軟件對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得出降解率對(duì)三個(gè)因素的多元二次回歸模型：Y=51.22+4.17A+1.71B-6.26C+2.63AB+0.018AC-0.88BC-14.99A2-10.56B2-11.11C2.表4顯示，其失擬項(xiàng)P值為0.721 0>0.05，說明該模型建立合理.模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.996 7，表明石油烴降解率的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間擬合度較好，模型的調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.992 5，說明有99.25% 的石油烴降解條件可以用該模型進(jìn)行分析解釋.

表4 回歸模型方差分析

2.3.3 響應(yīng)面曲線圖和等高線圖分析

響應(yīng)曲面的坡度及等高線的偏離程度可反映兩兩因素間的交互作用，響應(yīng)面坡度越陡，表明二者間的交互作用越顯著，對(duì)石油烴降解率影響較大，反之越平緩則影響越小[19].由圖7～9可知，3個(gè)因素對(duì)石油烴降解率的影響為：C>A>B；在交互項(xiàng)對(duì)石油烴降解率的影響中，A與B交互作用顯著，A與C、B與C交互作用不顯著.這與回歸方程模型的方差分析結(jié)果一致.

圖7 pH值與溫度交互影響石油降解率的響應(yīng)面

圖8 初始pH值與石油濃度交互影響石油烴降解率的響應(yīng)面

圖9 溫度與石油濃度交互影響石油烴降解率的響應(yīng)面

2.3.4 最佳降解工藝及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用Design Expert軟件對(duì)模型方程求解，預(yù)測(cè)最優(yōu)條件初始pH值、溫度、石油烴濃度相應(yīng)值為8.12、30.55 ℃、17.14 g/L時(shí)，其響應(yīng)值降解率最大為52.52%.根據(jù)實(shí)際情況，將濃度和溫度分別修改為17 g/L、30.5 ℃，其它條件不變.在此工藝下進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，重復(fù)3次，得到降解率平均值為50.73%，與模型預(yù)測(cè)值52.52%吻合度較高，表明該模型可以較好地預(yù)測(cè)實(shí)際情況.

3 結(jié)論

(1)本研究從海綿動(dòng)物中篩選出23株石油烴降解菌，其中有3株細(xì)菌石油烴降解率較高，對(duì)其進(jìn)行鑒定得出Y2為Stappiaconradae、Y5為Halomonasaquamarina、Y6為Sphingopyxisterrae.根據(jù)菌株復(fù)配后組合的降解率可得知，由Y5和Y6組成的菌群組合降解率最高，7 d后，石油烴降解率達(dá)到39.05%.

(2)本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Box-Bchnken響應(yīng)面法，對(duì)石油烴降解率的影響條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)對(duì)降解率的影響較大的3個(gè)因素依次石油濃度>初始pH值>溫度；建立了回歸模型，該模型預(yù)測(cè)得到最優(yōu)條件初始pH值、溫度、石油烴濃度相應(yīng)值為8.12、30.55 ℃、17.14 g/L時(shí)，其響應(yīng)值降解率最大為52.52%，驗(yàn)證試驗(yàn)的石油烴降解率為50.73%.實(shí)測(cè)值和模型預(yù)測(cè)值相近，表明該模型可以較好地預(yù)測(cè)實(shí)際情況.