衍生化HPLC法測定雙氫睪酮制劑中的藥物含量*

聶 陽，陳輝芳，朱俊訪，李 博，劉亞娟，丁 立

(1 廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院制藥工程學(xué)院，廣東 廣州 510520；2 廣東嶺南職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，廣東 廣州 510663；3 廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院實驗實訓(xùn)中心，廣東 廣州 510520)

雙氫睪酮(Dihydrotestosterone)是一種由人體自然產(chǎn)生的雄性激素，廣泛分布于全身血液當(dāng)中，可促進(jìn)男性生殖系統(tǒng)的正常發(fā)育，對于第二性征的出現(xiàn)和維持有積極作用，臨床上主要用于5α-還原酶缺陷所致性分化異常，鑒別診斷良性前列腺疾病[1-2]。目前，國內(nèi)報道的雙氫睪酮測定方法有兩種：放射/酶聯(lián)免疫法、質(zhì)譜聯(lián)用法，前者主要用于人體組織及體液臨床檢測，后者樣品處理繁瑣、檢測費用高昂[3-5]。雙氫睪酮雙氫睪亦稱17β-羥基-5α-雄[甾]烷-3-酮，因其化學(xué)結(jié)構(gòu)中無可產(chǎn)生紫外吸收的生色基團(tuán)，無法采用常規(guī)的HPLC法測定，因此，國內(nèi)無雙氫睪酮及制劑的HPLC測定方法報道。

衍生化技術(shù)利用衍生化反應(yīng)使藥物與衍生化試劑生成衍生物，以改變待測物的化學(xué)和物理性質(zhì)，使其具有對紫外和熒光檢測器有響應(yīng)的官能團(tuán)，則可以大大提高HPLC的檢測靈敏度和檢測范圍[6-7]。本研究基于雙氫睪酮的羥基與對硝基苯甲酰氯快速衍生化反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)生明顯的紫外吸收，建立衍生化HPLC測定雙氫睪酮方法。本法靈敏度高，干擾少而選擇性強(qiáng)，是雙氫睪酮及其制劑質(zhì)量控制的一個好方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀 器

Agilent 1200 HPLC，配自動進(jìn)樣器和 DAD二極管矩陣檢測器，美國安捷倫公司；Sartorious BS-224S電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；JY92-2D超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；SH23-2恒溫磁力攪拌器，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司。

1.2 試 劑

雙氫睪酮原料(含量>99.1%)，山東鉑源藥業(yè)有限公司；雙氫睪酮制劑(凝膠、乳膏、粉針劑)實驗室自制；對硝基苯甲酰氯，山西西亞化工科技有限公司；乙腈為色譜純，美國Tedia公司；二氯甲烷、吡啶、乙酸乙酯、無水乙醇、甲醇均為分析純，阿拉丁試劑有限公司；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX StableBond-C18柱(4.4 mm×250 mm,5 μm)；流動相：甲醇-0.2%三乙胺水(95:5)；柱溫：25 ℃：流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量: 20 μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)液的配制

精密稱取雙氫睪酮原料10.30 mg，加甲醇25 mL溶解，得濃度為412.00 μg/mL雙氫睪酮儲備液。取雙氫睪酮儲備液加甲醇稀釋，制得不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液。

2.3 衍生化反應(yīng)條件

稱取樣品溶液適量置于25 mL具塞圓底燒瓶中，用二氯甲烷-吡啶(5:1) 5mL溶解，加入對硝基苯甲酰氯0.20 g密閉，超聲30 min，靜置2 h，加水5 mL，超聲30 min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，靜置1 d，取下層清液，通過大孔吸附樹脂柱(20 cm×2.0 cm)以70%乙醇300 mL洗脫，繼以無水乙醇400 mL洗脫，收集無水乙醇洗脫液，蒸干，用甲醇溶解，定容至10 mL，備用。

2.4 供試品溶液的配制

精密稱取雙氫睪酮制劑約2 g，以乙酸乙酯30 mL回流提取2 h，揮盡乙酸乙酯后，取濾渣置錐形瓶中，加入甲醇20 mL，超聲提取60 min，過濾，取濾液，揮干，將殘渣按“2.3衍生化反應(yīng)條件”進(jìn)行衍生化反應(yīng)，用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，定容至刻度，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液20 μL，得供試品溶液。

2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性

按“2.2標(biāo)準(zhǔn)液的配制”項下操作，但不加雙氫睪酮原料，再按“2.4供試品溶液的配制”項下操作，且不加對硝基苯甲酰氯，得陰性對照液。按“2.2標(biāo)準(zhǔn)液的配制”項下操作，得雙氫睪酮標(biāo)準(zhǔn)液。按“2.2標(biāo)準(zhǔn)液的配制”項下操作，再按“2.4供試品溶液的配制”項下操作，得雙氫睪酮標(biāo)準(zhǔn)液衍生物。按“2.4供試品溶液的配制”項下操作，得雙氫睪酮凝膠衍生物。

取陰性對照液、雙氫睪酮標(biāo)準(zhǔn)液、雙氫睪酮標(biāo)準(zhǔn)品衍生化物和雙氫睪酮凝膠衍生化物進(jìn)液相按“2.1色譜條件”項下測定，HPLC色譜圖見圖1。在此色譜條件下，對照品和樣品中其他組分可基線分離，與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)計算不低于3000。

圖1 陰性對照液(A)、雙氫睪酮標(biāo)準(zhǔn)液(B)、雙氫睪酮標(biāo)準(zhǔn)品衍生化物(C)和雙氫睪酮凝膠衍生化物(D)HPLC圖

2.6 線性關(guān)系考察

精密移取雙氫睪酮儲備液0.5、1、2、3、1、2 mL，置50、50、50、50、10、10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制備成濃度依次為4.12、8.24、12.36、24.76、41.20和82.40 μg·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.4 供試品溶液的配制”項方法處理樣品，吸取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖和峰面積。以峰面積Y對質(zhì)量濃度X(μg·mL-1)進(jìn)行線性回歸計算，得雙氫睪酮的線性回歸方程分別為: Y=84517X- 29.878,r=0.9997。結(jié)果表明，雙氫睪酮在4.12～82.40 μg·mL-1范圍內(nèi)，其濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系。.

2.7 精密度試驗

取同一標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.4供試品溶液的配制”項方法處理樣品，進(jìn)液相色譜儀測定，重復(fù)進(jìn)樣6次，計算雙氫睪酮峰面積的RSD為0.89%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗

取同一批的雙氫睪酮凝膠，按“2.4供試品溶液的配制”項方法處理樣品，平行制備6份樣品，吸取20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖和峰面積計算含量。結(jié)果雙氫睪酮的平均含量為24.7276 mg/g，RSD分別為1.55%，表明方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性考察

精密吸取同一批雙氫睪酮凝膠供試品溶液20 μL，分別于0、2、4、8、12、16、24 h取樣測定，計算雙氫睪酮峰面積的RSD為1.18%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率試驗

精密稱取雙氫睪酮原料1.2012 g，加乙腈溶解，定容至50 mL，得濃度為24.024 mg·mL-1雙氫睪酮高濃度溶液。取已知含量的同一批雙氫睪酮凝膠，分別精密加入一定量的雙氫睪酮高濃度溶液，按“2.4供試品溶液的配制”項方法處理樣品，進(jìn)液相測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果

3 雙氫睪酮制劑含量測定

分別取3種雙氫睪酮制劑各3批，按按“2.4供試品溶液的配制”項方法處理樣品，精密吸取供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，計算含量，結(jié)果見表2。

表2 雙氫睪酮制劑中藥物含量測定結(jié)果(n=3)

4 討 論

4.1 色譜條件的選擇

本實驗采用衍生化HPLC法，對雙氫睪酮分子的羥基進(jìn)行苯甲?；磻?yīng)，使最大吸收波長移至254 nm處；對流動相所用的比例進(jìn)行系列試驗，結(jié)果表明甲醇-0.2%三乙胺水為95:5時峰形最佳。對照品、供試品在本文色譜條件下均無雜峰干擾，提高了分離選擇性和檢測靈敏度，實現(xiàn)了對樣品中干擾物質(zhì)的分離和雙氫睪酮的定量分析。

4.2 衍生化方法的優(yōu)化

以苯甲酰鹵作為衍生化試劑，應(yīng)用于衍生化HPLC法在藥物的含量測定中已有廣泛應(yīng)用[8-9]。本方法采用對硝基苯甲酰氯為衍生化試劑，從衍生劑與樣品反應(yīng)的最適濃度、反應(yīng)溫度、衍生反應(yīng)時間、樣品萃取、大孔樹脂洗脫方法等，進(jìn)行了衍生化方法的全面優(yōu)化，建立了衍生化HPLC對雙氫睪酮制劑中藥物含量測定方法。

4.3 樣品的提取

在樣品提取上，對乙酸乙酯回流法、水煎醇沉法和超聲提取法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，回流提取法所測得雙氫睪酮的含量明顯高于超聲提取和水煎醇沉法。對回流法的提取時間和溫度進(jìn)行了考察，確定2 h為最佳提取時間。提取溫度在70～80 ℃時，提取率無明顯變化。

5 結(jié) 論

實驗結(jié)果表明，該方法快速、靈敏、準(zhǔn)確，各項技術(shù)指標(biāo)符合有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。本研究建立的衍生化反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物穩(wěn)定，樣品進(jìn)樣前處理簡單，可用于雙氫睪酮的定量分析，為雙氫睪酮制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)，也可為其他類似物質(zhì)的衍生檢測提供參考。