miR-155/PTEN 軸在高糖誘導(dǎo)HRCEC 凋亡中的作用及機(jī)制

蔡文麗，謝紅波

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病患者常見的微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致成人失明的常見病因之一，不僅影響患者的健康及生活質(zhì)量，也增加了家庭和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。DR 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human retinal capillary endothelial cells，HRCEC）在高糖環(huán)境下發(fā)生損傷與該病發(fā)生的關(guān)系最為密切，也有越來越多的學(xué)者開始關(guān)注高糖引起HRCEC 損傷的機(jī)制及防治手段[1-2]。微小RNA（microRNA，miR）是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的一類非編碼小分子RNA，具有廣泛的生物學(xué)作用，多種miR與糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生有關(guān)[3-5]。POLINA ER 等[6]的臨床研究表明，DR 患者血漿中miR-155 的表達(dá)明顯減少；鄭華峰等[7]的細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，高糖能夠誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡并下調(diào)細(xì)胞中miR-155 的表達(dá)，過表達(dá)miR-155 能夠抑制高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。本課題組前期通過生物信息學(xué)分析證實(shí)促凋亡基因磷脂酶和張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）是受到miR-155 調(diào)控的靶基因，miR-155 可能靶向PTEN 并起到抑制凋亡的作用。目前，miR-155/PTEN 軸在高糖誘導(dǎo)HRCEC凋亡中的作用及機(jī)制尚不清楚。因此，本研究將以HRCEC 為實(shí)驗(yàn)對象，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析miR-155/PTEN 軸在高糖誘導(dǎo)HRCEC 凋亡中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器

HRCEC 細(xì)胞株MZ-M044（寧波明舟生物公司），miR-155 模擬物及陰性對照（negative control，NC）序列（上海吉瑪公司），四唑氮鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfopheny)-2H-tetrazolium，MTS]細(xì)胞活力檢測試劑盒（武漢艾美捷公司，K300），原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（北京全式金公司，F(xiàn)A201-01），細(xì)胞裂解液、蛋白定量試劑盒（北京奧維亞公司，RL1020、RTP7102），雙熒光素酶報(bào)告基因及檢測試劑盒（美國Promega 公司，E1910），PTEN、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、磷酸化AKT（phosphorylation-AKT，p-AKT）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）抗體（美國Abcam 公司，ab267787、ab8805、ab38449、ab252439）。

細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司，HERAcell 240i），顯微鏡（日本Nikon 公司，E100），熒光定量PCR 儀（美國Bio-rad 公司，CFX96），凝膠電泳系統(tǒng)及成像系統(tǒng)（上海天能公司，Tanon3500）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

HRCEC 在含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面80%～90%時(shí)進(jìn)行胰酶消化，按照1∶3的比例傳代培養(yǎng)，傳代后的細(xì)胞進(jìn)行分組干預(yù)。

為驗(yàn)證miR-155 的生物學(xué)功能，細(xì)胞分為3 組，分別為：miR-NC 組、miR-NC+高糖組、miR-155+高糖組。miR-NC 組在普通培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染NC 序列，miR-NC+高糖組在含有33 mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染NC 序列，miR-155+高糖組在含有33 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染miR-155 模擬物。NC 序列或miR-155 模擬物的終濃度為20 nmol/L，每組均連續(xù)轉(zhuǎn)染24 h。

為驗(yàn)證PTEN 在miR-155 生物學(xué)功能中的作用，細(xì)胞分為4 組，分別為：miR-NC+空白質(zhì)粒組、miR-NC+空白質(zhì)粒+高糖組、miR-155+空白質(zhì)粒組+高糖組、miR-155+PTEN 質(zhì)粒組+高糖組。miR-NC+空白質(zhì)粒組在普通培養(yǎng)基中共轉(zhuǎn)染NC 序列及空白質(zhì)粒，miR-NC+空白質(zhì)粒+高糖組在含有33 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基中共轉(zhuǎn)染NC 序列及空白質(zhì)粒，miR-155+空白質(zhì)粒組+高糖組在含有33 mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)基中共轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒及miR-155 模擬物，miR-155+PTEN質(zhì)粒組+高糖組在含有33 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染PTEN 質(zhì)粒及miR-155 模擬物。NC 序列或miR-155 模擬物的終濃度為20 nmol/L，質(zhì)粒的終濃度為1 μg/mL，每組均連續(xù)轉(zhuǎn)染24 h。

1.3 miR-155表達(dá)水平的qRT-PCR檢測

將密度為106個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液按照1.0 mL/孔接種在12孔板內(nèi)，分組轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先采用miR 提取分離試劑盒提取細(xì)胞中的miR，而后采用cDNA 第1 鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、以miR 為模板合成cDNA，最后采用miR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒檢測，反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性3 min，而后94℃變性15 s、60℃變性34 s、重復(fù)40 次。分別使用目的基因miR-155 及內(nèi)參基因U6的特異性引物，得到循環(huán)曲線、以U6為內(nèi)參計(jì)算miR-155的表達(dá)水平。

1.4 細(xì)胞活力的MTS檢測

將密度為106個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液按照0.2 mL/孔接種在96孔板內(nèi)，分組轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用MTS 試劑盒檢測細(xì)胞活力，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作并在酶標(biāo)儀上檢測490 nm 波長處的吸光值（optical density，OD）。

1.5 細(xì)胞凋亡的TUNEL檢測

將密度為106個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液按照0.5 mL/孔接種在24孔板內(nèi)，分組轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用TUNEL試劑盒檢測細(xì)胞凋亡，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作并在顯微鏡下觀察TUNEL 陽性染色的細(xì)胞數(shù)、計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.6 Western Blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

將密度為106個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液按照0.5 mL/孔接種在24孔板內(nèi)，分組轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞中的蛋白，進(jìn)行蛋白定量、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉，然后放入1∶1,000 稀釋的PTEN、AKT、p-AKT、eNOS 抗體中，4℃孵育過夜；第2 d在1∶2,000稀釋的二抗中室溫孵育1 h，最后在凝膠成像系統(tǒng)中顯影得到蛋白條帶，根據(jù)條帶灰度值計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.7 miR-155靶向PTEN基因mRNA 3’UTR的驗(yàn)證

合成野生型PTEN 基因mRNA 3’UTR 雙熒光素酶報(bào)告基因，將3’UTR 第329-335 堿基、第5018-5024 堿基分別進(jìn)行突變后成為突變型PTEN 基因mRNA 3’UTR 雙熒光素酶報(bào)告基因-1、突變型PTEN 基因mRNA 3’UTR 雙熒光素酶報(bào)告基因-2，將雙熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，而后分別轉(zhuǎn)染NC 模擬物或miR-155 模擬物，轉(zhuǎn)染24 h 后用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒在測定螢火蟲熒光值和海腎熒光值，以螢火蟲熒光值/海腎熒光值計(jì)算熒光素酶報(bào)告基因的熒光活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料，方差分析（ANOVA）進(jìn)行多組變量間的相互比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖環(huán)境下HRCEC中miR-155的表達(dá)水平

3 組間HRCEC 中miR-155 表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.924，P=0.004）。兩兩比較，與miRNC 組比較，miR-NC+高糖組HRCEC 中miR-155 表達(dá)降低（t=3.010，P=0.017）；與miR-NC+高糖組比較，miR-155+高糖組HRCEC 中miR-155 表達(dá)升高（t=4.069，P=0.004），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 高糖環(huán)境下HRCEC中miR-155的表達(dá)水平（，n=5）

表1 高糖環(huán)境下HRCEC中miR-155的表達(dá)水平（，n=5）

注：*與miR-NC 組比較，P<0.05；#與miR-NC+高糖組比較，P<0.05；miR-155 微小RNA-155；NC 陰性對照

2.2 過表達(dá)miR-155 對高糖環(huán)境下HRCEC 細(xì)胞活力及凋亡、PTEN、p-AKT、eNOS表達(dá)水平的影響

3組間HRCEC的OD490值及細(xì)胞凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FOD490=4.342，P=0.038；F凋亡率=40.466，P=0.000）。兩兩比較，（1）細(xì)胞活力（OD490值）：與miR-NC 組比較，miR-NC+高糖組的OD490值降低（t=2.801，P=0.023）；與miR-NC+高糖組比較，miR-155+高糖組的OD490值增加（t=2.907，P=0.020），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）細(xì)胞凋亡率：與miR-NC 組比較，miR-NC+高糖組的細(xì)胞凋亡率增加（t=6.769，P=0.000）；與miR-NC+高糖組比較，miR-155+高糖組的細(xì)胞凋亡率降低（t=5.957，P=0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1、表2）。

圖1 過表達(dá)miR-155對高糖環(huán)境下HRCEC細(xì)胞活力及凋亡的影響（TUNEL染色，×400）

3 組間HRCEC 中PTEN、p-AKT、eNOS 表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FPTEN=15.872，F(xiàn)p-AKT=26.758，F(xiàn)eNOS=17.174，均P=0.000）。兩兩比較，（1）PTEN：與miR-NC 組比較，miR-NC+高糖組HRCEC 中PTEN 表達(dá)增加（t=4.882，P=0.001）；與miR-NC+高糖組比較，miR-155+高糖組HRCEC 中PTEN 表達(dá)降低（t=3.855，P=0.005），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）p-AKT：與miR-NC 組比較，miR-NC+高糖組的HRCEC 中p-AKT 表達(dá)降低（t=6.699，P=0.000）；與miR-NC+高糖組比較，miR-155+高糖組HRCEC 中p-AKT 表達(dá)增加（t=6.450，P=0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（3）eNOS：與miR-NC 組比較，miR-NC+高 糖組HRCEC 中eNOS 表達(dá)降低（t=5.813，P=0.000）；與miR-NC+高糖組比較，miR-155+高糖組HRCEC 中eNOS 表達(dá)增加（t=4.875，P=0.001），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2、表2）。

圖2 過表達(dá)miR-155 對高糖環(huán)境下HRCEC 中PTEN 及p-AKT、e-NOS表達(dá)水平的影響

表2 過表達(dá)miR-155對高糖環(huán)境下HRCEC細(xì)胞活力及凋亡、PTEN、p-AKT和eNOS表達(dá)的影響（，n=5）

表2 過表達(dá)miR-155對高糖環(huán)境下HRCEC細(xì)胞活力及凋亡、PTEN、p-AKT和eNOS表達(dá)的影響（，n=5）

注：*與miR-NC 組比較，P<0.05；#與miR-NC+高糖組比較，P<0.05；miR-155 微小RNA-155；NC 陰性對照；PTEN 磷脂酶和張力蛋白同源物；p-AKT 磷酸化AKT；eNOS 內(nèi)皮型一氧化氮合酶；HRCEC 視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞

2.3 miR-155 在HRCEC 中靶向PTEN 3’UTR 的驗(yàn)證

經(jīng)Targetscan分析，miR-155靶向PTEN基因mRNA 的3’UTR 第329-335 堿基、第5018-5024 堿基（圖3）；與miR-NC 組比較，miR-155 組HRCEC 中野生型PTEN 基因mRNA 3’UTR 雙熒光素酶報(bào)告基因的熒光活力顯著降低（t=6.358，P=0.000），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；突變型PTEN 基因mRNA 3’UTR 雙熒光素酶報(bào)告基因的熒光活力無明顯變化（t突變型基因-1=0.327，P=0.752；t突變型基因-2=0.353，P=0.733）。

圖3 miR-155靶向PTEN基因mRNA 3’UTR的Targetscan分析

2.5 過表達(dá)PTEN 對miR-155 調(diào)控高糖環(huán)境下HRCEC細(xì)胞活力、凋亡及PTEN表達(dá)水平的影響

4 組間HRCEC 的OD490值、凋亡率、PTEN 表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FOD490=14.260，F(xiàn)凋亡率=30.720，F(xiàn)PTEN=12.988，均P=0.000）。兩兩比較，（1）細(xì)胞活力（OD490值）：與miR-NC+空白質(zhì)粒組比較，miR-NC+空白質(zhì)粒+高糖組的OD490值降低（t=5.404，P=0.001）；與miR-NC+空白質(zhì)粒+高糖組比較，miR-155+空白質(zhì)粒組+高糖組的OD490值增加（t=4.139，P=0.003）；與miR-155+空白質(zhì)粒組+高糖組比較，miR-NC+PTEN質(zhì)粒+高糖組的OD490值降低（t=3.777，P=0.005），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）細(xì)胞凋亡率：與miR-NC+空白質(zhì)粒組比較，miR-NC+空白質(zhì)粒+高糖組的細(xì)胞凋亡率升高（t=6.642，P=0.000）；與miR-NC+空白質(zhì)粒+高糖組比較，miR-155+空白質(zhì)粒組+高糖組的細(xì)胞凋亡率降低（t=5.318，P=0.001）；與miR-155+空白質(zhì)粒組+高糖組比較，miR-NC+PTEN 質(zhì)粒+高糖組的細(xì)胞凋亡率升高（t=6.406，P=0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（3）PTEN：與miR-NC+空白質(zhì)粒組比較，miR-NC+空白質(zhì)粒+高糖組PTEN 表達(dá)升高（t=4.486，P=0.002）；與miR-NC+空白質(zhì)粒+高糖組比較，miR-155+空白質(zhì)粒組+高糖組PTEN 表達(dá)降低（t=3.944，P=0.004）；與miR-155+空白質(zhì)粒組+高糖組比較，miR-NC+PTEN 質(zhì)粒+高糖組PTEN 表達(dá)升高（t=4.243，P=0.003），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4、圖5、表3）。

表3 過表達(dá)PTEN對miR-155調(diào)控高糖環(huán)境下HRCEC細(xì)胞活力及凋亡的影響（，n=5）

注：*與miR-NC+空白質(zhì)粒組比較，P<0.05；#與miR-NC+空白質(zhì)粒+高糖組比較，P<0.05；&與miR-155+空白質(zhì)粒組+高糖組比較，P<0.05；HRCEC 視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞；PTEN 磷脂酶和張力蛋白同源物

圖4 過表達(dá)PTEN對miR-155調(diào)控高糖環(huán)境下HRCEC細(xì)胞活力、凋亡的影響（TUNEL染色，×400）

圖5 過表達(dá)PTEN后高糖環(huán)境下HRCEC中PTEN的影響

3 討論

高糖引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷是與多種糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的病理環(huán)節(jié)[8-10]，但具體的機(jī)制尚不十分明確。新近多項(xiàng)關(guān)于糖尿病血管并發(fā)癥的臨床研究[11-12]證實(shí)，DR、糖尿病腎病、糖尿病合并冠心病患者血清中miR-155 的表達(dá)明顯降低；另有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)[7]，高糖抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中miR-155的表達(dá)降低且miR-155具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用。

在DR 的發(fā)病過程中，高糖誘導(dǎo)HRCEC 損傷發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，多項(xiàng)研究[7-9,13-14]報(bào)道，HRCEC在高糖環(huán)境中的細(xì)胞活力降低、凋亡率升高。本實(shí)驗(yàn)的分析結(jié)果與既往研究一致，即高糖組HRCEC的細(xì)胞活力低于對照組、凋亡率高于對照組，表明高糖能夠促進(jìn)HRCEC 發(fā)生凋亡。DR 相關(guān)的臨床研究[7]已經(jīng)證實(shí)DR 患者血漿中miR-155 的表達(dá)減少[6]，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中miR-155 能夠發(fā)揮抗凋亡作用，本研究證實(shí)高糖使HRCEC 中miR-155 的表達(dá)明顯降低；在高糖環(huán)境下過表達(dá)miR-155 后，HRCEC 的細(xì)胞活力增加、凋亡率降低，表明miR-155能夠抑制高糖誘導(dǎo)的HRCEC凋亡。

PTEN 是目前已知的miR-155 靶基因[15-17]，該基因?qū)ο掠蜛KT 的磷酸化具有抑制作用，內(nèi)皮細(xì)胞功能中AKT 的磷酸化能夠增加eNOS 的表達(dá)并起到內(nèi)皮保護(hù)作用[18-19]；高糖、過氧化氫等通過PTEN/AKT/eNOS 軸造成內(nèi)皮損傷[20-21]。本實(shí)驗(yàn)用高糖培養(yǎng)基處理HRCEC 后觀察到細(xì)胞中PTEN 的表達(dá)增加，p-AKT、eNOS 的表達(dá)減少；而在轉(zhuǎn)染miR-155 模擬物后，細(xì)胞中PTEN 的表達(dá)減少，p-AKT、eNOS 的表達(dá)增加，表明miR-155 能夠在抑制HRCEC 中PTEN的表達(dá)、促進(jìn)下游AKT/eNOS 通路的活化，靶向PTEN 可能是miR-155 在高糖環(huán)境下抑制HRCEC凋亡的分子機(jī)制。

為了驗(yàn)證miR-155 對PTEN 的靶向作用，本研究通過生物信息學(xué)分析證實(shí)PTEN 基因mRNA 的3’UTR 含有miR-155 的結(jié)合位點(diǎn)；經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，miR-155 能夠直接靶向PTEN 基因mRNA 的3’UTR 且靶向結(jié)合位點(diǎn)與生物信息學(xué)預(yù)測一致。最后，本研究還驗(yàn)證了PTEN 在miR-155抑制高糖誘導(dǎo)HRCEC 凋亡中的作用，通過轉(zhuǎn)染PTEN 質(zhì)粒增加細(xì)胞中PTEN 的表達(dá)，過表達(dá)PTEN后、miR-155 在高糖環(huán)境下增加細(xì)胞活力及抑制細(xì)胞凋亡的作用發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，證實(shí)miR-155 通過靶向抑制PTEN的表達(dá)來抑制高糖誘導(dǎo)的HRCEC凋亡。

綜上所述，高糖環(huán)境下HRCEC 凋亡激活且miR-155表達(dá)減少、PTEN表達(dá)增加，過表達(dá)miR-155能夠靶向抑制PTEN 并抑制高糖誘導(dǎo)的HRCEC 凋亡，miR-155/PTEN 軸可能在DR 的發(fā)生中起到重要作用，過表達(dá)miR-155、靶向抑制PTEN 可能成為未來治療DR的新靶點(diǎn)。