黃芪內(nèi)生菌多樣性及其次生代謝產(chǎn)物研究進展

任群利， 王 苗， 李小蘭， 胡 歡， 劉建國， 冉應(yīng)會， 綦 杉， 王 倩

（1.遵義醫(yī)科大學生命科學研究院 貴州省普通高等學校微生物資源與藥物開發(fā)特色重點實驗室，貴州遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學生命科學研究院 貴州省普通高等學校口腔疾病研究特色重點實驗室，貴州遵義 563000；3.遵義醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，貴州遵義 563000；4.遵義醫(yī)科大學第一臨床學院，貴州遵義 563000）

黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根（國藥典，2020）。 黃芪又稱黃耆、戴糝、綿芪、芰草、百木、箭芪，主要分布在中國和韓國（Jin-Hee，2017） ，在我國主要分布于東北、西北和內(nèi)蒙古等地（翟李欣，2019；張開雪，2016），是重要的北方藥材， 藥用價值具有2000 多年的歷史 （張雷鳴，2014）。 黃芪中含有多種生物活性成分， 如多糖、皂苷、黃酮、氨基酸、谷甾醇、β 素谷甾醇、亞麻酸、亞油酸、葉酸及多種微量元素等，潛在質(zhì)量標志物為黃芪甲苷、 毛蕊異黃酮苷和芒柄花苷 （姜輝，2020）。 黃芪具有強心、抗心肌缺血、提高免疫力、降糖、抗衰老、保護臟器等多種藥理作用（張淑娟，2021；張開雪，2016）。

植物內(nèi)生菌（Endophyte）是一定階段或全部階段生活于健康植物的組織和器官內(nèi)部的真菌或細菌。 植物內(nèi)生菌是具有豐富多樣性特征的微生物類群，據(jù)統(tǒng)計，自然界中至少存在著一百萬種內(nèi)生菌（Radic，2012），植物內(nèi)生菌是一種新型生物活性物質(zhì)資源（翟李欣，2019），以宿主植物代謝物為營養(yǎng)物質(zhì)（高紅，2020）。內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生與宿主相同或相近的活性成分物質(zhì)， 已經(jīng)被證實是一類豐富代謝產(chǎn)物的重要來源（Schulz，2002）。 隨著測序技術(shù)不斷提升， 對黃芪內(nèi)生菌的開發(fā)研究逐漸增加，本文就近年來對黃芪內(nèi)生菌多樣性、內(nèi)生菌的分離鑒定及其次生代謝產(chǎn)物的研究進行綜述。

1 黃芪內(nèi)生菌多樣性

黃芪內(nèi)生菌包括真菌和細菌。 內(nèi)生菌的多樣性主要由以下幾個方面決定:（1）同種植物的不同部位，如根、莖、葉，在其組織內(nèi)所生長的內(nèi)生菌的種類及數(shù)目不同 （Subhash Janardhan，2012）；（2）同種植物在不同生理、病理狀態(tài)下，其內(nèi)生菌種類及數(shù)目也會相應(yīng)發(fā)生改變（鄭雪，2017）；（3）產(chǎn)地、氣候等環(huán)境因素及采集的時間等都直接影響內(nèi)生菌生物多樣性（Brader，2014；Yang，2012；潘巧娜，

2008）。本文對黃芪內(nèi)生菌多樣性研究進行全面歸納總結(jié)，文獻中黃芪主要采自其主產(chǎn)地黑龍江、山西、內(nèi)蒙古、青海、遼寧、哈爾濱及甘肅等地，均為健康植株，多數(shù)為野生黃芪。

1.1 黃芪內(nèi)生真菌多樣性 植物內(nèi)生真菌（Endophytic fungi） 是指那些寄生全部生活或近乎全部生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部或細胞間隙中，而不使寄主表現(xiàn)任何癥狀的一類真菌（張雷鳴，2014；周鳳，2012） 。趙春杰等（2009）從黃芪根部分離得到了12 株內(nèi)生真菌，5 株內(nèi)生真菌的菌塊有抑菌活性。 馬偉等（2012）從黃芪根塊中共分離出28 株內(nèi)生真菌， 分屬于鐮孢菌屬（Fusarium），生赤殼屬（Bionectria），裸胞殼屬（Emericella），枝穂霉屬（Cladosporium），枝頂孢屬（Acremonium）， 青 霉 屬 （Penicillium） 及 曲 霉 屬（Aspergillus）。 周鳳等（2012）從恒山黃芪根、莖、葉中共獲得49 株內(nèi)生真菌， 分屬于3 目、6 科、17 屬，從黃芪的根部分離得到28 株內(nèi)生真菌， 分屬于11 個屬，絲核菌屬（Rhizoctonia）和根霉屬（Rhizopus）為優(yōu)勢屬，莖中分離出15 株內(nèi)生真菌，分屬于9 個屬，絲核菌屬為優(yōu)勢屬，而葉中只分離出6株內(nèi)生真菌，33 株具有抑菌活性，9 株高抗菌活性的菌株。龔賀等（2014）從膜莢黃芪根、葉各培養(yǎng)基上共分離65 株內(nèi)生真菌， 鑒定為半知菌門鐮孢屬、曲霉屬、青霉屬，其中鐮孢屬為優(yōu)勢菌群。Wei Ma（2014）對東北地區(qū)黃芪內(nèi)生真菌活性物質(zhì)生產(chǎn)進行研究， 從黃芪中共分離到28 株內(nèi)生真菌。胡青等（2016）從黃芪塊根中得到內(nèi)生真菌17 株，分列7 個菌屬中。 孔悅等（2016）從黃芪的根、莖、葉中分離出20 株內(nèi)生真菌， 有8 株抑菌率較大。鄭雪等（2017）從北芪根部、莖部中共分離出30 株內(nèi)生真菌，從根中分離得到16 株，從莖中分離得到14 株。劉蓬蓬等（2018）分離鑒定黃芪根部內(nèi)生真菌主要分布于駝孢銹菌屬（Hemileia），赤霉菌屬（Gibberella），糞盤菌屬（Ascobolus），假裸囊菌屬（Pseudogymnoascus） 和曲霉屬共5 個屬，劉超等（2019）從黃芪植株研究中得到相同結(jié)論，其優(yōu)勢菌屬為駝孢銹菌屬和赤霉菌屬。

1.2 黃芪內(nèi)生細菌多樣性 內(nèi)生細菌（Endophyt e）是指廣泛存在于一切植物體內(nèi)的共生細菌，研究者從黃芪中發(fā)現(xiàn)大量內(nèi)生細菌存在。 趙春杰（2009）從黃芪中分離出內(nèi)生細菌8 株，經(jīng)復(fù)篩后有3 株具有抗菌活性。馬蕓（2010）對我國青藏高原藥用植物黨參、黃芪、連翹葉片的內(nèi)生細菌進行遺傳多樣性的研究，共分離到42 株內(nèi)生細菌，分屬于9 個屬，其中微球菌屬（Micrococcus）為此類群的優(yōu)勢菌群。胡青（2016）從黃芪中分離到內(nèi)生細菌34 株，革蘭氏陽性菌19 株、革蘭氏陰性菌15 株，以單胞桿菌和芽孢桿菌屬為主。劉蓬蓬等（2018）從黃芪內(nèi)生細菌門的分類水平看，主要分布在變形菌門（Proteobacteria），厚壁菌門（Firmicutes）， 擬桿菌門 （Bacteroidetes）， 浮霉菌門（Planctomycetes），放線菌門（Actinobacteria）。 屬水平上主要分布于Anderseniella 屬，芽孢桿菌屬（Bacillus），伯克氏菌屬（Burkholderia），不動桿菌屬 （Acinetobacter）， 寡 養(yǎng) 單 孢 菌 屬（Stenotrophomonas）， 海 洋 芽 孢 桿 菌 屬（Oceanobacillus）6 個屬。 翟李欣等（2019）從北芪根部、莖部共分離出36 株內(nèi)生細菌，根中20 株，莖中16 株。 研究表明，黃芪根部共分離得85 株內(nèi)生細菌，分屬4 個門和13 個屬，在門水平，主要為變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、桿菌門，屬水平上，主要分布為泛菌屬、單胞菌屬、葡萄球菌屬（高紅，2020）。

2 黃芪內(nèi)生菌分離鑒定及活性研究

藥用植物內(nèi)生菌與藥用植物本身一樣， 具有某些抗藥抑菌活性（馬蕓，2010）。孫月等（2006）從膜莢黃芪葉中分離到一株具有抗菌活性的內(nèi)生真菌-瓶霉菌屬（Phialophora）。 趙春杰等（2010）從黃芪植物中分離到一株具有高抑菌活性的菌株，鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilius）的變種。 翟李欣等（2019）從黃芪根、莖中發(fā)現(xiàn)一株內(nèi)生細菌，鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌 （Bacillus methylotrophicus）。 周鳳等（2012）從中國藥用植物恒山黃芪的根部分離得到一株內(nèi)生真菌， 鑒定為曲霉屬；Ma（2014）從黃芪中分離出四株生長穩(wěn)定，活力旺盛， 重復(fù)性好的菌株， 鑒定為Oxysporum和Bionectria ochroleuca， 這兩種內(nèi)生真菌在中國東北地區(qū)鮮見分離報道。 張宏馳等（2017）從黃芪莖部分離得到一株內(nèi)生真菌，鑒定為青霉屬；從黃芪根部分離到的一株內(nèi)生真菌，被鑒定為根霉屬；從黃芪葉部分分離出一株內(nèi)生真菌， 鑒定為溜曲霉（Aspergillus tamarii），該菌具有降解甲醛作用。 劉瑞等（2019、2016）從黃芪根部發(fā)現(xiàn)了3 株內(nèi)生真菌，2 株鑒定為刀孢蠟蚧菌（Lecanicillium psalliotae）和灰黃青霉（Penicillium griseofulvum），該菌株對皮革霉變真菌有很好抑制作用；1 株真菌鑒定為黑曲霉（Aspergillus niger）；鄭雪等（2017）從黃芪中發(fā)現(xiàn)一株內(nèi)生真菌， 鑒定為鏈格孢屬菌（Alternaria alternata）。 孔悅等（2016）篩選出2 株恒山黃芪內(nèi)生真菌頭孢霉屬 （Cephalosporium）和青霉屬，對指示菌有很強的抑菌活性。 研究表明，黃芪葉片中的兩種內(nèi)生真菌，Diaporthe oncostoma和Diaporthe infecunda，被用作強心劑、利尿劑和血管擴張劑（Jin-Hee，2017）。

3 黃芪內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物及活性

內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生與宿主相同或相近的活性成分物質(zhì)， 已經(jīng)被證實是一類豐富代謝產(chǎn)物的重要來源，是篩選活性物質(zhì)的潛在資源。植物內(nèi)生菌活性代謝產(chǎn)物的多樣性由其宿主植物中內(nèi)生菌的多樣性所決定， 研究表明黃芪內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物中含有皂甙類、多糖類和黃酮類物質(zhì)，對細菌具有不同程度的抑菌活性（孫月，2006），除此之外，還含有氨基酸和生物堿類物質(zhì)等重要活性成分（潘巧娜，2008）。

3.1 黃酮類 鄭雪等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，1 株黃芪內(nèi)生真菌鏈格孢屬菌發(fā)酵產(chǎn)物為活性成分芒柄花素（formononetin），翟李欣等（2019）從2 株內(nèi)生細菌發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了該化合物。

3.2 生物堿

3.2.1 gliotoxin 類 劉瑞等（2016）從黃芪內(nèi)生真菌發(fā)酵液中分離鑒定出活性次生代謝產(chǎn)物gliotoxin 類共7 個，其中從灰黃青霉和青霉屬（張弘弛，2017） 的發(fā)酵液中分離鑒定出膠霉毒素gliotoxin，從青霉屬的固體發(fā)酵萃取物中分離到6個 gliotoxin 類 代 謝 產(chǎn) 物 為 bisdethiobis（methylthio） gliotoxin，dehydroxybisdethiobis（methylthio） gliotoxin，dehydrogliotoxin，6-deoxy-5a，6 -didehydrogliot oxin，didehydrobisdethiobis（methylthio）gliotoxin，bis-N-norgliovietin， 其中一類化合物主要用作免疫抑制劑，具有抗病毒、抗真菌和抑菌作用， 對黃芪白粉病原菌顯示出強抑制作用， 另一類化合物物具有拮抗血小板激活因子的活性（張弘弛，2017）。

3.2.2 吲哚二酮哌嗪類 周鳳（2012）從恒山黃芪一株內(nèi)生真菌曲霉屬的發(fā)酵液中分離得到4 個吲哚二酮哌嗪類代謝產(chǎn)物，分別為fumitremorgin B，verruculogen，fumitremorgin C 和cyclotryprostatins B。 抗菌活性顯示，4 個化合物對大部分測試菌均具有明顯的抑制活性， 特別是化合物yclotryprostatins B 顯示出很強的抑制真菌的活性。 張弘弛等（2017）從黃芪內(nèi)生真菌青霉屬發(fā)酵液中分離到化 合 物 fumitremorgin B，verruculogen 和 cyclotryprostatins B， 還分離到其他5 個吲哚二酮哌嗪類生物堿，分別鑒定為tryprostatin B，tryprostatin A，cyclotryprostatin A，cyclotryprostatin C，cyclotryprostatins D。 所有吲哚二酮哌嗪對黃芪白粉病原菌都顯示出一定的抑制作用， 化合物cyclotryprostatins A 和cyclotryprostatins C 是 首 次 從恒山黃芪內(nèi)生真菌灰黃青霉的發(fā)酵液中分離到的， 被認為具有不同程度的抗腫瘤活性 （劉瑞，2016）。

3.2.3 fumiquinazoline 類 目前， 從黃芪內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到fumiquinazoline 類生物堿共7 個，劉瑞等（2016）從內(nèi)生真菌灰黃青霉的發(fā)酵液中分離得到fumiquinazoline D、fumiquinazoline J 和fumiquinazoline H；安志鵬等（2016）從曲霉屬發(fā)酵液中分離得到化合物fumiquinazoline D，fumiquinazoline J，fumiquinazoline H，fumiquinazoline I，fumiquinazoline C， fumiquinazoline B。 張宏馳等（2017）從黃芪根部真菌刀孢蠟蚧菌的發(fā)酵代謝物中分離到fumiquinazoline C 和fumiquinazoline A。fumiquinazoline D 和fumiquinazoline J 具 有 不 同程度的抗腫瘤活性，fumiquinazoline J 和fumiquinazoline H 具有抑制皮革霉變真菌的活性，fumiquinazoline I 和fumiquinazoline H 是 首 次 從植物內(nèi)生真菌中分離得到。

3.2.4 其他生物堿 張弘弛等（2017）從恒山黃芪根部的內(nèi)生真菌根霉屬發(fā)酵液中分離得到色胺酮tryptanthrin，曲菌酸（kojic acid），從黃芪內(nèi)生菌刀孢蠟蚧菌發(fā)酵代謝物中分離到尿囊素（allantoin），色胺酮是一種喹唑啉酮生物堿， 主要被用來治療刀傷、潰爛、蛇咬、痔瘡及各種炎癥，曲菌酸是一種黑色素專屬性抑制劑。

3.3 甾體類 周鳳等（2012）從恒山黃芪一株內(nèi)生真菌曲霉屬的發(fā)酵液中分離得到2 個甾體化合物啤酒甾醇（cerevisterol）和過氧化麥角甾醇（ergosterol peroxide） 。 劉瑞等（2016）從恒山黃芪內(nèi)生真菌灰黃青霉的發(fā)酵液中分離得到2 個甾體化合物為23-甲基麥角甾-7，22-二烯-3β，5α ，6α-三醇 （23-methylergosta-7，22-diene-3β，5α，6αtriol） 和5α，8α－表二氧麥角甾－6，9 （11），22－三烯－3β－醇（5α，8α-epidioxy-ergosta-6，9（11），22-trien-3β-ol）。 張宏馳等（2017）從刀孢蠟蚧菌的發(fā)酵代謝物中分離到2 個拮抗皮革霉變的甾體化合物， 分別是過氧化麥角甾醇和麥角甾醇（ergosterol）。劉瑞等（2019）從黃芪中內(nèi)生真菌黑曲霉發(fā)酵液中得到9 個甾醇類代謝產(chǎn)物化合物。 分別為啤酒甾醇、 過氧化麥角甾醇、23－甲基麥角甾－7，22－二烯－3β，5α，9α－三醇、5α，8α－表二氧麥角甾－6，9（11） ，22－三烯－3β－醇、麥角甾醇、膽固醇（cholesterol）、5α，8α－表二氧－23－甲基麥角甾－6，22－二烯－3β－醇 （5α，8α- epidioxo-23-methylergostane-6，22-dien-3β–ol）、 麥 角 甾－4，6，8（14），22－四烯－3－酮（ergostane-4，6，8 （14），22-tetraene-3-one）、3β，5α－二羥基麥角甾－7，22－二烯－6－酮 （3β，5α-dihydroxyergostane-7，22-dien-6-one）。此外，從黃芪根部的內(nèi)生真菌根霉屬發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了lawsaritol A（張弘弛，2017），在扁莖黃芪植株中同樣發(fā)現(xiàn)（薛利娟，2019）。 β-谷甾醇（β-sitosterol） 具有抗氧化和抗動脈粥樣硬化作用、抗炎和解熱活性、驅(qū)蟲和抗突變活性、免疫調(diào)節(jié)活性（Wang，2016）。

3.4 醌類 劉瑞等（2016）首次從恒山黃芪內(nèi)生真菌灰黃青霉、 根霉屬和刀孢蠟蚧菌 （張弘弛，2017） 的發(fā)酵液中分離得到醌類次生代謝產(chǎn)物monomethylsulochrin 和殺錐曲菌素素（trypacidin），從根霉屬中發(fā)現(xiàn)了蒽醌類大黃素-8-甲醚（emodin 8-O-methylether），殺錐曲菌素是一種特異殺菌劑， 黃素-8-甲醚對多種細菌均有抑制作用，對人體宮頸癌HeLa 細胞也有抑制作用。

3.5 肽類 張宏馳等（2017）從黃芪根部內(nèi)生真菌曲霉屬的固體發(fā)酵物中分離到8 個環(huán)二肽化合物，分別為環(huán)（脯-甘）二肽（cyclo-（Pro-Gly）），環(huán)（脯-亮）二肽（cyclo-（Pro-Leu）），環(huán)（脯-異亮）二肽（cyclo-（Pro-Ile）），環(huán)（脯-纈）二 肽（cyclo-（Pro-Val））， 環(huán) （苯丙-甘） 二肽 （cyclo-（Phe-Gly）），環(huán)（苯丙-丙）二肽（cyclo-（Phe-Ala）），環(huán)（苯丙-絡(luò)）二（cyclo-（Pro-Tyr））肽和環(huán)（苯丙-脯）二肽（cyclo-（Pro-Phe）），大部分環(huán)二肽化合物已被發(fā)現(xiàn)具有很好的生物活性。

3.6 內(nèi)酯類 張弘弛等（2017）從恒山黃芪根部的內(nèi)生真菌根霉屬固體發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了1 個內(nèi)酯類次生代謝產(chǎn)物cannabifolactone A。 cannabifolactone A 被發(fā)現(xiàn)可以作為流感病毒核酸內(nèi)切酶PAN 抑制劑（Wu，2002），張影珍等（2015）從真菌的發(fā)酵物中也分離得到。

4 總結(jié)

植物內(nèi)生菌及其代謝產(chǎn)物具有與植物化學成分相同活性的作用。研究表明，黃芪內(nèi)生菌具有種類豐富多樣的生物多樣性，黃芪根、莖、葉中內(nèi)生菌種類豐富多樣， 具有很好的研究和應(yīng)用價值。目前已分離鑒定出多株活性內(nèi)生菌， 內(nèi)生菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物主要包括生物堿、多肽類、甾體類、蒽醌類和內(nèi)酯類等化合物，而黃芪皂苷類、黃芪多糖類和黃芪黃酮類檢出較少，可能是黃芪來源、采摘時間、預(yù)處理等多種干擾因素造成（馬偉，2012）。 研究表明， 黃芪內(nèi)生菌具有與植物成分相似藥理作用，具有抑菌殺菌、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤的抗炎等作用，有望成為各種疾病綜合防治的備選資源。近年來，隨著藥用植物內(nèi)生菌活性成分的挖掘，中草藥內(nèi)生菌的研究逐漸增多，例如黃精、石斛、天麻、艾蒿、白芨、鬼針草、竹節(jié)參等內(nèi)生菌都有一定研究，但部分藥材內(nèi)生菌研究較少，尚處于起步階段，內(nèi)生菌活性利用欠佳，藥用植物內(nèi)生菌具有很好的開發(fā)運用價值， 其更多活性作用丞待進一步研究。 本文對黃芪內(nèi)生菌多樣性及其次生代謝產(chǎn)物進行綜述，以期為藥材進一步研究提供思考，為后續(xù)實驗指明方向， 建議可從內(nèi)生菌次生代謝方面著手， 為更多藥用植物內(nèi)生菌的開發(fā)利用提供線索，以內(nèi)生菌作為新的活性資源，在一定程度上為解決臨床藥物來源以及農(nóng)作物的生物綜合防治等提供新的思路。